Učinci glieozida Cistanche na učenje kognicije i sinaptičku plastičnost kod štakora modela deprivacije sna

SAŽETAK

Cilj: Istražiti je liglikozidi cistanhemože poboljšatiučenje i kognitivna funkcija deprivacije snamodel štakora poreguliranje sinaptičke plastičnosti. Metode: Pedeset mužjaka Wistar štakora nasumično je podijeljeno u praznu kontrolnu skupinu (kontrola), kontrolnu skupinu platforme (PC), skupinu modela (model),glikozidi cistančne skupine(GCs), i skupina estazolama (Est). Model deprivacije sna kod štakora pripremljen je modificiranom metodom vodenog okoliša s više platformi. Morrisov vodeni labirint i test na otvorenom korišteni su za otkrivanje štakora.prostorna kognitivna funkcija ai emocionalne promjene. Za promatranje promjena upotrijebljeno je bojenje po Nisslumorfologija i količina živčanih stanicau CAl području hipokampusa štakora. Western blot i R'T - PCl korišteni su za otkrivanje razina ekspresije sinaptofizina (SYN), guste tvari postsinaptičke membrane 95 (PSD - 95) i neurotrofičnog faktora izvedenog iz mozga (BDNF). Rezultati: Morrisovi rezultati vodenog labirinta pokazali su da u usporedbi s kontrolnom skupinom,sposobnost učenja i kognitivne sposobnostištakora u modelnoj skupini značajno je smanjen (P<0. 05 ), and theučenje i funkcija pamćenja štakorapoboljšano je liječenje GC-om (P<0. 05). The results of the open field test showed that compared with the Control group, the movement distance and standing times of the Model group were significantly increased ( P <0. 05 ), the resting time was significantly shortened( P <0.05), and the anxiety was increased, while after GCs treatment, the movement distance and standing times decreased ( P <0. 05), the resting time increased ( P<0. 05), and the anxiety was improved. The results of Western blot and R'T' - PCR showed that the protein and gene expression levels of BDNF, SYN, and PSD -95 in the Model group were significantly decreased ( P <0. 05), while after treatment with GCs, the expression levels of BDNF, SYN and PSD -95 were significantly up-regulated ( P <0.05).

Zaključak: Glikozidi cistanhemogu utjecati na sinaptičku plastičnost reguliranjem ekspresije sinaptičkih markera, čime poboljšavaju učenje i kognitivnu funkciju štakora modela deprivacije sna.

KLJUČNE RIJEČIGlikozidi cistanhe; Hipokampus; Nedostatak sna; Učenje i pamćenje; Anksioznost; Sinaptička plastičnost

PRODAJA VISOKIH GLIKOZIDA CISTANCHE

Poremećaj spavanja (SD)je afunkcionalni poremećaj snauzrokovan nizom složenih čimbenika kao što su nesanica, česti snovi i lako buđenje. Učestalost SD postupno raste posljednjih godina. Povezane studije su izvijestile da SD može uzrokovatikardiovaskularne bolesti, metabolička disfunkcija, imunološke bolesti, i degenerativne bolesti središnjeg živčanog sustava kao što je Alzheimerova bolest [1]. SD može uzrokovati oksidativno oštećenje neurona hipokampusa, uzrokovati kognitivnu disfunkciju i izazvati promjene raspoloženja kao što su anksioznost i depresija [2]. Cistanche deserticola je dragocjeni kineski ljekoviti materijal koji se može koristiti kao lijek i hrana. Ima učinke toniziranja bubrega i obnavljanja qija, vlaži crijeva pospješujući rad crijeva i jačajući yang. Glavni ekstrakt Cistanche deserticola, glikozidi cistanhe (GCs), ima antioksidativno, antiapoptotičko djelovanje, zaštitu jetre i neuroprotektivno djelovanje [3]. Naše prethodno istraživanje pokazalo je da GC mogu poboljšati učenje i kognitivnu funkciju SAMP8 miševa igrajući antioksidativnu i antiapoptotičku ulogu [4]. Povezane studije pokazale su da je kognitivna disfunkcija uzrokovana SD-om usko povezana sa sinaptičkom plastičnošću [5]. Međutim, malo je izvješća o mehanizmu kojim GC reguliraju sinaptičku plastičnost i poboljšavaju učenje i oštećenje pamćenja te kognitivno opadanje kod štakora izazvano deprivacijom sna. Stoga, ova studija ima za cilj istražiti utječu li GC-i na sinaptičku plastičnost reguliranjem ekspresije sinaptičkih markera, poboljšavajući tako učenje i kognitivnu funkciju štakora u modelu deprivacije sna, te pružajući nove ideje za liječenje i planove za liječenje učenja i kognitivno oštećenje uzrokovano poremećajima spavanja s GC.

