Sažetak

Cilj: Istražiti učinke formule koja sadrži Cistanche (zamjenjuje izvorne biljke koje njeguju krv i toniziraju bubrege) na ekspresiju transformirajućeg čimbenika rasta - 2 (TGF- 2), remodeliranje bjeloočnice i transport vode kod štakora kratkovidnosti s deprivacijom forme (FDM) reguliranjem caveolin-1 (CAV1)/aquaporin 1 (AQP1) put.

Metode: Odabrano je 40 muških SD štakora SPF stupnja, među kojima je 30 korišteno za uspostavljanje FDM modela. Nakon uspješnog modeliranja, štakori su podijeljeni u skupinu FDM, skupinu pirenzepina (PIR) i skupinu Cistanche formule, s 10 štakora u svakoj skupini. Preostalih 10 nemodeliranih štakora služilo je kao normalna skupina. Normalna skupina i FDM skupina nisu primile nikakvu intervenciju. PIR skupina liječena je PIR kapima za oči dva puta dnevno (ujutro i navečer), dok je skupini s Cistanche formulom davana intragastrična primjena formule koja je sadržavala Cistanche. Refraktivna greška i aksijalna duljina štakora detektirani su pomoću retinoskopa i dijagnostičkog instrumenta. Bojanje HE korišteno je za promatranje morfoloških promjena tkiva bjeloočnice. Imunohistokemijsko bojenje korišteno je za otkrivanje ekspresije TGF- 2 u tkivu bjeloočnice. Western blot korišten je za određivanje relativnih razina ekspresije proteina AQP1 i CAV1 u tkivu bjeloočnice. RT-PCR je proveden za mjerenje relativnih razina ekspresije glutamat-aspartat transportera (GLAST) i glutamat transportera 1 (GLT-1) mRNA u tkivu bjeloočnice. Rezultati: U usporedbi s normalnom skupinom, refrakcijska pogreška, razina ekspresije TGF- 2 i relativne razine ekspresije proteina AQP1 i CAV1 u FDM skupini, skupini Cistanche formule i PIR skupini bili su značajno smanjeni, dok su aksijalna duljina i relativne razine ekspresije GLAST mRNA i GLT-1 mRNA značajno povećane (svi P < 0,05). U usporedbi s FDM skupinom, refrakcijska pogreška, razina ekspresije TGF- 2 i relativne razine ekspresije proteina AQP1 i CAV1 u skupini Cistanche formule i PIR skupini značajno su povećane, dok su aksijalna duljina i relativne razine ekspresije GLAST mRNA i GLT-1 mRNA značajno smanjene (svi P < 0,05). U usporedbi sa skupinom s Cistanche formulom, refrakcijska pogreška, razina ekspresije TGF- 2 i relativne razine ekspresije proteina AQP1 i CAV1 u skupini PIR bile su značajno smanjene, dok su aksijalna duljina i relativne razine ekspresije GLAST mRNA i GLT-1 mRNA značajno povećane (svi P < 0,05). Rezultati bojenja HE pokazali su da nije bilo abnormalnih promjena u strukturi svakog sloja retine u normalnoj skupini; mrežnica skupine FDM bila je stanjena i pojavile su se teške vakuolarne promjene u sloju ganglijskih stanica; povećana je debljina retine skupine Cistanche formule i PIR skupine, raspored stanica je u osnovi bio pravilan, broj ganglijskih stanica je povećan, a stanice u svakom sloju bile su gusto raspoređene, s najznačajnijim učinkom u skupini Cistanche formule. Zaključak: Formula koja sadrži Cistanche ima određeni pozitivan učinak na liječenje FDM-a, a njezin mehanizam može biti povezan s regulacijom ekspresije CAV1, AQP1 i TGF- 2, kao i balansiranjem i poboljšanjem remodeliranja sklere i funkcija transporta vode.

