Učinak ekstrakata Cistanche Tubulosa na mušku reproduktivnu funkciju kod streptozotocina–nikotinamidom izazvanih dijabetičkih štakora-Ⅱ

3.2. In vivo analiza

3.2.1. Učinci CTE na tjelesnu težinu i unos kalorija

Nakon 6 tjedana eksperimentiranja, dijabetička skupina (HFD-DM) pokazala je veću tjelesnu težinu od kontrolne skupine. Skupina HFD-DME4 pokazala je nižu tjelesnu težinu od skupina HFD-DM i HFD-DMER (Slika 7a). Unos kalorija kontrolne skupine bio je znatno manji nego u ostalim skupinama. Nije bilo značajne razlike između unosa kalorija ostalih pet skupina (Slika 7b).

3.2.2. Oralni test tolerancije glukoze (OGTT) za određivanje uspješne indukcije dijabetesa

Oralni test tolerancije glukoze (OGTT) koristi se kao obećavajući alat za otkrivanje šećerne bolesti. Povećana razina glukoze u krvi ukazuje na stanje dijabetesa. Kao što je prikazano na slici 8a, razina glukoze u plazmi bila je niža u skupinama s CTE nego u skupini s DM u 0, 30, 90 i 120 min. Nadalje, površina ispod krivulje (AUC) koncentracije glukoze u plazmi pokazala je da je u skupinama s CTE i RSG stopa unosa glukoze u krvi bila povećana (Slika 8b).

3.2.3. Ukupni sadržaj glukoze, kolesterola i triglicerida u plazmi

Razina glukoze u krvi natašte bila je viša u skupini DM i niža u skupini DME2 (osim kontrolne) nego u ostalima. Nije bilo značajne razlike u ukupnom kolesterolu između skupina osim za DME4 skupinu. U skupini DME4 razina kolesterola bila je niža od ostalih. Razina triglicerida bila je viša u skupini DM, a niža u skupini DME4, a sadržaj triglicerida se smanjivao s porastom koncentracije CTE (Tablica 2). Rezultati pokazuju da je razina glukoze, kolesterola i triglicerida u plazmi bila viša u skupini DM, a razina je značajno smanjena pri liječenju CTE-om.

3.2.4. Razina inzulina u plazmi, razina leptina u plazmi i procjena modela homeostaze – vrijednosti inzulinske rezistencije (HOMA-IR)

Razine plazmatskog inzulina, leptina i vrijednosti HOMA-IR prikazane su u tablici 3. DM grupa imala je više plazmatske razine inzulina i leptina u plazmi nego kontrolna skupina. Indeks HOMA-IR također je bio značajno viši u skupini DM. Vrijednosti inzulina, leptina i HOMA-IR u plazmi smanjene su s porastom koncentracije CTE. Leptin u plazmi bio je značajno smanjen u CTE skupinama, ali RSG skupina lijekova (DMR) nije pokazala nikakvu značajnu razliku u odnosu na DM skupinu.

3.2.5. Učinak CTE na razine LH i testosterona u plazmi kod dijabetičkih štakora

Kao što je prikazano u tablici 4, koncentracije testosterona u dijabetičkih štakora (DM) značajno su smanjene, dokkoncentracije testosterona bile su značajno povećanepri različitim dozama CTE. Nadalje, rezultati su pokazali blago smanjenje razine LH u skupini DM u usporedbi s DMR, DME1, DME2 i DME4. Proizvodnja LH bila je veća u DME4 skupini.

3.2.6. Učinak CTE na parametre sperme dijabetičkih štakora

Eksperimentalni rezultati pokazali su da je skupina DM imala značajno smanjenje broja i pokretljivosti spermija od kontrolne skupine, dok je stopa abnormalnosti spermija značajno povećana u skupini DM. Zanimljivo je da su se broj spermija, pokretljivost spermija i stopa abnormalnosti spermija u DMR skupini poboljšali, ali pokretljivost spermija ne doseže značajnu razinu u usporedbi s DME4. DME2 je pokazao bolji broj spermija od svih njih, a stopa pokretljivosti bila je značajno povećana u skupini DME4. Nije bilo značajne razlike između broja abnormalnih spermija između skupina liječenih RSG-om i CTE-om (Tablica 5).

3.2.7. Učinak CTE na morfologiju seminifernih tubula kod štakora s dijabetesom

Slika 9 prikazuje H&E bojenje dijela testisa. Crna strelica označava Leydigovu ćeliju, a bijela strelica označava Sertolijevu ćeliju. I Leydigove stanice i Sertolijeve stanice u skupini s DM pokazale su značajnu atrofiju i uočena je šupljina u lumenu. Struktura Leydigovih stanica i Sertolijevih stanica obnovljena je u skupinama tretiranim s CTE i RSG. Debljina sjemenog tubula bila je veća u skupinama s CTE i RSG nego u skupini s DM.

