Učinci flavonoida na kožu prema njihovim strukturnim karakteristikama: pregled

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

Sažetak:Pozadina: Tijekom infarkta miokarda (MI) izgubljene su milijarde kardiomiocita. Optimalna terapija trebala bi učinkovito nadomjestiti oštećene kardiomiocite, po mogućnosti matičnim stanicama koje se mogu usaditi i diferencirati u odrasle funkcionalne kardiomiocite. Kao takve, matične stanice apendiksa srčanog atrija (CASC) prikladni su kandidati. Međutim, prisutnost povišenih razina krajnjih produkata uznapredovale glikacije (AGEs) u srčanim regijama gdje su transplantirani CASCs može utjecati na njihov regenerativni potencijal. U ovoj studiji ispitujemo da li i kako AGEs mijenjaju svojstva CASC in vitro. Metode i rezultati: CASC u kulturi bili su izloženi rasponu koncentracija AGEs (50 ug/mL do 400 ug/mL). Preživljavanje, proliferacija i sposobnost migracije CASC značajno su smanjeni nakon 72 h izloženosti AGEs. Apoptoza se značajno povećala s porastom koncentracije AGE-a. Štetni učinci ovih AGE-a djelomično su prigušeni prethodnom inkubacijom s receptorom za AGE-e （RAGE） inhibitorom （25 μM FPS-ZM1）, što ukazuje na uključenost RAGE-a u opažene negativne učinke. Zaključak: AGE imaju negativan učinak ovisan o vremenu i koncentraciji na preživljavanje, proliferaciju, migraciju i apoptozu CASC in vitro, djelomično posredovano aktivacijom RAGE. Jesu li anti-AGE terapije učinkovit tretman u kontekstu terapije matičnim stanicama nakon MI zahtijeva daljnje ispitivanje.

Ključne riječi:Matične stanice; aldehid dehidrogenaza; CASC-ovi; glikirani proteini; završni proizvodi napredne glikacije; proliferacija; apoptoza; migracija; BIJES inhibicija

1. Uvod

Koronarna bolest srca (CHD) ostaje vodeći uzrok mortaliteta i morbiditeta u cijelom svijetu, s infarktom miokarda (MI) kao najčešćim oblikom CHD [1]. MI nastaje kao posljedica potpune ili djelomične okluzije koronarne arterije. U ishemijskom području ograničeni su kisik i hranjive tvari, što dovodi do smrti stanica miokarda. Veličina infarkta ovisi o više čimbenika, kao što je veličina rizičnog područja ishemije, mjesto i trajanje koronarne okluzije i količina zaostalog kolateralnog krvotoka [1,2]. Kako odrasli kardiomiociti imaju minimalna regenerativna svojstva, intrinzički popravak oštećenog tkiva ostaje nedostižan. Pronalaženje terapeutskog pristupa koji učinkovito zamjenjuje miokardijalni ožiljak funkcionalnim kontraktilnim tkivom jedina je opcija za oporavak izgubljenog srčanog tkiva.koliko cistanche uzetiMnogo je istraživačkog napora uloženo u otkrivanje terapeutskog potencijala i mehanizama stanične terapije stanicama koštane srži (BMC). Koštana srž sadrži hematopoetske matične stanice (HSC), endotelne progenitorske stanice (EPC) i mezenhimalne matične stanice (MSC)[3]. Klinička ispitivanja s mononuklearnim BMC-ima i MSC-ima nisu uspjela dovesti do značajnih poboljšanja u postinfarktnoj funkciji srca. Budući da se mononuklearni BMC-i i MSC-i ne diferenciraju u kardiomiocite, ograničena uočena poboljšanja vjerojatno se mogu pripisati parakrinim mehanizmima [4,5]. Kako bi se značajno poboljšala srčana funkcija nakon MI, fokus istraživanja pomaknuo se na rezidentne matične stanice srca (CSC) kao što su c-kit plus, Sca-1 plus, Isl-1 plus -stanice i kardiosfere, koji su vjerojatno unaprijed programirani da postanu kardiomiociti. Ipak, njihov uspjeh u regeneraciji srca je slab [6].