 

 

BILJNI DODATAK CISTANCHE ZA POBOLJŠANJE FUNKCIJE BUBREGA

 

 

Ključne riječi

Kratkovidnost lišavanja oblika; Formula koja sadrži Cistanche; Transformirajući faktor rasta- 2; Akvaporin 1; Caveolin-1; Remodeliranje bjeloočnice; Vodeni prijevoz

 

Posljednjih godina, s promjenama u načinu života ljudi i kontinuiranim razvojem elektroničkih uređaja, pojavnost kratkovidnosti je u porastu. Kao uobičajena bolest, postala je globalni zdravstveni problem. Kratkovidnost deprivacije oblika (FDM) posebna je vrsta miopije koja je obično uzrokovana deprivacijom ili smanjenjem vizualne stimulacije očiju. FDM ne samo da ometa proces remodeliranja bjeloočnice, već također dovodi do abnormalnih promjena u obliku očne jabučice i poremećaja funkcije prijenosa vode, što može dodatno pogoršati oštećenje i deformaciju tkiva bjeloočnice. Aquaporin 1 (AQP1) je široko rasprostranjen protein čija je glavna funkcija promicanje brzog transporta molekula vode kroz stanične membrane. U oku, distribucija i funkcija AQP1 povezani su s dinamičkom ravnotežom intraokularne tekućine. Caveolin-1 (CAV1) je protein uključen u stvaranje mikrostrukture stanične membrane i prijenos signala. U oku je CAV1 uglavnom prisutan u stanicama pigmentnog epitela retine i fotoreceptorskim stanicama, a povezan je s prijenosom vizualnih signala i stabilnošću intraokularnog okoliša. Transformirajući faktor rasta- 2 (TGF- 2) je pleiotropni citokin s višestrukim biološkim učincima kao što je poticanje stanične proliferacije, diferencijacije i migracije. U intraokularnom okruženju, TGF- 2 igra važnu ulogu u razvoju i održavanju rožnice i bjeloočnice. Trenutačno je glavno liječenje FDM terapija lijekovima.

U tradicionalnoj kineskoj medicini (TCM) vjeruje se da je nastanak kratkovidnosti povezan s čimbenicima kao što su nedovoljna količina qi-ja i krvi te nedostatak esencije bubrega. Bubreg se smatra "urođenim temeljem" i usko je povezan s funkcijom očiju. TCM smatra da "bubreg upravlja esencijom, a esencija hrani oči; jetra se otvara u oči, a dovoljno krvi iz jetre osigurava jasan vid". Stoga je toniziranje bubrega i njegovanje krvi uvijek bilo važno terapijsko načelo za očne bolesti uzrokovane sindromom nedostatka u TKM-u.

Cistanche, poznat kao "pustinjski ginseng" i jedan od "devet besmrtnih lijekova" u TCM-u, ima više od 2000 godina povijesti kao ljekovitog sastojka. Zabilježen kao vrhunski hranjivi ljekoviti materijal u starim klasicima TCM-a, Cistanche je visoko cijenjen zbog svojih učinaka toniziranja bubrega, obnavljanja esencije, njege krvi i vlaženja suhoće. Za razliku od mnogih drugih TCM biljaka, Cistanche raste isključivo u pustinjama, uglavnom parazitirajući na korijenju Tamarix ramosissima u regijama kao što su Xinjiang, Unutarnja Mongolija i Gansu u Kini. Jedinstveno pustinjsko okruženje obdaruje ga bogatim aktivnim sastojcima, uključujući ehinakozid, verbaskozid i flavonoide, za koje je znanstveno dokazano da imaju snažna antioksidativna svojstva, smanjuju apoptozu stanica i potiču proliferaciju stanica.