3.2.8. Učinak CTE na KiSS1, GPR54, SOCS-3 i SIRT1 MRNA u hipotalamusu dijabetičkih štakora

Ekspresija KiSS1 (Slika 10a), GPR54 (Slika 10b), SOCS-3 (Slika 10d) i SIRT1 (Slika 10c) prikazana je na Slici 10. Ekspresija mRNA KiSS1 i receptora GPR54 u dijabetičkih štakora bila je znatno manji nego u kontrolnoj skupini. Razine ekspresije KiSS1 i GPR 54 mRNA u DMR, DME1, DME2 i DME4 bile su značajno povećane. Konkretno, ekspresija mRNA GPR54 bila je značajno povećana u DME4 i bila je gotovo slična kontrolnoj skupini.

PRIRODNA CISTANCHE TUBULOSA ZA ŠTITU PROIZVODNJE TESTOSTERONA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Ovaj eksperiment dodatno je istraživao količinu SOCS-3 i SIRT1 mRNA u hipotalamusu štakora. Ekspresija SOCS-3 mRNA u dijabetičkih štakora bila je značajno povećana što ukazuje da je leptinska impedancija bila ozbiljnija. Skupine DMR, DME1, DME2 i DME4 pokazale su značajna poboljšanja u usporedbi sa skupinom dijabetičara. Ekspresija mRNA SIRT1 u skupini s DM značajno je smanjena i značajno povećana u skupinama s DME1 i DME4.

3.2.9. Učinak CTE na antioksidativne enzime u plazmi i testisima dijabetičkih štakora

Tablica 6 pokazuje da su aktivnost SOD u plazmi, aktivnost GPx i aktivnost katalaze dijabetičkih štakora značajno smanjene, a aktivnosti povećane u skupinama tretiranim s CTE-om i RSG-om. Uz to, DME4 je pokazao značajna poboljšanja u GPx aktivnosti od ostalih. Rezultati su pokazali da su aktivnosti SOD i katalaze kod štakora s dijabetesom značajno smanjene nakon šest tjedana. Aktivnost SOD i katalaze skupine DMR ne doseže značajnu razinu. Skupine liječene CTE-om pokazale su značajna poboljšanja u aktivnosti SOD i katalaze. Povećane aktivnosti katalaze i SOD u CTE skupinama također su uočene u testisima (Tablica 7). Najveća aktivnost SOD i katalaze uočena je u skupini DME1 odnosno DME2 skupini.

3.2.10. Učinci CTE-a na oksidativni stres i upalu u plazmi i testisima dijabetičkih štakora

Proizvodnja dušikovog oksida (NO) u plazmi (Slika 11a) i testisima (Slika 11b) prikazana je na Slici 11. Proizvodnja NO u skupini DM bila je značajno povećana iu testisima i u plazmi u usporedbi s kontrolnom skupinom. Uočeno je postupno smanjenje proizvodnje NO u skupinama DME1, DME2 i DME4 (u plazmi). DMR grupa također je pokazala značajno smanjenje proizvodnje NO. U slučaju testisa, primijećeno je lagano smanjenje proizvodnje NO u CTE skupinama, dok DMR skupina nije značajno smanjila proizvodnju NO.

Kao što je prikazano na slikama 12 i 13, razine TNF- i IL-6 bile su značajno povećane kod štakora s dijabetesom (i u plazmi i u testisima), što ukazuje da je upala ozbiljnija. U plazmi je razina TNF-a slična u skupinama liječenim CTE-om i RSG-om (Slika 12a). CTE skupine su značajno (osobito DME2) smanjile razinu TNF-a u testisu (Slika 12b). Razina IL-6 značajno je smanjena u plazmi CTE i RSG skupina (Slika 13a). U testisu je postojao trend smanjenja razine IL-6, ali to nije dosegnulo značajnu razinu (Slika 13b).

3.2.1.1. Učinci CTE-a na oksidativni stres i upalu u spermatozoidima dijabetičkih štakora izazvanu prehranom bogatom mastima

Slika 14 prikazuje sadržaj superoksidnog aniona u spermi štakora. Rezultati su pokazali da se proizvodnja superoksidnog aniona u spermi dijabetičkih štakora značajno povećala, a nije bilo značajnog poboljšanja u DMR skupini. Skupine DME1 i DME4 pokazale su značajno smanjenu proizvodnju superoksidnog aniona.