kliknite ovdje da biste saznali više

Posljednjih je godina naša istraživačka skupina otkrila novu vrstu srčanih matičnih stanica nazvanih 'kardijalne atrijalne matične stanice' (CASC). Za razliku od drugih matičnih stanica, CASC pokazuju izvanredna svojstva kardiomiogene diferencijacije, što ih čini obećavajućim kandidatom za regeneraciju srca [4]. Izolacija ove populacije matičnih stanica iz atrijskih avršaka temelji se na visokoj aktivnosti aldehid dehidrogenaze (ALDH). Visoka aktivnost ALDH zabilježena je i u drugim tipovima matičnih stanica, poput MSC-a, HSC-a i neuralnih matičnih stanica i matičnih stanica raka među ostalima [7-9]. Budući da se ALDH pokazao kardioprotektivnim i potiče preživljavanje stanica u uvjetima stresa, korištenje populacije ALDH plus matičnih stanica u ishemijskim stanjima može biti, u ovom kontekstu, korisno [4,10]. CASC se mogu proširiti do klinički relevantnih brojeva, bez gubitka temeljnih karakteristika, kao što su aktivnost ALDH, profil površinskog antigena i sposobnost kardiomiogene diferencijacije [11]. To je ključno za prevođenje ovog terapijskog pristupa u kliniku. Osim toga, pokazali smo da transplantacija autolognih CASC rezultira poboljšanom funkcijom lijeve klijetke, što je rezultat odgovarajućeg presađivanja matičnih stanica i daljnje diferencijacije CASC [4,12].

U pacijenata s MI, razine uznapredovalih krajnjih produkata glikacije (AGEs) su povećane [13]AGEs su proteini i/ili lipidi koji su nepovratno oštećeni glikacijom, procesom u kojem reducirajući šećeri reagiraju neenzimski s amino skupinama u lipidima ili proteinima . Osim glikacije, oksidativni stres također dovodi do stvaranja AGE-a kroz oksidaciju proteina i/ili lipida [14]. AGE se stvaraju endogeno i prirodno se akumuliraju u tijelu sa starenjem ili u patološkim situacijama kao što je MI kada su razine oksidativnog stresa povećane [15-17].što je cistancheNadalje, prethodna su istraživanja pokazala da AGE utječu na različite vrste matičnih stanica in vitro [18-20]. Kapacitet proliferacije matičnih stanica smanjuje se AGE-ima, a stopa apoptoze povećava se primjenom AGE-a. Ti se učinci mogu izvesti kroz nekoliko mehanizama, uključujući aktivaciju apoptotičkog puta, RAGE ili prekomjerno stvaranje ROS [20]. Ostaje nepoznato utječu li AGE-i i na svojstva CASC-a. Ova otkrića postavljaju pitanje mogu li AGE negativno utjecati na terapijsku učinkovitost CASC, koji se koriste u liječenju MI. Stoga je cilj ove studije ispitati in vitro učinke AGE-a i potencijalnu aktivaciju njegovog receptora RAGE na proliferaciju, preživljavanje i migraciju CASCS-a.

2. Materijali i metode

2.1. Pokusi na životinjama

Studije na životinjama provedene su u skladu s EU Direktivom 2010/63/EU za pokuse na životinjama i odobrene od strane Lokalnog etičkog odbora za pokuse na životinjama (UHasselt, Belgija, Diepenbeek; ID 201919K). Sve su životinje držane u okruženju s kontroliranom temperaturom (21 stupanj, 60 posto vlažnosti) s ciklusom svjetlo-tama od 12 h -12 h. Hranili su se standardnom peletiranom hranom s vodom dostupnom ad libitum. Ukupno su korištene 62 ženke Sprague-Dawley štakora (Janvier Labs, Le Genest-Saint-Isle, Francuska).