Suvremena istraživanja su pokazala da Cistanche ima značajne hranjive učinke na bubrege. Može smanjiti apoptozu bubrežnih stanica, potaknuti proliferaciju bubrežnih stanica, popraviti oštećene bubrežne stanice i proširiti bubrežne krvne žile, čime se poboljšava rad bubrega. Osim toga, Cistanche može poboljšati imunitet promicanjem proliferacije limfocita, oduprijeti se umoru povećanjem proizvodnje glikogena u jetri i ispoljiti učinke protiv starenja hvatanjem slobodnih radikala. Ove biološke aktivnosti su vrlo konzistentne s TCM teorijom o "toniziranju bubrega i hranjivoj esenciji", a također pružaju znanstvenu osnovu za njegovu primjenu u liječenju očnih bolesti. Na temelju terapeutskog principa TCM-a toniziranja bubrega i njege krvi, te kombinirajući suvremena farmakološka svojstva Cistanche, ova je studija zamijenila izvorne biljke koje njeguju krv i toniziraju bubrege s Cistancheom kako bi se formirala nova formula koja sadrži Cistanche, te istražila njezinu učinkovitost i mehanizam u liječenju FDM-a, s ciljem pružanja nove ideje za razvoj prirodnih biljnih lijekova terapije za kratkovidnost.

1 Materijali i metode

1.1 Pokusne životinje

Četrdeset muških SD štakora SPF stupnja, težine 180-200 g i starosti 6-8 tjedana, kupljeno je od Beijing Keyu Animal Breeding Center [Br. licence: SCXK (Jing) 2022-0004] i rutinski uzgajano u Laboratoriju za životinje Očne bolnice Kineske akademije medicinskih znanosti. Ovaj eksperiment bio je u skladu s relevantnim odredbama "Pravila o upravljanju pokusnim životinjama" i odobrilo ga je Povjerenstvo za medicinsku etiku Kineske akademije medicinskih znanosti Očne bolnice (Broj serije: YKEC-KT-2024-017-P001).

1.2 Glavni reagensi i instrumenti

Cistanche tubulosa (kupljen od Chengdu WeCistanche Bio-Tech. Co., Ltd., s aktivnim sastojcima uključujući ehinakozid veći ili jednak 30,0%, verbaskozid veći ili jednak 12,0%, i ukupne glikozide fenetilnog alkohola veći ili jednak 75,0%) korišten je kao osnovni medicinski materijal. Pirenzepin (PIR, Suzhou Hongsen Pharmaceutical Co., Ltd.); Compound Tropicamide kapi za oči (Hebei Jinyao Yongguang Pharmaceutical Co., Ltd., specifikacija 5 mL); 4 g·L⁻¹ oksibuprokain hidroklorid kapi za oči (Shandong Bausch & Lomb Freda Pharmaceutical Co., Ltd.); AQP1 antitijelo (Wuhan Fine Biotech Co., Ltd.); CAV1 antitijela (Wuhan Botu Biotechnology Co., Ltd.); -aktinsko antitijelo (Shanghai Jingke Chemical Technology Co., Ltd.); Kozji anti-zečji IgG (Wenzhou Kemiao Biotechnology Co., Ltd.); Komplet za bojenje HE (Shanghai Zeye Biotechnology Co., Ltd.).

1.3 Metoda modeliranja i grupiranje

Za uspostavljanje FDM modela korišteno je trideset štakora. Štakori su anestezirani intraperitonealnom injekcijom pentobarbital natrija (30 mg·kg⁻¹). Nakon čišćenja i dezinfekcije desnog oka povidon-jodom, na desno oko zalijepljena je neprozirna maska. Maska za oči svakodnevno je provjeravana zbog odvajanja ili curenja svjetlosti, te ponovno zalijepljena ako je labava. Lijevo oko je ostalo neliječeno. Nakon 4 tjedna deprivacije monokularnog oblika, na štakorima je obavljena binokularna retinoskopija i mjerenje aksijalne duljine. Kriteriji uspjeha za modeliranje: nakon cikloplegije, refraktivna pogreška izmjerena je retinoskopom ili automatskim refraktometrom, a deprivirano oko pokazalo je značajan kratkovidni pomak u refrakcijskom statusu [tj. razlika u binokularnoj refrakcijskoj pogrešci veća od ili jednaka 2 D smatrala se uspješnim modeliranjem, a prosječni miopski pomak depriviranog oka u usporedbi s kontrolnim okom bio je oko (-4,5 ± 1,2) D]. Svih 30 štakora je uspješno modelirano i podijeljeno u FDM skupinu, PIR skupinu i Cistanche formulu skupinu, s 10 štakora u svakoj skupini. Preostalih 10 nemodeliranih štakora služilo je kao normalna skupina.

