Učinci različitih ekstrahiranih dijelova Cistanche Deserticola na hipoglikemijske učinke Db / Db crnih miševa Ⅱ

2 Eksperimentalne metode

2.1 Priprema prerađenih proizvoda od Cistanche deserticola Cistanche deserticola:

Uzmite ljekovite materijale Cistanche deserticola, isperite nečistoće, kuhajte na pari u posudi pod normalnim tlakom 2 sata, izrežite na 6 mm i osušite na 70 stupnjeva. Cistanche deserticola: Uzmite komadiće uvarka od Cistanche deserticola, dodajte odgovarajuću količinu rižinog vina, dobro promiješajte, vlažite 8 sati (žuto rižino vino: voda=1:1), kuhajte na pari pod visokim pritiskom 4 sata i sušite na 70 stupnjeva. (Upotrijebite 30 mL rižinog vina za svakih 100 g Cistanche deserticola).

PRIRODNI ORGANSKI EKSTRAKT CISTANCHE

Usluga podrške Wecistanche-najvećeg izvoznika cistanche u Kini:

E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/telefon:+86 15292862950

Kupite za više pojedinosti o specifikacijama:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

2.2 Obogaćivanje različitih ekstrahiranih dijelova Cistanche deserticola/Cistanche deserticola

Uzmite 30 g praha Cistanche deserticola/Tamarococcus deserticola, dodajte 10 puta veću količinu vode, zagrijte i refluksirajte dva puta, svaki put po 2 sata, pomiješajte ekstrakte, koncentrirajte, dodajte etanol dok sadržaj alkohola ne dosegne 60%, taložite na niskoj temperaturi 12 sati i filtrirati usisavanjem. , talog je sirovi polisaharidni dio. Ukoncentrirajte supernatant do odgovarajuće koncentracije, nanesite ga na D101 makroporoznu adsorpcijsku smolu i eluirajte vodom i etanolom različitih koncentracija u nizu. Prikupiti vodeni eluat i koncentrirati pod smanjenim tlakom do guste paste, koja je ukupna frakcija oligosaharida; isprati 40% etanolom. Delikvidirati, koncentrirati i osušiti pod sniženim tlakom, što je ukupna frakcija glikozida Cistanche deserticola.

2.3 Određivanje sadržaja različitih ekstrahiranih dijelova Cistanche deserticola/Cistanche deserticola

2.3.1 Određivanje ukupnog sadržaja polisaharida Cistanche deserticola/Cistanche deserticola.

Izvažite uzorak glukoze 20. 00 mg u odmjernoj tikvici od 50 mL da se dobije 0. Za standardnu ​​otopinu glukoze od 4 mg·mL-1, pipetirajte 3, 4, 5, 6, odnosno 7 mL u odmjernu tikvicu od 50 mL, razrijedite do volumena s vodom i pipetirajte 2,0 mL svaki koncentracijski gradijent otopine glukoze u epruvetu. Uzmite drugu jednaku količinu destilirane vode kao slijepu probu, dodajte 1 mL 5% fenola u svaku epruvetu, dobro protresite, brzo dodajte 5 mL koncentrirane sumporne kiseline, ostavite 10 minuta, stavite u vodenu kupelj na 40 stupnjeva za 15 minuta, izvadite ga, brzo ohladite na sobnu temperaturu i izmjerite vrijednost apsorbancije na 490 nm, uzmite apsorbanciju (A) kao ordinatu, a koncentraciju glukoze (C) kao apscisu, nacrtajte standardnu ​​krivulju i dobijete regresijska jednadžba Y=8.37X-0.162 8 (R2=0.994 6). Točno izvažite 1,0 g ukupnog praha polisaharida sirovina i proizvoda, stavite ih u odmjerne tikvice od 50 mL, dodajte vodu da se otopi i prilagodite volumen do oznake, točno uvucite 2,0 mL u epruvetu i izmjerite u istoj način kao metoda pripreme standardne krivulje. , to je to.

2.3.2 Određivanje sadržaja betaina u Cistanche deserticola/Cistanche deserticola

2.3.2.1 Priprema referentne otopine:

Točno izvažite 1,17 mg referentne otopine betaina, stavite je u odmjernu tikvicu od 5 mL, dodajte 50% metanola da se otopi i razrijedite na volumen, i spremno je.