2.2. Izolacija i širenje CASC štakora

CASC su prikupljeni iz desnog atrija apendiksa, kao što je opisano prije [4] Ukratko, štakorima je ubrizgan heparin (1000 jedinica/kg, intraperitonealno (ip) i eutanazirani su prekomjernom dozom natrijev pentobarbital (Dolethal, Vetoquinol, Aartselar Belgija, 200 mg/kg, ip). Srca su sakupljena, perfundirana normalnom Tyrode otopinom (137 mMNaCl, 5,4 mMKCl, 0,5 mMMgClz, 1 mMCaClz, 11,8 mMNa-HEPES, 10 mMglu-case, 20 mM taurin ,pH7,4) i desni atrijski apendiks je sakupljen. Ekstrahirano tkivo desnog atrijskog apendiksa usitnjeno je u komadiće od ~1 mm³, isprano fosfatnom puferiranom fiziološkom otopinom (PBS) i enzimatski disocirano 30 minuta u Hankovoj uravnoteženoj otopini soli koji sadrži 0,6 WU/mL kolagenaze NB 4 (Serva, Heidelberg, Njemačka) i 20 mM Carly.bioflavonoidiALDHt stanice su obojene prema Aldefluor kitu (STEMCELL Technologies, Evergem, Belgija). ALDHt stanice definirane su kao CASC i sortirane su prema protoku (BD FACS Aria) u mediju X-VIVO 15 (Lonza, Basel, Švicarska) s dodatkom 20 posto fetalnog telećeg seruma (FCS) i 2 posto penicilina/streptomicina (P/S) . Izolirani CASC nasađeni su u 6-ploče s jažicama pri gustoći od 60,000 stanica po jažici i inkubirani na 37 stupnjeva u vlažnom inkubatoru s 5 postotnom atmosferom CO2. Medij se mijenjao svaka 2 do 3 dana. Kada su CASC dosegli 80 posto konfluencije, sakupljeni su pomoću tripsina. Za sve pokuse korišteni su CASC prolaz 1.

Cistanche može spriječiti starenje

2.3.AGEs Priprema

AGEs su pripremljeni kao što je prethodno opisano [21]. Ukratko, albumin goveđeg seruma (BSA; 7 mg/mL) inkubiran je s dimerima glikolaldehida (90 mM; Sigma-Aldrich, Diegem, Belgija) u sterilnom PBS-u (pH7,4) 5 dana na 37 stupnjeva. Ova otopina dijalizirana je protiv PBS-a, dva puta po 2 sata i preko noći na 4 stupnja kako bi se uklonio neizreagirani glikolaldehid (3,4 kDa granična vrijednost. AGE-i su filtrirani (0,2 um filter, Sarstedt, Antwerpen, Belgija). BSA inkubiran u PBS-u (7 mg/mL) ) korištena je kao kontrolna otopina.

2.4. Analiza proliferacije i preživljavanja

Provedeni su testovi proliferacije i preživljavanja, s testom propidijevim jodidom (PI) kako su prije opisali Gervois et al. i Lo Monaco i sur. [22,23]. Ukratko, CASC su nasađeni u 96-pločicu s jažicama u X-VIVO mediju s 10 posto FCS i 2 posto P/S. Za testove proliferacije, posijano je 5000 stanica po jažici. Za testove preživljavanja, posijano je 100 stanica po jažici. Nakon 24 sata, u medij je dodano pet različitih uvjeta: 400 ug/mL BSA, 50 ug/mL, 100 ug/mL, 200 ug/mL i 400 ug/mL AGEs. Za mjerenje proliferacije, BSA ili AGE dodani su u X-VIVO medij s 2 posto FCS i 2 posto P/S.kupiti cistancheZa mjerenje preživljenja BSA ili AGE dodani su u X-VIVO medij s 0 posto FCS i 2 posto P/S. Nakon tri različite vremenske točke (24, 48 i 72 h), medij je zamijenjen puferom za lizu A100 (ChemoMetec, Kaiserslautern, Njemačka), nakon čega je slijedila jednaka količina stabilizacijskog pufera B (ChemoMetec) s dodatkom PI (10 ug/ mL, Sigma). Nakon perioda inkubacije od 15 minuta u mraku, fluorescencija je izmjerena pomoću čitača ploča Fluostar Optima (BMG Labtech, Ortenberg, Njemačka) pri ekscitaciji od 540 nm, valnoj duljini emisije od 612 nm i pojačanju od 2000. Eksperimenti su izvedeni u tri primjerka. Podaci su normalizirani na podatke dobivene s 400 ug/mL BSA.

