Učinkovitost i mehanizam ekstrakta Herba Cistanches u liječenju reproduktivne disfunkcije kod štakora s nedostatkom bubrega-yang na temelju metabolomike

SažetakOva studija istražujereproduktivni zaštitni učinakiPotencijalni mehanizam ekstrakta CIStanches Herba(Che) na modelu štakoraManjak bubrega-yanginduciran adeninom. Štakori su nasumično podijeljeni u pet skupina: normalan, model, CHE s malim dozama ({0. 6 g · kg -1 · d -1), visoke doze CHE (1,2 g · kg {8}} {{{9}) (l {}) mg · kg -1 · d -1). Štakori su primijenjeni adenin (200 mg · kg -1 · d -1) od strane prvih 14 dana kako bi se izazvao nedostatak bubrega Yang, istovremeno primanje liječenja lijekovima. Nakon 14 dana, modeliranje je prekinuto, ali liječenje lijekovima nastavilo se 49 dana. Sadržaj komponenti u CHE analiziran je tekućom kromatografijom visokih performansi (HPLC). Model nedostatka bubrega-Yang izazvan adeninom procijenjen je karakterizacijom simptoma i mjerenjem razine testosterona (T) koristeći komplet imunosorbentnog ispitivanja (ELISA) vezanog za enzim. Patološko oštećenje testisa i epididimis ocijenjeno je na temelju vlažne težine i obavljanja bojenja hematoksilinom-eozinom (HE). Gustoća sperme i pokretljivost izmjereni su korištenjem računalne analize sperme (CASA), a održivost sperme procijenjena je korištenjem kompleta za bojenje sperme uživo/mrtve sperme, a morfologija sperme procijenjena je korištenjem bojenja eozinom, čime se određuje kvaliteta sperme štakora. Metabolomi CS korišten je za analizu promjena u metabolitima u serumu, obogaćivanje metaboličkih puteva povezanih s i istraživanje mehanizma CHE -a u poboljšanju oštećenja reproduktivne funkcije kod štakorasindrom nedostatka bubrega-yang. U usporedbi s normalnom skupinom, grupa modela pokazala je značajnoSimptomi nedostatka bubrega-yang, smanjene razine T, smanjene težine testisa i epididimmalne vlažne težine i značajna patološka oštećenja testisa i epididimisa. Gustoća sperme, pokretljivost i održivost, s povećanom stopom spermata. Suprotno tome, štakori liječeni CHE pokazali su značajna poboljšanja simptoma nedostatka bubrega-yang, obnovljene razine T, ublažili patološko oštećenje testisa i epididimisa i poboljšali različite parametre sperme. Rezultati metabolomije otkrili su 286 diferencijalnih metabolita između normalne i modelne skupine (191 regulirano i 95 smanjenih). Sedamdeset i pet diferencijalnih metabolita identificirano je između modela i CHE skupina s malim dozama (21 regulirano i 54 smanjena). Ukupno je utvrđeno 24 uobičajena diferencijalna metabolita u tri skupine, pri čemu su 22 od tih metabolita pokazala suprotne trendove regulacije između dvije usporedne skupine. Ti su metaboliti bili prvenstveno uključeni u metabolizam linoleinske kiseline, metabolizam etera lipida, te pantotenu kiselinu i koenzim biosintezu, kao i metabolite, uključujući 13- hidroperoksilinolnu kiselinu (13- i ppOde), LysophoshospAtAtHes CHE može poboljšati simptome nedostatka bubrega-yang kod štakora, ublažiti oštećenje reproduktivnih organa i poboljšati kvalitetu sperme. Regulacija metabolizma lipida može biti potencijalni mehanizam kroz koji CHE poboljšava reproduktivnu funkciju kod štakoraManjak bubrega-yang. Potencijalni bioaktivni spojevi Che uključujuehinakozid, verbaskosid, Salidroside, Betain i Cistanoside A.