3.2.12. Učinci CTE na peroksidaciju lipida u spermatozoidima dijabetičkih štakora izazvanu prehranom bogatom mastima

Studije su pokazale da je peroksidacija lipida povećana i kod pacijenata s dijabetesom tipa 1 i tipa 2 [19]. Razina malondialdehida (MDA) u plazmi, spermi i testisima prikazana je u tablici 8. Razina MDA u plazmi, testisima i spermi skupine DM bila je značajno viša, a tretman s CTE i RSG smanjio je proizvodnju MDA. Uočeno je značajno smanjenje u skupinama DME4 i DMEI u plazmi. Ova je studija otkrila da štakori s dijabetesom ne samo da su povećali stupanj lipidne peroksidacije u plazmi, već i povećali u testisima i spermi. Uočeno je značajno poboljšanje pri različitim dozama CTE.

4. Rasprava

Dijabetes je kronična bolest povezana s visokom razinom šećera u krvi. Neravnoteža između razine antioksidansa i ROS-a dovest će do stanja koje se naziva oksidativni stres. Superoksid, hidroksilni radikal, vodikov peroksid, dušikov oksid i singletni kisik neki su od primjera ROS koji će pridonijeti dijabetesu putem oksidativnog stresa [20].Cistanche tubulosaje pustinjska biljka koja sadrži aktivne komponente kao što supolisaharidi, oligosaharidi, feniletanoidni glikozidi (ehinakozid, verbaskozid), palmitinska kiselina, linolna kiselina, iridoidi, alditoli i lignani. Ova biljka može proizvesti protuupalne, neuroprotektivne, antibakterijske, antivirusne, antioksidativne, antitumorske i imunomodulatorne učinke [21]. Studije literature pokazuju da su feniletanoidni glikozidi iz Cistanche tubulosa glavni razlog za antioksidativno djelovanje [22]. Resveratrol (RES) i rosiglitazon (RSG) uzeti su kao pozitivna kontrola za in vitro odnosno in vivo studije. RSG je snažan inzulinski senzibilizator i ima afinitet prema izoformi receptora aktiviranog proliferatorom peroksisoma (PPARc). Kontrolira hiperglikemiju kod dijabetičara [23]. RES ima prirodno antioksidativno djelovanje i djeluje kao vazodilatator, regulirajući metabolizam lipoproteina, inhibirajući agregaciju trombocita i sprječavajući rak [24,25]. Naše je istraživanje pokazalo da ECH pokazuje bolju aktivnost hvatanja radikala nego CTE i RES (Slika 1). Također se podrazumijeva da ECH ne uzrokuje značajnu toksičnost za LC-540 i TM3 Leydigove stanice (Slika 2).

PRIRODNA CISTANCHE TUBULOSA ZA MUŠKU SEKSUALNU FUNKCIJU PHGS75% ECH 30% ACT 12%

AGE-i su korišteni za izazivanje stanja stresa u Leydigovim stanicama. Proizvodnja AGE-a, upala, oksidativni stres i dijabetes međusobno su povezani. Hiperglikemijsko stanje dijabetesa potiče ozljedu stanica kroz proizvodnju AGE-a i oksidativni stres. AGE izazivaju toksičnost stanica, što dodatno potiče regrutiranje imunoloških stanica i staničnu smrt. Povišena razina AGE-a potiče ekspresiju dviju vrsta receptora zvanih RAGE i AGER1 [26]. Kapanje i kasniji prijenos elektrona iz dišnog lanca mitohondrija u molekularni kisik tijekom oksidativnog stresa rezultira stvaranjem superoksidnog aniona. Naši rezultati pokazuju da je proizvodnja superoksidnog aniona inducirana AGE-ima povećana u kontrolnoj skupini, a daljnja poboljšanja primijećena su i kod tretmana ECH i RES. Prema našem istraživanju, pokazalo se da je proizvodnja superoksida (Slika 3) i H2O2 (Slika 4) izazvana AGE-ima smanjena u prisutnosti ECH i RES.

NF-κB je poznat kao važan medijator upale povezane s dijabetesom [27]. Ekspresija NF-κB dovodi do stanične disfunkcije i stanične smrti. Aktivacija NF-κB oksidativnim stresom stimulira proupalni odgovor, regulaciju endotelina i apoptozu [28]. Ekspresija RAGE i NF-κB povećana je u skupinama stimuliranim AGE-om, a naknadno smanjenje primijećeno je u stanicama tretiranim ECH i RES (Slika 5).