2.5. Ispitivanje migracije

CASC su zasađene u {{0}}pločicu s jažicom u gustoći od 5000 stanica po jažici u X-VIVO mediju s 10 posto FCS i 2 posto P/S. Pet uvjeta je dodano mediju: 400 ug/mL BSA, 50 ug/mL, 100 ug/mL, 200 ug/mL i 400 ug/mL AGEs. Nakon perioda inkubacije od 72 sata, kondicionirani CASC-ovi su sakupljeni korištenjem tripsina i korišteni za test migracije u jažicu. U ThinCerts (Greiner Bio-One, Vilvoorde, Belgija) s poroznom membranom veličine pora od 8 um, 100 000 stanica po stanju je posađeno u X-VIVO medij s 0 posto FCS i 2 posto P/S. ThinCerts su postavljeni na 24-pločice s jažicama koje sadrže X-VIVO medij s 2 posto FCS i 2 posto P/S. Nakon 24 sata od migracije, ThinCerts su fiksirani s 4 posto paraformaldehida (PFA) 15 minuta i inkubirani s 0,1 posto kristalno ljubičasto 30 min. Stanice koje nisu migrirale uklonjene su s gornje strane ThinCerts, nakon čega je količina transmigriranih CASC-ova kvantificirana softverom AxioVision 4.6 (Carl Zeiss, Zaventem, Belgija). Podaci su normalizirani na podatke dobivene s 400 ug/mL BSA.

2.6. Test apoptoze

CASC su zasađene u 96-ploču s jažicama gustoćom od 10,00 stanica po jažici u X-VIVO mediju s 2 posto FCS i 2 posto P/S. Za proučavanje apoptoze, proveden je test kaspaze korištenjem reagensa IncuCyte8 Caspase-3/7 Green Apoptosis Assay Reagens (razrijeđen 1/100, Sartorius, Schaarbeek, Belgija). Mediju je dodano pet uvjeta: 400 ug/mL BSA, 50 ug/mL, 100 ug/mL, 200 ug/mL i 400 ug/mL AGEs. CASCs uzgajani u X-VIVO mediju bez FCS i 2 posto P/ S su korišteni kao pozitivna kontrola. Eksperimenti su izvedeni u tri primjerka. Slike su snimljene nakon 24, 48 i 72 sata inkubacije korištenjem IncuCyte@S3Live-Cell Analysis System (Sartorius, Schaarbeek, Belgija). Analiza područja okupiranog apoptotskim stanicama provedena je korištenjem IncuCyte* SX1 Live-Cell Analysis System (Sartorius, Schaarbeek, Belgija). Podaci su normalizirani na pozitivnu kontrolu (plus, X-VIVO medij bez FCS).

2.7.In Vitro RAGE inhibicija

RAGE je inhibiran kako bi se procijenio doprinos aktivacije RAGE u proliferaciji, preživljavanju i migraciji CASC-a. Ukratko, CASC su prethodno inkubirani na 37 stupnjeva u 5 postotnom CO2 inkubatoru s RAGE antagonistom FPS-ZM1 (10 i 25 uM, Calbiochem/Merck, Overijse, Belgija). Nakon 2 sata predinkubacije, dodano je 400 ug/mL AGE-a.cistanche AustralijaNakon 24 48 i 72 h, proliferacija i preživljavanje procijenjeni su kako je gore opisano. Nakon 72 h inkubacije, prethodno kondicionirani CASC-ovi su sakupljeni i korišteni za analizu migracije kroz jažicu kako je gore opisano.

2.8.Statistika

Statističke analize provedene su pomoću softvera GraphPad Prism 9.0.0.cistanchNormalna distribucija podataka procijenjena je Shapiro-Wilkovim testom. Podaci s normalnom distribucijom podvrgnuti su jednosmjernom ANOVA testu s ponovljenim mjerenjima, nakon čega je uslijedio Holm-Sidakov test višestruke usporedbe. Kada podaci nisu bili normalno distribuirani, korišten je neparametarski Friedmanov test praćen Dunnovim testom višestruke usporedbe. Svi podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± standardna pogreška srednje vrijednosti (SEM). Vrijednost p<0.05 was="" considered="" statistically="">

3. Rezultati

3.1. Izloženost AGE-ima negativno utječe na proliferaciju i preživljavanje CASC-a

Kao što je prikazano na slici 1, AGE-i su značajno i postupno smanjivali proliferaciju CASC-a tijekom vremena. Negativan utjecaj AGE-a na proliferaciju CASC-a također je ovisio o koncentraciji. Nakon 72 h, koncentracije od 100 ug/mL, 200 ug/mL i 400 ug/mL AGE-a značajno su smanjile proliferaciju CASC-a u usporedbi s BSA (Slika 1C; 80 posto ±7n100 ug/mL, 74 posto ±3 u 200 ug/mL, i 65 posto ±4 u 400 ug/mL AGEs）. Sama primjena BSA nije utjecala na proliferativni kapacitet CASCs (Slika Sl u Dodatnim materijalima). Kao što je prikazano na slici 2, rastuće koncentracije AGE-a negativno su utjecale na preživljavanje CASC-a tijekom vremena. Značajni učinci AGE-a primijećeni su nakon 48 (Slika 2B) i 72 sata (Slika 2C; 85 posto ±3 u 100 ug/mL, 73 posto ±3 u 200 ug/mL i 64 posto ±4 u 400 ug/mL AGE-a) Sama primjena BSA nije utjecala na sposobnost preživljavanja CASC-a (Slika S1).