1 Materijali i metode

1. 1 Pokusne životinje

Muški Wistar štakori stari 6 do 8 tjedana, težine 280 do 300 g, kupljeni su od Beijing Sibeifu, s dozvolom za životinjsku proizvodnju [SCXK (Beijing) 2019-0010]. Sve su životinje držane u Centru za pokuse na životinjama Medicinskog fakulteta Baotou pod sljedećim uvjetima: temperatura (24 ± 1) stupanj, vlažnost 50% do 55%, 12 sati svjetla i 12 sati mraka, i bez ograničenja u hrani i vodi. Ovaj eksperiment je odobrilo školsko etičko povjerenstvo [Baoyi Lunshen 2022 br. (63)].

1. 2 Glavni reagensi i instrumenti

Ukupni glikozidi Cistanche deserticola kupljeni su od Shaanxi Baoji Cosmeceuticals Development Co., Ltd. (broj serije: KSM20220609011); Estazolam tablete su kupljene od CSPC Pharmaceutical Group Ouyi Pharmaceutical (broj serije: 044220343); pufer za punjenje proteina (P1015), pufer za lizu RIPA (R0010), kemiluminiscentna otopina (PE0010), itd. svi su kupljeni od Beijing Solebao; antitijelo tvari postsinaptičke gustoće 95 (PSD-95) (AB192757), antitijelo sinaptofizina (SYN) (ab32127), kupljeno od Abcam, SAD; neurotrofni faktor izveden iz mozga (BDNF) (48503-2), -aktin (52901), nabavljen od SAB, SAD; kozje anti-zečje IgG sekundarno protutijelo (SA00001-20), kupljeno od Proteintecha, SAD; štakorski melatonin (MT), ELISA komplet (MM-0657R1), kupljen od Jiangsu Enzyme Immunity Industry Co., Ltd. Parafinski rezač (Leica, Njemačka); optički mikroskop (Leica, Njemačka); Morrisov vodeni labirint, testna kutija na otvorenom (Shanghai Xinruan); instrument za vertikalnu elektroforezu

(Beijing Liuyi Company); tresilica za dekolorizaciju (Beijing Liuyi Company); sustav za analizu proteinskih slika (Shanghai Tanon Technology); fluorescentni kvantitativni PCR instrument (Xi'an Tianlong Technology Co., Ltd.).

1. 3 Eksperimentalne metode

1. 3. 1 Grupiranje životinja i primjena lijeka

50 mužjaka Wistar štakora nasumično je podijeljeno u skupinu prazne kontrolne skupine (kontrolna skupina), kontrolnu skupinu na platformi (kontrolna skupina s platformom, PC skupina), skupinu modela (skupina modela), skupinu ukupnih glikozida Cistanche deserticola (GCs skupina , 50 mg/kg), i skupina estazola (Est skupina, 0,54 mg/kg), s 10 štakora u svakoj skupini. Kontrolna skupina i PC skupina dobile su 0,9% fiziološku otopinu sondom. Sve skupine su bile sondirane u 7 ujutro svaki dan nakon početka modeliranja, a gavaža je trajala 21 dan.

1. 3. 2. Priprema životinjskog modela deprivacije sna

Model deprivacije sna uspostavljen je korištenjem modificirane metode vodenog okruženja s više platformi [6]. Eksperimentalna oprema bila je pravokutni spremnik za vodu od polietilenske smole dimenzija 130 cm × 50 cm × 45 cm. U spremnik za vodu postavljena je mala platforma promjera 5 cm i visine 20 cm. Platforma grupe PC imala je promjer 10 cm i visinu 20 cm. Spremnik za vodu je napunjen vodom do dubine od oko 18 cm, a temperatura vode je održavana na (20 ± 1) stupnjeva. Tjedan dana prije početka eksperimenta štakori su svaki dan 60 minuta stavljani u kutiju za deprivaciju sna kako bi se upoznali s okolinom. Nakon što je model uspostavljen, osim za kontrolnu skupinu, štakori svake skupine su stavljeni na malu platformu na vrijeme od 8 do 20 sati svaki dan radi deprivacije sna tijekom 21 uzastopnog dana. Svim štakorima bilo je dopušteno slobodno jesti i piti i slobodno se kretati po platformi, uz 12 sati izmjene svjetla i mraka svaki dan.

1.3.3 Morrisov eksperiment vodenog labirinta

Morrisov vodeni labirint podijeljen je u 4 područja, ispunjena vodom, a platforma je postavljena u 4. kvadrant. Vodena površina bila je oko 2 cm iznad platforme. U vodu je dodan jestivi melanin koji je pogodan za hranu, a temperatura vode je održavana na (25 ± 1) stupnjeva. (1) Eksperiment navigacije pozicioniranja: Odabrano je središte svakog područja i štakori su nježno stavljeni u vodu. Bilo im je dopušteno slobodno istraživati. Zabilježeno je vrijeme koje je štakorima trebalo da pronađu ciljnu platformu unutar 60 sekundi. Štakori koji nisu pronašli platformu su vođeni do platforme i ostali su 20 sekundi. Obuka je nastavljena 5 dana. (2) Test prostornog istraživanja: 6. dana platforma je uklonjena i štakori su stavljeni u vodu od središta 2. kvadranta prema zidu. Zabilježeno je koliko su puta štakori prošli platformu unutar 120 s i koliko su puta ostali u 4. kvadrantu.