Testosteronje anabolički steroid i primarnimuški spolni hormonsintetiziran iz kolesterola. Proces počinje oksidativnim cijepanjem bočnog lanca kolesterola pomoću gena za cijepanje bočnog lanca kolesterola (CYP11A). Ovaj gen je lokaliziran u mitohondrijskoj membrani i pretvara kolesterol u pregnenolon. Zatim, gen CYP17A1 iz endoplazmatskog retikuluma uklanja dva dodatna atoma ugljika i proizvodi više steroida C19. Uz to, pregnenolon se oksidira u androstendion/progesteron pomoću hidroksisteroid dehidrogenaze (3- -HSD). Konačno, testosteron se proizvodi redukcijom keto skupine na 17. poziciji ugljika androstenediona 17-beta-hidroksisteroid dehidrogenazom (17- -HSD). Leydigove stanice sudjeluju u glavnoj proizvodnji testosterona. Prijenos kolesterola u unutarnju membranu mitohondrija zahtijeva djelovanje steroidogenog akutnog regulatornog proteina (StAR). Sadašnje studije pokazuju da je ekspresija StAR, CYP11A1, CYP17A1 i HSD17 3 smanjena u stanicama tretiranim AGE-om (kontrola), a zabilježeno je ogromno povećanje u stanicama tretiranim ECH-om i RES-om (Slika 6). . Dakle, rezultati pokazuju da je proizvodnjatestosteron je povećan u skupinama koje su primale ECH i RES. 

PRIRODNA CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE SEKSUALNE SNAGE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Tijekom dijabetičkog stanja, transport glukoze do organa je ograničen i kao rezultat se povećava razina glukoze [29]. Stoga je hiperglikemijsko stanje jedan od važnih pokazatelja za otkrivanje dijabetesa. Naše studije pokazuju da je razina glukoze u plazmi bila povećana u skupinama dijabetičara, a AUC skupine DM bila je značajno viša nego u drugim skupinama (Slika 8). Uz glukozu u plazmi, sadržaj ukupnog kolesterola i triglicerida bio je značajno povećan u skupini sa DM (Tablica 2). Aterosklerozu pogoduje povišena razina kolesterola i triglicerida [30]. Međutim, razina kolesterola i triglicerida smanjena je u skupinama liječenim CTE-om i RSG-om. Sadržaj triglicerida u DME4 skupini dosegao je gotovo slične vrijednosti kao u kontrolnoj skupini.

Inzulin je hormon koji proizvode stanice gušterače i funkcionalan je za kontrolu razine šećera u krvi u tijelu, dok je leptin hormon koji proizvode adipociti koji su sposobni regulirati unos hrane i korištenje energije. Studije su pokazale da je leptin uključen u patofiziologiju pretilosti i da postoji pozitivna interakcija između leptina i inzulina [31]. Naše studije pokazuju da su razine inulina i leptina u plazmi bile više u skupini DM, a razina inzulina je smanjena s povećanjem koncentracije CTE. Skupina RSG ne pokazuje nikakvu značajnu razliku od skupine DM. Inzulinska rezistencija i funkcija stanica procijenjeni su HOMA-IR metodom. Vrijednost HOMA-IR porasla je u skupini DM i značajno se razlikovala od ostalih skupina (Tablica 3).

DM utječe na reproduktivnu funkciju putem hormonalne promjene u HPG osi, a studije su otkrile da dijabetes također utječe na ekspresiju inzulina u testisima. Karakterizira ga vakuolizacija Sertolijevih stanica, povećana fragmentacija DNA, oslabljena spermatogeneza i povećano smanjenje zametnih stanica. Oksidativni stres također pridonosi abnormalnostima reproduktivne funkcije [32]. Proces stvaranja sperme u muškom spolnom organu (testisu) naziva se spermatogeneza. Testis se sastoji od čvrsto smotanih tubula koji se nazivaju sjemenonosni tubuli. Sertolijeve stanice vidljive su u stijenkama sjemenog tubula i osiguravaju hranu nezrelom spermiju. Ispitivanje parametara sperme pokazalo je da se broj spermija i pokretljivost smanjili, a abnormalnosti su se povećale u skupini sa DM (Tablica 5). Suprotan učinak primijećen je u skupinama liječenim CTE-om i RSG-om. I Leydigove stanice i Sertolijeve stanice u skupini s DM-om pokazale su značajnu atrofiju i šupljina se vidjela u lumenu. Debljina sjemenog tubula također se smanjila u skupini DM. Uočen je bolji rezultat u skupinama liječenim CTE-om i RSG-om (Slika 9). Uz to, razina LH i testosterona smanjila se u skupini DM, a razine su porasle u skupinama liječenim CTE-om (Tablica 4). U muškaraca, niska razina testosterona u serumu i niža frekvencija LH pulsa često su povezani s pretilošću i dijabetes melitusom tipa 2 [33].