3.2. Povećane koncentracije AGE-a povećavaju apoptozu CASC-a

Kako bi se razjasnio učinak različitih koncentracija AGE-a （50, 100, 20 i 400 ug/mL） na apoptozu CASC-a, proveden je test kaspaze. Postotak stanica koje eksprimiraju kaspazu 3/7 mjeren je u različitim vremenskim točkama: 24 (Slika 3A), 48 (Slika 3B) i 72 (Slika 3C) h. Stopa apoptoze postupno se povećavala tijekom vremena s povećanim koncentracijama AGE-a (Slika 3C, 72h; 77 posto ±17 u 400 ug/mL AGE-a naspram 18 posto ±3 u BSA).

3.3. Izloženost AGE-ima smanjuje kapacitet migracije CASC-a

Kapacitet migracije CASC-a procijenjen je testom migracije preko jažice nakon 72 sata inkubacije s različitim koncentracijama AGE-a. Na slici 4-E prikazani su reprezentativni primjeri migracije CASC nakon inkubacije s BSA i različitim koncentracijama AGE (50, 100, 200 i 400 ug/mL). Kvantifikacija migracije prikazana je na slici 4F. U usporedbi s BSA, primijećeno je značajno smanjenje migracije kada su CASC inkubirani s 400 ug/mL AGEs （Slika 4E, F; 75 posto ±5 u 400 ug/mL AGEs）.

3.4. Štetni učinci AGE-a u CASC-ima posredovani su RAGE aktivacijom

Kako bi se procijenio doprinos aktivacije RAGE u promatranim štetnim učincima AGE-a, proliferacija, preživljavanje i migracija CASC-a procijenjeni su nakon inkubacije s RAGE antagonistom FPS-ZM1. Prije izlaganja 400 ug/mL AGE-a, CASC-ovi su prethodno inkubirani 2 sata s 10 ili 25 uM FPS-ZM1. Primjena samog FPS-ZMl (10 i 25 uM) nije utjecala na proliferativni kapacitet niti na preživljavanje CASC (Slika S2). Proliferacija CASC (Slika 5A-C) procijenjena je nakon 24 (A), 48 (B) i 72 (C) h. Kao što je prikazano na slici 1, negativan utjecaj AGE-a na proliferaciju CASC značajno je smanjen nakon predinkubacije s 25 uM FPS-ZM1 (slika 5A-C). Doista, nakon 24 i 48 h, proliferacija CASC-a bila je značajno poboljšana, uz izloženost AGE-u od 400 ug/mL (24 sata, slika 5A; 104 posto 士8 u 25 µM FPS-ZM1 naspram 79 posto ±5 u AGE-u od 400 ug/mL; 48h, slika 5B; 95 posto ±5 u 25 μM FPS-ZM1 naspram 70 posto ±4 u 400 ug/mL AGEs）. Nakon 72 sata primijećen je isti trend. Proliferacija je imala tendenciju poboljšanja kada je RAGE bio inhibiran （Slika; 80 posto ±8 u 25 μMFPS-ZM1 naspram 67 posto ±5 u 400 ug/mL AGEs, p=0.06）. Preživljenje (Slika 6A-C) procijenjeno je nakon 24 (A), 48 (B) i 72 (C) h. Negativan utjecaj AGE-a na preživljenje CASC-a (Slika 2) značajno je poboljšan nakon predinkubacije s 25 uM FPS-ZM1 (Slika 6A-C). Nakon 24 sata preživljenje se značajno poboljšalo (Slika 6A; 104 posto ±7 u 25 µM FPS- ZM1 u odnosu na 91 posto ±4 u 400 ug/mL AGEs）. Ovaj trend je također primijećen nakon 48 h (Slika 6B; 91 posto ±5 u 25 μM FPS-ZM1 u odnosu na 81 posto ±5 u 400 ug/mL AGEs,p =0.07). Reprezentativni primjeri migracije CASC-a nakon 72 h inkubacije s 400 ug/mL AGE-a i FPS-ZMl prikazani su na slici i kvantificirani na slici. Predinkubacija CASC-a s 25 uM FPS-ZMI mogla bi spriječiti smanjeni kapacitet migracije CASC-a uočen s izloženošću AGE-ima ( Slika 7B; 98 posto ±6 u 25 uM FPS-ZM1 naspram 7 posto ±8 u 400 ug/mL AGEs, p=0.07）.