 

Ključne riječi Cistanches Herba ekstrakt; Manjak bubrega-yang; oligastenospermia; adenin; metabolom; lipidni metabolizam

 

 

Kupci putujuO Cistancheu za poboljšanje reproduktivne funkcije

 

 

 

Sindrom nedostatka bubrega Yangje vrsta sindroma hladnog nedostatka uzrokovana nedostatkom bubrega Yang, neuspjehom funkcije zagrijavanja i neuspjehom Qi transformacije. Moderna medicina vjeruje da je to metabolička bolest uzrokovana neuroendokrinim poremećajima, uključujući osi hipotalamičke-hipofize-gonadal (HPG). Klinički muški pacijenti obično pokazuju simptome poput smanjenog libida, niskog volumena sjemena, niske pokretljivosti sperme i bolova u donjem dijelu leđa. Teški simptomi mogu dovesti do neplodnosti i urođenih oštećenja [1]. Zagrijavanje bubrega Yang temeljna je metoda liječenja tradicionalne kineske medicine za mušku neplodnost uzrokovanu nedostatkom bubrega Yang [2]. Cistanche Deserticola je sušena mesnata stabljika s ljuskavim lišćem biljke Cistanche Deserticola Ycma iz obitelji Orobanchaceae. To ima učinak tonificiranja bubrega Yang -a i koristi Essence i Krv. Često se koristi za liječenje nedostatka bubrega, impotencije i neplodnosti [3]. Prema statistikama, Cistanche Deserticola je također najčešće korišteni lijek u receptima za tonificiranje bubrega i jang-jašljivim receptima tijekom dobi [4]. Suvremene farmakološke studije potvrdile su da ekstrakti kao što su ukupni glikozidi i oligosaharidi Cistanche desetikole mogu regulirati homeostazu osi HPG i osi hipotalamus-pituita-hipofiza-nadbubrežne nadlaske u štakorima s nedostatkom bubrega [5]. Ekstrakt Cistanche Deserticola također može poboljšati spermatogenezu i seksualnu disfunkciju kod štakora s nedostatkom bubrega Yang [6-7]. Međutim, potencijalni mehanizmi ovih terapijskih učinaka nisu dubinski istraženi. Metabolomika dinamički kombinira promjene metabolita s biološkim procesima na cjelokupni način, otkrivajući metaboličku prirodu fizioloških i bolesnih procesa i farmakodinamičke mehanizme lijekova. Ova holistička i dinamična karakteristika u skladu je s konceptom tradicionalne kineske medicine [8]. Stoga je ova studija koristila tehnologiju metabolomije kako bi istražila učinkovitost i mehanizam ekstrakta Cistanche desetikole na oštećenju reproduktivne funkcije kod štakora s nedostatkom bubrega Yang uzrokovanog adeninom i za objašnjenje moderne znanstvene konotacije Cistanche Deserticola u tonificiranom bubrežnom Yang -u.

1 materijal

1.1 Životinje

50 SPF ocjena 9- Tjedni muški SD SD štakori, vaganje 330-340 g, kupljeni su od Beijing Huafukang Biotechnology Co., Ltd., broja licence SCXK (Beijing) 2019-0008. Životinje su čuvane u SPF -ovoj sobi za životinje eksperimentalnog centra za životinje Instituta za kinesku Materia Medica, Kineska akademija kineskih medicinskih znanosti, s prirodnom cirkadijanskom rasvjetom, stalnom vlažnom vlagom i temperaturom te slobodnom prehranom i aktivnostima. Eksperiment na životinjama prošao je etički pregled eksperimentalne dobrobiti životinja Instituta za kinesku Materia Medica, Kineska akademija kineskih medicinskih znanosti (broj etičkog odobrenja 2021B166).