1.4 Metode intervencije

Normalna skupina i FDM skupina nisu primile nikakvu intervenciju. PIR skupini je davano 5 kapi PIR kapi za oko u desno oko dva puta dnevno (ujutro i navečer) u razmaku od 2 minute tijekom 15 dana. U skupinu formule Cistanche intervenirano je formulom koja sadrži Cistanche. Cistanche tubulosa (50 g, glavni sastojak) je otopljena u vodi i koncentrirana u medicinsku otopinu s koncentracijom od 1000 g·L⁻¹. Štakorima je dana intragastrična primjena u dozi od 12,70 g·kg⁻¹ jednom dnevno tijekom 15 dana. Doziranje Cistanche je određeno na temelju iskustva kliničke primjene i suvremenih farmakoloških istraživanja, osiguravajući učinkovite koncentracije aktivnih sastojaka kao što su echinacoside i verbascoside.

1.5 Metode detekcije

1.5.1 Procjena refrakcijske pogreške i promjena aksijalne duljine

Detekcija morfološke i refrakcijske pogreške: Dvadeset četiri sata nakon završetka deprivacije oblika, 3 štakora su nasumično odabrana iz svake skupine za detekciju. Prije eksperimenta, štakori su stavljeni u okolinu prilagođenu tami na 30 minuta, zatim su anestezirani udisanjem izoflurana i fiksirani na poseban držač za životinje. Za panoramsko skeniranje očne jabučice korišten je OCT slikovni sustav visoke rezolucije. Tijekom skeniranja, sonda je podešena da bude okomita na rožnicu kako bi se dobile jasne slike presjeka mrežnice i leće. Svako je oko skenirano 3 puta uzastopno, a aksijalna udaljenost od prednje površine rožnice do sloja retinalnog pigmentnog epitela (tj. aksijalna duljina) automatski je izmjerena ugrađenim softverom sustava kako bi se izračunala sferna ekvivalentna greška loma. Kako bi se osigurala točnost podataka, dva stručno osposobljena istraživača neovisno su analizirala slike na slijepi način. Ako je razlika između dva rezultata mjerenja bila veća od 0,50 D, podaci su odbačeni i ponovno izmjereni. Potvrdna detekcija aksijalne duljine: Za provjeru rezultata OCT mjerenja također je korišten ultrazvučni dijagnostički instrument A-scan. Prvo su štakorima ukapane kapi za oči oksibuprokain hidroklorida u oba oka za topikalnu anesteziju, a zatim je A-scan sonda nježno stavljena u kontakt s rožnicom. Instrument je podešen na ručni način rada, a točna brzina širenja ultrazvuka postavljena je prema intraokularnom mediju: 1540 m·s⁻¹ za prednju komoru i staklasto tijelo. Tijekom rada, svako je sučelje locirano ručnim označavanjem, a svako je oko izmjereno 3 puta više puta kako bi se dobila prosječna vrijednost. Ovaj eksperiment je izveden na slijepi način, a svi su operateri prošli jedinstvenu obuku kako bi se osigurala dosljedna tehnika mjerenja. Instrument je kalibriran prije mjerenja, a neki su uzorci nasumično odabrani za testiranje ponovljivosti kako bi se procijenili koeficijenti korelacije unutar klase i međuklase (ICC). Tijekom eksperimenta slijedile su se stroge standardizirane operativne procedure kako bi se osigurala znanstvenost i pouzdanost podataka.