2.3. 2． 2 Kromatografski uvjeti

Kromatografska kolona je Ecosil {{0}}AMINO kromatografska kolona (4,6 mm×250 mm, 5 μm), mobilna faza: acetonitril-voda (99,5 ∶ 0,5) , temperatura kolone: ​​30 stupnja, valna duljina detekcije: 194 nm, brzina protoka: 0,6 mL·min-1, volumen injekcije 10 μL, kromatogram prikazan na slici 1. 2.3.2.3 Precizna priprema ispitne otopine izvažite prah ukupne frakcije oligosaharida sirovih i gotovih proizvoda 1,0 g, odnosno stavite u odmjernu tikvicu od 5 mL, dodajte destiliranu vodu da se otopi i razrijedite do volumena, dobro protresite, prođite kroz 0,45 μL mikroporoznu filtarsku membranu i spremno je.

2.3.2.4 Određivanje sadržaja uzorka

Precizno apsorbirajte ukupnu ispitnu otopinu oligosaharida u sirovoj i pripremljenoj Cistanche deserticola, izmjerite je prema uvjetima pod "2.3.2.2" i izračunajte sadržaj betaina u uzorku.

2.3.3 Određivanje sadržaja ehinakozida, verbaskozida i heterocimicifugarina u Cistanche deserticola/Cistanche deserticola

2.3.3.1 Priprema referentne otopine

Precizno izvažite 4,50 mg ehinakozida, 4,80 mg verbaskozida i 5,05 mg heterolognog komimicina u odmjerne tikvice od 5 mL, dodajte 50% metanola da se otopi i razrijedite do oznake te uzmite svaku kontrolu. Stavite 200 μL otopine uzorka u injekciju bočicu, dodajte 400 µL 50% metanola i dobro promiješajte kako biste dobili miješanu referentnu otopinu, dobro protresite i spremna je.

2.3.3.2 Kromatografski uvjeti

Kromatografska kolona je Ecosil C18 (4,6 mm×250 mm, 5 μm), metanol je mobilna faza A, 0.1% mravlja kiselina je mobilna faza B, gradijent eluacije, {{ 12}}~45 min, 30% A → 70% A, brzina protoka je 1,0 mL·min-1, temperatura kolone je 30 stupnjeva, valna duljina detekcije je 330 nm, volumen injekcije je 10 μL, i kromatogram je prikazan na slici 2.

2.3.3.3 Priprema otopine za ispitivanje

Precizno izvažite 1.0 g ukupnog praha glikozida sirovina i proizvoda, stavite ih u odmjerne tikvice od 100 mL, dodajte 50% metanola da se otopi, podesite volumen na oznaku i protresite dobro. Precizno izvucite 5 mL svakog uzorka u odmjernu tikvicu od 10 mL, dodajte 50% metanola da nadoknadite volumen, dobro protresite i prođite kroz mikroporoznu filtarsku membranu od 0,45 μm da dobijete.

2.3.3.4 Određivanje sadržaja uzorka

Precizno izvucite uzorak ukupnih glikozida Cistanche deserticola i izmjerite ga prema uvjetima pod "2.3.3.2". Izračunajte sadržaj ehinakozida, verbaskozida i heterolognog komplicita u uzorku.

2.4 Grupiranje životinja, modeliranje i primjena lijekova

Prostorija za životinje ima 12 sati svjetla i 12 sati tame, relativnu vlažnost zraka od 50% do 70%, a sobnu temperaturu od 18 do 22 stupnja. db/db crni miševi i db/m crni miševi (normalna kontrolna skupina) hranjeni su normalno običnom hranom, a eksperiment je započeo u dobi od 9 tjedana. Osim normalne kontrolne skupine, preostali db/db crni miševi nasumično su odabrani prema razini šećera u krvi i tjelesnoj težini. Podijeljen u 8 skupina, naime model skupina, skupina pozitivne kontrole, skupina ukupnih polisaharida Cistanche deserticola, skupina ukupnih oligosaharida Cistanche deserticola, skupina ukupnih glukozida Cistanche deserticola, skupina ukupnih polisaharida Tartschistanche deserticola, skupina ukupnih oligosaharida Tarthouse deserticola, skupina ukupnih glukozida Tartschistanche deserticola. Osim normalne kontrole

Osim modelne skupine i modelne skupine, štakorima u drugim skupinama primijenjena je intragastrična primjena u dozi od 2 mL/100 g tijekom 4 uzastopna tjedna. Koncentracija tekućine bila je 4,1 g·kg-1. Normalna kontrolna skupina i modelna skupina tretirane su na isti način. Dajte određenu količinu fiziološke otopine u želudac.