 

1.2 droge

Kriške pustinjske pustinje kupljene su od Pekinga Tongrentanga (trgovina Chongwenmen), serije broj 1806016, a identificirao ih je Zhu Jingjing, istraživač na Institutu kineske Materia Medica, Kineska akademija kineskih medicinskih znanosti. Odmjerite 500 g Cistanche Deserticola i dodajte
10 puta veća od 70% etanola do refluksa ekstrakta tijekom 2,5 sata, filtrirajte, dodajte 8 puta više od 70% etanola u ostatak i refluksni ekstrakt 2,5 h, filtrirajte, kombinirajte dva filtrata i smanjite pritisak da bi se kombinirani ekstrakt osušio u prah. Prinos suhog praha je 47%, a spremite ga u suho stanje.

1.3 reagensi

Ehinakozid, verbascoside, salidroside, betaine, cistancheside a, tubulozid a i kofeinska kiselina kupljeni su od Chengdu gelipu Biotehnologije Co., Ltd., s brojevima za pakete {}}, JOT {}, JOT {}, JOT {}} {}} {}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}} {}}} Jot -11356, Jot11627 i Jot -10196, respektivno; Kromatografski acetonitril, metanol kromatografskog stupnja i analitička fosforna kiselina kupljeni su od Chengdu Zhongjinlong Technology Development Co., Ltd., s serijskim brojevima Sigma-WXBF1922V, Sigma-WXBFF2452V i 20240220, u odnosu na 20240220; Adenine je kupljena od Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., sa serijama S18009; L-karnitin (LC) kupljen je od Shenyang br. 1 Pharmaceutical Co., Ltd., sa serijskim brojem 210372;
Calcein/PI stanična aktivnost i setovi za otkrivanje citotoksičnosti kupljeni su od Beijing Biolab Technology Co., Ltd., serijski broj HR0444; Testosteron (T) Enzim-povezan imunosorbentni test (ELISA) komplet kupljen je od Wuhan Elaruite Biotechnology Co., Ltd., serije E-EL -0155 C; Voda amonijaka kupljena je od Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., serija broj 10002108; Rješenje bojenja hematoksilin-eosin (HE) kupljeno je od Beking Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd., serije BSBA -4025.

 

2.2 Analiza kemijskih komponenti ekstrakta Cistanche Deserticola

2.2.1 Priprema rješenja referentnih zaliha

Točno težite 10,41 mg salidrozida, 11.19 mg ehinakozida, 10. 86 mg Cistancheside a, 10,19 mg tubulozida A, 10,28 mg dilascosida, a 10,67 mg do 50 mg, dodajte u 25 ML volUmet dobiti.

 

2.2.2 Priprema miješane referentne otopine

Upravo pipeta 1 ml referentne otopine zaliha salidrozid, 5 ml ehinakozida, 2 ml cistancheside a, 100 μl tubulozida A, 350 μl verberaskozida i 100 μl kofeinske kiseline u isto 25 MLLUMETRICIJSKIH FALKIRSKIH FASKIRA. Precizno odmjerite 12,24 mg betaina u volumetrijsku tikvicu od 10 ml, dodajte 50% metanola da se otopi i razrijedi u oznaku, dobro protrese i dobijete referentnu otopinu betaina.

2.2.3 Priprema testne otopine

Precizno odmjerite 310,14 mg ispitnog uzorka u volumetrijsku tikvicu od 25 ml, dodajte vodu da se otopi i razrijedite u oznaku, dobro protrese i filtrirate.

 

2.2.4 Kromatografski uvjeti
Metoda otkrivanja betaina: stupac Xamide (4,6 mm × 250 mm, 5 µM); Mobilna faza acetonitril-voda (80:20); Temperatura stupca 30 stupnjeva; Brzina protoka 1 ml · min -1; Volumen ubrizgavanja 10 μl.
Ostali uvjeti otkrivanja komponenata: Kromasil 100-5- C18 stupac (4,6 mm × 250 mm, 5 µM); Mobilna faza acetonitril (a)

i {{0}}. 1% otopina fosforne kiseline (b); Temperatura stupca 30 stupnjeva; Brzina protoka 1 ml · min -1; Volumen ubrizgavanja 10 μl, gradijentna elucija (0 ~ 10 min, 10%a; 10 ~ 20 min, 10%~ 15%a; 20 ~ 25 min, 15%a; 25 ~ 40 min, 15%~ 22%a).