4. Rasprava

Naša je studija prva koja pokazuje da AGE utječu na svojstva CASC-a, naime na preživljavanje, proliferaciju, migraciju i apoptozu in vitro. Naši podaci pokazuju da su ti učinci djelomično posredovani aktivacijom RAGE na način ovisan o dozi.

4.1. Uloga AGE-a u MI

Razine krvožilnih AGE značajno su povišene u bolesnika s akutnim MI [24,25] Međutim, ostaje nejasno kako su uključeni u patofiziologiju MI. Reaktivne kisikove vrste (ROS) glavni su čimbenici uključeni u sintezu AGE-a. Oksidativni stres može potaknuti stvaranje reaktivnih karbonilnih spojeva i glikoksidaciju Amadorijevih proizvoda u Maillardovoj reakciji. Kao takvi, AGE se nepovratno formiraju i nakupljaju u srcu nakon MI i smatra se da potencijalno dodatno pogoršavaju nepovoljni srčani fenotip [26,27]. Osim toga, neutrofili i aktivirani makrofagi, uključeni u upalni proces u MI, glavni su čimbenici sinteze AGE-a[28,29]. Ove imunološke stanice izlučuju AGE-e i navode se kao ključni induktori stvaranja AGE-a u MI. 4.2. Fiziološka važnost koncentracija AGE-a

U našoj smo studiji testirali širok raspon koncentracija AGE-a （50 do 400 ug/mL） Koncentracija AGE-a korištena u drugim in vitro studijama koje istražuju učinak AGE-a na matične stanice kreće se od 15 do 500 ug/mL 【20】. Postoji značajna varijabilnost korištenih koncentracija, ali više razine AGE općenito odražavaju fiziološke razine u plazmi koje se nalaze u pacijenata koji boluju od više bolesti. Doista, pokazalo se da se koncentracija AGEs-albumina kod dijabetičara kreće od 50 do 400 ug/mL [30]. Razine AGE-a mogu porasti do koncentracija do 200 ug/mL u pacijenata koji boluju od kardiovaskularnih bolesti [31,32]. U bolesnika s ranim stadijem Alzheimerove bolesti zabilježene su i niže koncentracije AGE-a u rasponu nanoskala [33]. Međutim, zbog različitih analitičkih metoda koje se koriste za mjerenje AGE-a i heterogenosti različitih tipova AGE-a, procjena pouzdanih koncentracija AGE-a in vivo ostaje tehnički izazovna i vjerojatno je podcjenjivanje [34].

4.3. AGEs imaju negativan utjecaj na svojstva CASCs

Čak i ako transplantacija CASC-a pokazuje obećavajući potencijal za regeneraciju srca nakon IM, preživljavanje i regenerativni kapacitet stanica ostaje problem. Poznato je da su ishemijska područja neprijateljsko okruženje s povećanim razinama oksidativnog stresa, upale i fibroze u kombinaciji s povećanim razinama AGEs tkiva. Nije poznato hoće li AGE utjecati na regenerativni kapacitet CASC-a, no moglo bi biti važno saznanje u kontekstu srčane regeneracije i obećavajućih regenerativnih kapaciteta CASC-a[12]. U našoj studiji pokazujemo da AGEs ometaju preživljavanje, proliferaciju i migraciju CASC-a in vitro, na način ovisan o koncentraciji i vremenu. Nadalje, izloženost AGE-ima dovodi do postupnog povećanja apoptoze CASC-a. Naši su podaci u skladu sa studijama koje ispituju učinak AGE-a na više vrsta drugih matičnih stanica, u kojima je proliferativni kapacitet promijenjen i apoptoza povećana [20]. Doista, Zhu i sur. pokazali su značajno smanjenje proliferacije EPC-a nakon izlaganja različitim koncentracijama AGE-a[16]. Isti učinak procijenili su Sun i sur. također u EPC-ima, gdje je povećanje stope apoptoze bilo posredovano aktivacijom p38 MAPK puta [35]. NSC-ovi izloženi AGE-ima rezultirali su smanjenjem proliferacije matičnih stanica ovisno o dozi, posredovano putem PPARy [36]. U matičnim stanicama dobivenim iz masnog tkiva (ADSC), povećanje aktivacije kaspaze 3 dovodi do povećane stope apoptoze [37]. Yang i sur. izvijestili su o nižim kapacitetima proliferacije i migracije u MSC-ima, na način ovisan o koncentraciji AGE-a. Taj je učinak bio posredovan prekomjernom proizvodnjom ROS-a[18]. Jesu li štetni učinci na CASC, vrlo različitu populaciju matičnih stanica srčanog podrijetla, također posredovani prekomjernom proizvodnjom ROS-a, tek treba utvrditi.