2.5 Učinci različitih ekstrahiranih dijelova Cistanche deserticola na razinu glukoze u krvi db/db crnih miševa

2.5.1 Oralni test tolerancije glukoze (OGTT).

Nakon 26 dana primjene, gladovali su 12 sati, a 60 minuta nakon primjene sljedeći dan, crni miševi u svakoj skupini dobili su 2.0 g·kg-1 glukoze na 0, {{10}}.5, 1.0, odnosno 2. .0 h krv iz repne vene uzeta je za mjerenje vrijednosti glukoze u krvi. Uz vrijednost glukoze u krvi kao ordinatu i vrijeme kao apscisu, napravljen je grafikon promjene glukoze u krvi, a površina ispod linije krivulje glukoze u krvi svake pokusne skupine izračunata je prema formuli (AUC, hmmoL·L{ {13}}) [19]. AUC=A × {{20}}.25 + B × 0.50 + C × 0.75 + D. U formuli: A, B, C i D su vrijednosti glukoze u krvi u 0, 0,5, 1,0 i 2,0 h, redom.

2.5.2 Izračunavanje indeksa inzulinske rezistencije i indeksa arterioskleroze

Indeks inzulinske rezistencije izračunat je prema metodi iz literature [20]: HOMA-IR=Glukoza × Inzulin / 22. 5. HOMA - =20 × Inzulin / (Glukoza - 3.5) × 100%. IR je inzulinska rezistencija, a (%) je -stanična funkcija. Molarna jedinica glukoze je mmoL·L-1

. Inzulin se daje u mU·L-1. Broj glukoze i inzulina se mjeri tijekom posta. Indeks arterioskleroze (Aterogeni indeks) izračunat je prema metodi koju su opisali Zheng i sur. [21]. Metoda izračuna: Indeks aterogenosti=(TC-HDL-C) / HDL-C.

2.5.3 Učinci različitih ekstrahiranih dijelova Cistanche deserticola/Cistanche deserticola na serumski INS i HbA1c db/db crnih miševa

Uzmite smrznute uzorke seruma i stavite ih na sobnu temperaturu prije nego što ih upotrijebite za testiranje s INS i HbA1c kompletima za enzimski imunološki test. Strogo slijedite metode i korake u uputama za komplet.

2.6 Učinci različitih ekstrahiranih dijelova Cistanche deserticola/Cistanche deserticola na razinu oksidativnog stresa u jetri db/db crnih miševa

Uzmite zamrznute uzorke seruma i stavite ih na sobnu temperaturu prije nego što ih upotrijebite za testiranje s MDA i SOD priborom za enzimski imunološki test. Strogo slijedite metode i korake u uputama za komplet.

2.7 Učinci različitih ekstrahiranih dijelova Cistanche deserticola/Cistanche deserticola na jetreni metabolizam masti db/db crnih miševa

Razine TG, TC, HDL-C i LDL-C u serumu štakora mjerene su pomoću odgovarajućih pribora. Za određene korake mjerenja, pogledajte upute za komplet.

2.8 Učinci različitih ekstrahiranih dijelova kamfora Cistanche deserticola/Ratiana na UA, Cr i mALB u plazmi i urinu db/db crnih miševa

Uzmite smrznute uzorke plazme i urina i dovedite ih na sobnu temperaturu prije nego što ih upotrijebite za testiranje UA, Cr i mALB kompleta enzimskih imunoloških testova. Strogo slijedite metode i korake u uputama za komplet.

2.9 Promatranje patoloških dijelova gušterače i bubrega HE bojenjem

Tkiva gušterače i bubrega natopljena 10% paraformaldehid fiksativom 24 sata su uklonjena, isprana destiliranom vodom i pohranjena u 70% etanolu. Uzorci tkiva su uklonjeni, dehidrirani s stupnjevanim etanolom, pročišćeni, uklopljeni u parafin, razrezani i zatim obojeni hematoksilinom i eozinom (H&E bojenje). Nakon što se ljepilo za presjeke osuši, upotrijebite sustav digitalnih slika visoke rezolucije za promatranje i fotografiranje sekcija.

2.10 Određivanje kolagena bubrežnog tkiva tipa IV imunohistokemijskim putem

Za ekspresiju, dijelovi bubrega su deparafinizirani u vodi i zatim podvrgnuti ponovnom pronalasku antigena. Blokirani su s 10% kozjim serumom i inkubirani s primarnim antitijelima na 4 stupnja preko noći. Nakon ispiranja, sekundarno antitijelo je inkubirano. Trenutno rješenje bio je DAB za razvijanje boja. Ispiranje, dehidracija i pečaćenje izvedeni su pod optičkim mikroskopom. Promatrajte ekspresiju proteina kolagena tipa IV u tkivu bubrega.

2.11 Statističke metode

Korištenje softvera GraphPad Prism Version 5.01 (2007, GraphPad Software re inc) za analizu podataka i rezultata

Rezultat je srednja vrijednost±SEM. Pokazuje da je razlika između dvije skupine jednosmjerna

ＡＮＯＶＡ( ｏｌｌｏｅｄｅＢｏｎｅｒｒｎｎ′ test jednog para stupaca), P<0.05 is a significant difference and has statistical significance.