 

2.3 Otkrivanje indeksa

2.3.1 Dinamički parametri epididimmalne sperme

Abdominalna šupljina štakora secirana je kako bi se izložio lijevi epididimis. Lijevi epididiminski rep brzo je odsječen i stavljen u 2 ml fenol-crvenog medija za kulturu DMEM-a, prethodno zagrijanog u vodenoj kupelji od 37 stupnjeva. Izrezana je na komade s oftalmičkim škarama, lagano se uzdrmala i smještena u vodenu kupelji od 37 stupnjeva za inkubaciju 10 minuta kako bi se svi spermatoli na plivanje iz epididimisa i pripremili ovjes sperme. 10 μl suspenzije sperme spušteno je na klizaču za brojanje sperme, a tehnika CASA korištena je za promatranje i bilježenje gustoće sperme, prosječne brzine puta (VAP), krivuljaste brzine (VCL), linearne (LIN), miješanja (WOB), ravne (STR) i križanja (BCF).

 

2.3.2 Pokrelnost sperme i stopa deformiteta

Pipeta 20 μl svježe pripremljene ovjesa sperme u unaprijed pripremljeni propidium jodid (PI) (razrijeđen 3 000 puta) i Calcein-AM (razrijeđeni 200 puta) otopinu za miješano obojenje, inkubiraju se u vodenoj kupelji od 37 stupnjeva u vodenoj kupelji od 37 stupnjeva i promatrajte pod fluorescentnim mikroskopom. Brojite ukupni broj preživjelih sperme i prijelazne sperme u svakih 200 sperme u različitim vidnim poljima. Živa sperma: glava sperme, tijelo i rep svi su zeleni fluorescentni, a aktivnost sperme može se vidjeti pod mikroskopom. Prijelazna sperma: Glava sperme je crvena fluorescentna, a tijelo je očito zeleno fluorescentno. U ovom trenutku, sperma je u prijelaznom razdoblju smrti. Mrtva sperma: Samo glava sperme je crvena fluorescentna, a cijelo tijelo nema zelenu fluorescenciju.
Uzmite 100 μl suspenzije sperme i stavite je u vodenu kupelj od 60 stupnjeva za inaktivaciju na 10 minuta, a zatim povucite 5 μl i ispustite je na tobogan, raširite ga ravnomjerno i osušite, popravite ga metanolom, obojite ga eozinom bojom, ispratite tekućom vodom, ostavite da je i osušite s ksilenom i zapečate na it i ipera. Brojite broj nenormalnih spermija u svakih 200 sperme u različitim poljima pod mikroskopom i izračunajte omjer.

 

2.3.3 Patološko bojenje epididimisa i testisa

Nakon fiksacije u 4% paraformaldehida na sobnoj temperaturi 48 sati, tkiva epididimisa i testisa stavljena su u kutije za ugradnju, dehidrirane s stupnjevanim etanolom, ugrađene u parafin i narezani. Nakon dewaksiranja i hidratacije, provedeno je bojenje, a patološke promjene tkiva testisa i epididimisa primijećene su pod optičkim mikroskopom kako bi se odredio stupanj lezija u strukturi tubula za semizine, lezije u epididimijskom lumenu i gustoće sperme.

 

2.3.4 Sadržaj seruma t

Nakon prikupljanja orbitalne krvi, ostavljen je na sobnoj temperaturi 2,5 sata, centrifugiran na 3 000 r · min -1 20 minuta, a supernatant je uzet za otkrivanje razine seruma T prema uputama T kompleta.