1.3. 4 Pokus na otvorenom polju

Korištena je eksperimentalna kutija dimenzija 100 cm × 100 cm × 50 cm, a dno kutije podijeljeno je na 9 mreža. Svaka grupa štakora je unaprijed smještena u pokusnu sobu na otvorenom kako bi se prilagodila unutarnjem okruženju na 60 minuta. Na početku eksperimenta, pokusni štakori su naizmjenično postavljeni u fiksne kutove eksperimentalne kutije na otvorenom, a broj vremena stajanja, udaljenost kretanja i statičko vrijeme štakora unutar 5 minuta zabilježeni su pomoću softvera za analizu ponašanja . Okruženje je moralo biti tiho tijekom eksperimenta, a eksperimentalni uređaj je obrisan čistom vodom i alkoholom između dva eksperimenta kako bi se izbjeglo da miris prethodnog štakora utječe na procjenu ponašanja sljedećeg štakora.

1. 3. 5 Enzimski imunološki test (ELISA)

Detekcija serumskih razina MT u štakora Štakori su anestezirani intraperitonealnom injekcijom, a 5 mL krvi je sakupljeno iz abdominalne aorte. Nakon čekanja od 30 minuta na sobnoj temperaturi, krv je centrifugirana da se dobije serum. U svaku jažicu dodano je 40 μL razrjeđivača uzorka, a zatim je dodano 10 μL uzorka koji se ispituje. Nakon zatvaranja filmom za brtvljenje, inkubirajte na 37 stupnjeva 30 minuta. Isperite 5 puta, dodajte 50 μL otopine za označavanje enzima i inkubirajte na 37 stupnjeva 30 minuta nakon zatvaranja filmom za brtvljenje. Operite 5 puta, zatim redom dodajte otopinu za razvijanje boje i otopinu za zaustavljanje reakcije. OD vrijednost svake jažice izmjerena je instrumentom za označavanje enzima na valnoj duljini od 450 nm.

１. ３. ６ Bojenje po Nisslu

Iz svake skupine uzeta su tri štakora, a tkivo mozga je uklonjeno dekapitacijom. Tkivo mozga je fiksirano s 4% otopinom polimetil metakrilata, tkivo je dehidrirano, uronjeno u otopinu voska i ugrađeno, a tkivo je izrezano konvencionalnim metodama. Kriške su držane debljine 5 μm, isprane PBS-om, obojene 0. 1% toluidin plavo za 0. 5 h, diferenciran s 95%-tnim alkoholom, dehidriran s 100%-tnim alkoholom, transparentiziran s ksilenom i zapečaćen s neutralnom gumom. Promjene u morfologiji i broju neurona u CA1 regiji hipokampusa štakora promatrane su pod mikroskopom i prikupljene su slike.

１. ３. 7 Western blot eksperiment

Četiri štakora su odabrana iz svake skupine, a hipokampus je izoliran dekapitacijom. Tkivo hipokampusa pomiješano je s RIP A puferom za lizu u ledenoj kupelji i centrifugirano da se dobije supernatant. Koncentracija proteina određena je BCA metodom. Dodano je 20 ug proteina s puferom za punjenje proteina za elektroforezu. Nakon završetka elektroforeze proteina, membrana je prebačena pri konstantnom protoku od 300 mA, blokirana s 5% obranim mlijekom u prahu, primarno antitijelo je inkubirano na 4 stupnja preko noći, a sekundarno antitijelo je inkubirano na sobnoj temperaturi 2 sata. Nakon što je korištena otopina za razvijanje boje, korišten je sustav za analizu kemiluminiscencije slike za statističku analizu proteinskih vrpci.

1. 3. 8 RT-PCR pokus

Tri štakora su odabrana iz svake skupine za pripremu homogenata tkiva hipokampusa. Ukupna RNA iz tkivne tekućine ekstrahirana je Trizol metodom i izmjerena koncentracija. Komplet za sintezu cDNA natašte korišten je za obrnutu transkripciju, a reakcija kvantitativnog pojačanja fluorescencije korištena je za otkrivanje relativne razine ekspresije proteinske mRNA povezane sa sinaptikom korištenjem kvantitativnog kompleta fluorescencije. Rezultati su analizirani pomoću 2-ΔΔCt, a sekvence primera prikazane su u tablici 1.

1.4 Statističke metode

Rezultati podataka koji su bili u skladu s normalnom distribucijom izraženi su kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (x ± s), a statistička analiza provedena je pomoću softvera GraphPad Prism 9.5. Jednofaktorska analiza varijance korištena je za usporedbu između više uzoraka, a P < 0.05 ukazuje da je razlika statistički značajna.