Pokazalo se da su temeljni mehanizmi u kojima AGEs izvršavaju svoje negativne učinke na funkciju organa ovisni i/ili neovisni o aktivaciji RAGE receptora [15]. Studije na mnogim tipovima matičnih stanica pokazuju da AGE-i posreduju u svojim učincima uglavnom putem aktivacije RAGE-a ili drugih apoptotskih putova [20]. Aktivacija RAGE pomoću AGE-a uzrokuje aktivaciju MAPK, što dovodi do fosforilacije JNK i p38] Ovi fosforilirani proteini povećavaju transkripciju različitih pro-apoptotskih transkripcijskih faktora u jezgri, što dovodi do povećanja apoptoze. Pored toga, mogu se aktivirati putevi kaspaze, uzrokujući apoptozu izazvanu AGEs-om [39]. Studije praćenja i dalje su potrebne kako bi se razotkrili molekularni mehanizmi kojima se nizvodni učinci AGE-a induciraju u CASC-u. Međutim, pokazali smo da su nakon blokiranja RAGE pomoću FPS-ZM1 opaženi učinci AGE-a na CASC bili prigušeni. Stoga naši podaci snažno ukazuju na to da AGE posreduju u svojim učincima na CASC vjerojatno kroz vezanje i aktivaciju RAGE. Jesu li uključeni Jak/STAT, PI3K/Akt, MAPK, prekomjerna proizvodnja ROS-a ili drugi signalni putovi, ostaje za dodatno utvrđivanje. Naši su podaci također u skladu s radom koji su opisali Zhang et al., gdje je FPS-ZMl također poništio negativne učinke AGE-a u ADSC-ima blokiranjem RAGE-a, dodatno potvrđujući važnu ulogu aktivacije RAGE-a kao posrednika štetnih učinaka uzrokovanih DOBI[40].