1.5.2 HE bojenje

Nakon otkrivanja refrakcijske pogreške i aksijalne duljine, štakori su žrtvovani prekomjernom anestezijom. Očni kapci i okolna tkiva oba oka su dezinficirani, a nazalni i temporalni limbus okomit na središnju točku rožnice su označeni. Konjunktiva je zarezana prema oznakama, a očna jabučica je enukleirana. Limbus je zarezan kako bi se uklonilo tkivo prednjeg segmenta i staklasto tijelo, a skleralno tkivo je zadržano. Tkivo bjeloočnice je fiksirano s 40 g·L⁻¹ paraformaldehida tijekom 24 sata, dehidrirano s gradijentom etanola, rutinski uklopljeno u parafin, pročišćeno ksilenom, pričvršćeno neutralnim balzamom, presječeno na 5 μm, obojeno HE i promatrane morfološke promjene tkiva bjeloočnice pod optičkim mikroskopom.

1.5.3 Imunohistokemijsko bojenje ekspresije TGF- 2 u tkivu bjeloočnice

Dva štakora su odabrana iz svake skupine. Sekcije tkiva bjeloočnice podvrgnute su pronalasku i blokiranju antigena, inkubirane s mišjim anti-TGF- 2 (1:3000) 24 sata, isprane, inkubirane sa sekundarnim antitijelima (1:2000) 1 sat, rutinski razvijene i obojene, nanesene neutralnim balzamom, a 2-3 slike su snimljene pod optičkim mikroskopom da se promatraju promjene tkiva. Vrijednost sive boje pozitivnog dijela detektirana je sustavom za analizu slike.

1.5.4 Western blot detekcija razina ekspresije proteina AQP1 i CAV1 u tkivu bjeloočnice

Dva štakora su odabrana iz svake skupine. Tkivo bjeloočnice je izrezano, homogenizirano, a ukupni protein je ekstrahiran dodavanjem pufera za lizu RIPA. Provedena je denaturacija proteina, kvantifikacija, elektroforeza, membranski prijenos i blokiranje. Dodana su primarna antitijela AQP1 (1:1000), CAV-1 (1:3000) i -aktinsko antitijelo (1:2000) i inkubirana preko noći na 4 stupnja. Dodano je sekundarno antitijelo (1:2000) i inkubirano na sobnoj temperaturi 1 sat. Dodan je ECL reagens, a vrijednost proteinskog sive je analizirana softverom Image Lab. Omjer vrijednosti sive ciljne trake prema onoj za -aktin bio je njegova relativna razina ekspresije.

1.5.5 RT-PCR detekcija ekspresije GLAST i GLT-1 mRNA u skleralnom tkivu

Uzeto je preostalo tkivo sklere štakora, a ukupna RNA ekstrahirana je prema Trizol metodi. Ukupna RNA izmjerena je spektrofotometrom, a cDNA je obrnuto transkribirana prema uputama kita. RT-PCR reakcijski sustav pripremljen je sa sljedećim reakcijskim uvjetima: 75 stupnjeva za 30 s, 85 stupnjeva za 60 s, 80 stupnjeva za žarenje 30 s, 65 stupnjeva za produženje 30 s, ukupno 40 ciklusa. Uz -aktin kao internu referencu, relativne razine ekspresije glutamat-aspartat transportera (GLAST) i glutamat transportera 1 (GLT-1) izračunate su metodom 2⁻ΔΔCt. Prajmer sekvence prikazane su u tablici 1. Jednosmjerna analiza varijance korištena je za usporedbu između skupina, a LSD-t test korišten je za parnu usporedbu između skupina. Razina testa:=0.05.