Kisspeptini kodirani genom KiSS1 poznati su kao moćni stimulatori HPG osi i svaka mutacija u genu za kisspeptin dovest će do niskih razina spolnih steroida i gonadotropina. Studije pokazuju da su kod štakora s dijabetesom izazvanim STZ-om razine Kiss1 mRNA bile smanjene [33]. Početak i održavanje neplodnosti kod sisavaca povezani su s G-protein spregnutim receptorom 54 (GPR54). Mutaciju u GPR 54 karakterizira izostanak spolnog sazrijevanja i niske razine gonadotropnih hormona (LH i FSH). Proupalni citokini kao što su IL-6 i TNF-reguliraju ekspresiju supresora signalizacije citokina 3 (SOCS3) koji je uključen u inzulinsku rezistenciju u jetri i adipocitima posredovanu upalom [34]. SIRT 1 je gen povezan s regulacijom nekoliko bolesti starenja. Ovaj gen je izrazito izražen u stanicama gušterače i regulira lučenje inzulina te sprječava apoptozu. Aktualne studije pokazale su da se ekspresija KiSS1, GPR54 i SIRT1 smanjila u skupini DM, ali se ekspresija povećala u skupinama liječenim CTE (Slika 10). Povećanje ekspresije SOCS-3 u skupini DM ukazuje na upalno stanje. Prva molekularna veza identificirana između pretilosti i upale bila je TNF-. Stoga je povećana razina TNF-a pokazatelj upale. Smanjena razina proupalnih citokina kao što su TNF- i IL-6 primijećena je u skupinama liječenim CTE (slike 12 i 13).

Neravnoteža između ROS i antioksidansa dovodi do dijabetičkog stanja. Superoksid dismutaza (SOD), katalaza (CAT) i glutation peroksidaza (GPX) poznati su kao primarni antioksidansi odgovorni za održavanje optimalne razine ROS [35]. Iz rezultata je utvrđeno da je aktivnost antioksidansa bila znatno niža u skupini DM. Skupine tretirane CT-om pokazale su poboljšanja u proizvodnji antioksidansa. Skupina liječena RSG-om nije pokazala nikakva značajna poboljšanja u antioksidativnoj aktivnosti (tablice 6 i 7).

Dušikov oksid (NO) poznat je kao važan ROS koji pridonosi upali. Naše studije pokazuju da je razina NO smanjena u skupinama liječenim CTE-om (Slika 11). Rezultati su pokazali da se sadržaj superoksidnog aniona u spermi dijabetičkih štakora značajno povećao i nije bilo značajnog poboljšanja nakon primjene RSG-a. Proizvodnja superoksida smanjena je u CTE skupinama.

Određivanje MDA vrlo je korisno za procjenu peroksidacije lipida. Peroksidacija lipida je proces oksidacije lipida koji na kraju rezultira oštećenjem stanica. MDA nastaje kao rezultat lipidne peroksidacije višestruko nezasićenih masnih kiselina. Studije pokazuju da je razina MDA u korelaciji s dobi i razinom glukoze u krvi natašte [36]. Trenutna studija pokazala je da CTE poboljšava peroksidaciju lipida u plazmi, testisima i spermi (Tablica 8).

PRIRODNA CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE SEKSUALNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

5. Zaključci

Oksidativni stres tijekom dijabetičkih stanja remeti muški reproduktivni sustav kroz oštećenje sperme i disfunkciju gonada. Cistanche tubulosa je pustinjska biljka široko prihvaćena u kineskoj medicini zbog svojih farmakoloških učinaka.Ehinakozid (ECH)je glavni sastojak CTE-a odgovoran za njegove antioksidativne i protuupalne aktivnosti. Naši rezultati in vitro pokazali su da je ECH obnovio put sinteze testosterona i smanjio razinu ekspresije NF-κB i RAGE proteina. ECH je učinkovito inhibirao proizvodnju superoksidnog aniona i H2O2 u Leydigovim stanicama. Studije in vivo otkrile su da je ECH smanjio razine kolesterola, triglicerida, TNF-a i IL-6. Uz to, ekspresija mRNA u hipotalamusu dijabetičkih štakora značajno se poboljšala. Također je važno napomenuti da je ECH smanjio peroksidaciju lipida i poboljšao inzulinsku rezistenciju kod muških štakora s dijabetesom. Antioksidativna aktivnost povećana je u plazmi i testisima. Stoga su naše studije pokazale da ECH pruža učinkovitu zaštitu od reproduktivne disfunkcije kod muških štakora s dijabetesom izazvanih STZ-om.