4.4. Buduće perspektive za anti-AGEs terapije za kardiovaskularne bolesti i trenutna ograničenja

In vivo potvrda o korištenju anti-AGEs terapija i njihovoj potencijalnoj dodanoj vrijednosti transplantaciji matičnih stanica nakon MI mora biti potvrđena na životinjskom modelu prije nego što se to može prenijeti na kliniku. Pokazalo se u više studija in vitro da inhibitor PPARy rosiglitazon [41,42], inhibitori MAPK [18,35,43] ili antioksidansi [4] mogu oslabiti učinke posredovane AGE-ima na matične stanice. Međutim, njihov utjecaj in vivo kao terapijske intervencije u kombinaciji s transplantacijom matičnih stanica nikada se dosad nije bavio. Postoji više strategija za snižavanje razine AGE-a u tijelu. Piridoksamin (PM) je inhibitor stvaranja AGE-a smanjenjem pretvorbe Amadori-a u AGE-e i uklanjanjem karbonilnih spojeva. Učinkovitost, kao i sigurnost liječenja PM-om, dokazana je u kliničkim ispitivanjima na dijabetičarima [45]. Međutim, kliničko ispitivanje NephroGenexa 2014., kojim se testirao piridorin[(tj. PM) kao antidijabetičku terapiju, prekinuto je zbog financijskih problema [46]. Niti jedno drugo kliničko ispitivanje trenutno ne istražuje PM kao terapiju. Međutim, inhibicija stvaranja AGE-a s PM-om mogla bi biti strategija za poboljšanje potencijala matičnih stanica u regenerativne svrhe srca. Osim toga, drugi inhibitori stvaranja AGE-a, poput aminogvanidina, mogli bi se koristiti u budućnosti za snižavanje razina AGE-a nakon MI. Kliničko ispitivanje ACTION II pokazalo je učinkovitost aminogvanidina kod dijabetičara. Dok aminogvanidin nije uspio značajno smanjiti primarnu krajnju točku udvostručavanja vremena za postizanje maksimalne razine kreatinina u serumu kod ovih pacijenata, prikazani su drugi klinički važni učinci na komplikacije dijabetesa, poput smanjenja proteinurije i koncentracije lipida u cirkulaciji. Međutim, zbog reverzibilnih štetnih učinaka kao što su indukcija autoantitijela, simptomi slični gripi i anemija, ovo je ispitivanje prekinuto, a prijenos u kliniku ostaje ograničen [47,48]. Osim toga, korištenje antioksidansa kao što je N-acetil-L-cistein (NAC) ili glutation kao dodatak našoj prehrani moglo bi pružiti neke korisne ishode za terapiju matičnim stanicama, jer povećavaju genomsku stabilnost, poboljšavaju adheziju i stimuliraju proliferaciju matičnih stanica [ 49]. Međutim, stanično-specifična djelovanja razlikuju se među tipovima matičnih stanica i potrebna su klinička ispitivanja doze i odgovora kako bi se procijenila njihova terapijska učinkovitost kada se koriste u kombinaciji s transplantacijom matičnih stanica. Druga je mogućnost razbiti AGEs terapijom ALT-71. ALT-711 može cijepati ugljik-ugljik veze između karbonila, razbijajući tako poprečne veze u AGEs molekulama. Međutim, nekoliko kliničkih ispitivanja nije moglo potvrditi blagotvorne učinke ALT-711 uočene u studijama na životinjama. Nadalje, inhibitori RAGE (poput FPS-ZM1) ili inhibitori nizvodnih molekula u RAGE putu mogu interferirati u AGEs/RAGE staničnoj signalnoj osi, čime blokiraju učinke posredovane AGE-ima u matičnim stanicama. Učinkovitost različitih tipova malih molekula i inhibitora u blokiranju AGE-a u matičnim stanicama dokazana je u više in vitro eksperimenata [18,35,44], ali nikada prije nije testirana na životinjskim modelima. Stoga možemo samo pretpostaviti da su ti inhibitori učinkoviti u blokiranju AGE-a u in vivo situaciji, ali potrebni su eksperimenti s dokaznim konceptom. Konačno, još jedna opcija za blokiranje AGE-a u kombinaciji s terapijom matičnim stanicama je genetska modifikacija samih matičnih stanica. Poznato je da prekomjerna ekspresija sRAGE-a pojačava uklanjanje AGE-a (i drugih RAGE liganda poput amiloida-) kako bi se poboljšala učinkovitost stanične terapije. To se pokazalo kod MSC-a koji izlučuju sRAGE kao terapije za Alzheimerovu bolest [50,51], artritis [52] i Parkinsonovu bolest [53]. MSC koje izlučuju sRAGE preživjele su dulje, imale su povećanu sposobnost migracije, bile su bolje zaštićene od apoptoze i imale su protuupalna svojstva. Također, smanjena regulacija RAGE-a, čime se matične stanice desenzibiliziraju za AGE-e, mogla bi biti opcija u poboljšanju funkcionalnosti stanica. Ostaje da se istraži mogu li se te strategije primijeniti iu slučaju MI i srčanog zahvata. Ukratko, sve ove strategije usmjerene su na rješavanje AGE-a kako bi se poboljšala funkcionalnost i zadržavanje matičnih stanica. Međutim, ove terapijske mogućnosti ostaju hipotetske i potrebno ih je istražiti in vivo u kombinaciji s CASC terapijom prije nego što se mogu prevesti u kliničko okruženje. 5. Zaključci

Otkrili smo da AGE-i imaju postupan učinak ovisan o vremenu i koncentraciji na svojstva CASC-a, povećanjem apoptoze i smanjenjem preživljavanja, proliferacije i migracije in vitro. Radni mehanizmi koji stoje iza ovih učinaka tek treba dalje istražiti, iako smo pokazali da aktivacija RAGE-a značajno pridonosi ovim negativnim učincima povezanim s AGE-ima. Ostaje za daljnje istraživanje može li ciljanje AGE-a in vivo poboljšati terapijski kapacitet CASC-a nakon MI.

Ovaj je članak izvađen iz J. Clin. Med. 2021, 10, 2964. https://doi.org/10.3390/jcm10132964 https://www.mdpi.com/journal/jcm