 

2.4 Analiza metabolomije

2.4.1 Priprema uzorka u serumu

Na dan uzorkovanja, štakori su anestezirani, a cijela krv je sakupljena kroz trbušnu aortu. Krv je zadržana na sobnoj temperaturi 2,5 h i centrifugirana na 3 000 r · min -1 za 2 0 min. Supernatant je podijeljen u 2 ml epruvete za centrifugu s odgovarajućim brojevima i pohranjen na -80 stupnju. Thaw na 4 stupnja prije ispitivanja, Vortex miješa uzorke, precizno prenosi 5 0 μl uzoraka seruma u 0,5 ml EP epruvete, dodajte 300 µl 20% acetonitril-metanol unutarnjeg standarda, vrtložen, a zatim središnji min, {15} {} {} {} {{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{ @ Supernatant i stavite ga u drugu čistu cijev od 0,5 ml EP, neka stoji na {-20 stupanj 30 minuta, a zatim centrifugira na 4 stupnja, 12 000 r · min -1 u trajanju od 180 μl Supernatanta za injekciju.

 

2.4.2 Kromatografski uvjeti

Vode Acquity Uplc HSS T3 C18 stupac (2,1 mm × 1 0 0 mm, 1,8 µm). Mobilne faze bile su {0. 1% mravlje kiseline u vodi (a) i 0,1% otopine mravlje kiseline-acetonitrila (b), s elucijom gradijenta ({0-11 min, 5% {{14} {{{15}, 90% b;}, 90% b;}, 90% b; 12. 1-14 min, 5% b). Temperatura stupca bila je 40 stupnjeva, a brzina protoka 0,40 ml · min -1.

 

2.4.3 Uvjeti masene spektrometrije

Izvor iona elektrosprata skeniran je u pozitivnim i negativnim načinima iona. Plin za raspršivanje bio je 50 psi (1 PSI≈6,895 kPa), pomoćni grijaći plin bio je 60 psi, plin zavjesa bio je 35 psi, a temperatura iona iz izvora bila 550 stupnjeva. In positive ion mode, the ionization voltage was 5 500 V, the high sensitivity mode was adopted, the declustering voltage was 60 V, and the collision energy was 30 V. In negative ion mode, the ionization voltage was -4 500 V, the declustering voltage was -60 V, and the collision energy was -30 V. The high sensitivity Prihvaćen je način skeniranja polukvantitativnih podataka.

 

2.4.4 Obrada i analiza podataka

Sirovi podaci LC-MS detekcije pretvoreni su u MZML format softverom ProteoWizard, a softverski paket XCMS korišten je za korekciju najveće ekstrakcije, poravnanja i zadržavanja. Analiza podrške vektora regresije (SVR) korištena je za ispravljanje područja vrha, a vrhovi s nedostatkom brzine veće od 5 0% su filtrirani. Vrhovi nakon probira integrirani su u javnu biblioteku, bazu podataka koju je sagradio Wuhan Metwell Biotechnology Co., Ltd., i algoritam metDNA za identificiranje strukturnih informacija metabolita. Nakon toga, R paket je korišten za izvođenje univarijantne statističke analize i multivarijantne statističke analize pomoću studentske metode t-testa i pravokutne djelomične najmanje kvadrate diskriminirajuće analize (OPLS-DA). Uvjeti probira diferencijalnog metabolita postavljeni su na promjenjivu važnost u projekciji (VIP)> 1, dvostrani test P <0. i dobiveni CPD _ ID unosi se na web stranicu Metabo Analyst 6.0
(https://www.metaboanalyst.ca/) za analizu obogaćivanja. P iz hipergeometrijskog testa korišten je za identificiranje ključnih putova sa značajnim obogaćivanjem.

 

2.5 Statistička analiza

𝑥̅ ± s izražena je kao srednja ± standardna devijacija (𝑥̅ ± s), a jednosmjerna analiza varijance korištena je za usporedbu podataka među više skupina. P<0.05 was considered statistically significant.