Echinacoside štiti od 6-mitohondrijske disfunkcije inducirane hidroksidopaminom i upalnih odgovora u PC12 stanicama putem smanjenja proizvodnje ROS-a

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

Yue-Hua Wang,1,2 Zhao-Hong Xuan,3 Shuo Tian,1 i Guan-Hua Du1,2

Parkinsonova bolest (PD) je neurodegenerativni poremećaj karakteriziran progresivnim gubitkom dopaminergičkih (DA) neurona na substantia nigra. Mitohondrijska disfunkcija i upalni odgovori uključeni su u mehanizam oštećenja stanica kod PD-a. 6-Hidroksidopamin (6-OHDA), analog dopamina, specifično oštećuje dopaminergičke neurone.Ehinakozid(ECH) je feniletanoidni glikozid izoliran iz stabljikaCistanche salsa, pokazujući različite neuroprotektivne učinke u prethodnim studijama. Cilj ove studije bio je istražiti njegov učinak protiv 6-OHDA-inducirane neurotoksičnosti i mogućih mehanizama u stanicama PC12. Rezultati su pokazali da 6-OHDA smanjuje vitalnost stanica, smanjuje aktivnost redukcije oksidacije, smanjuje potencijal mitohondrijske membrane i inducira apoptozu posredovanu mitohondrijima u usporedbi s netretiranim PC12 stanicama. Međutim,ehinakozidliječenje je značajno ublažilo ove promjene izazvane 6-OHDA. U Dodatku,ehinakozidtakođer može značajno ublažiti upalne reakcije izazvane 6-OHDA. Daljnja su istraživanja pokazala daehinakozidmogao smanjiti 6-OHDA-induciranu proizvodnju ROS-a u stanicama PC12. Ovi rezultati sugeriraju da je temeljni mehanizamehinakozidprotiv 6-neurotoksičnosti izazvane OHDA možda uključuje smanjenje mitohondrijske disfunkcije i upalnih odgovora smanjenjem proizvodnje ROS.

1. Uvod

Parkinsonova bolest (PD)je neurodegenerativni poremećaj karakteriziran polagano progresivnom degeneracijom dopaminskih neurona u substantia nigra pars compacta [1]. Iako su neuropatološka obilježja PD-a dobro opisana, etiologija je još uvijek nedefinirana. Naime, nekoliko opažanja sugerira da je mitohondrijska disfunkcija uključena u patogenezu PD-a i degeneraciju dopaminergičkih neurona [2, 3]. Mitohondriji sadrže mnoge redoks enzime i prirodne neučinkovitosti oksidativne fosforilacije stvaraju reaktivne kisikove vrste (ROS) [4]. Nedavno je sve više dokaza iz studija na ljudima i životinjama sugeriralo da neuroupala također značajno pridonosi gubitku neurona kod PD-a [5].

6-Hidroksidopamin (6-OHDA) je specifičan za dopaminergičke neurone u intrastrijatalnim modelima glodavaca i u nekim stanicama [6-11]. Stanica PC12 postala je popularan stanični model za istraživanje PD jer ova stanična linija posjeduje mnoge karakteristike DAergičkih neurona. Korišten je kao in vitro model za proučavanje PD-a i za određivanje učinka zaštitnih i terapijskih sredstava. Ehinakozid (Slika 1) je feniletanoidni glikozid izoliran i pročišćen iz stabljikaCistanche salsa[12], parazitska biljka porijeklom iz sjeverozapadne Kine, koja se koristi kao pokušaj temeljnih mehanizama ehinakozida protiv 6-OHDA-induciranih oštećenja u stanicama PC12.

2. Materijali i metode

2.1. Materijali. Echinacoside je dobiven od Nacionalnog instituta za kontrolu hrane i lijekova (Peking, Kina). RPMI-1640 i fetalni goveđi serum dobiveni su od Gibca

(Grand Island, NY, SAD). 6-OHDA, MTT, 2,7-diklorodihidrofluorescein diacetat, propidij jodid (PI) i resazurin kupljeni su od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SAD). Komplet za bioluminiscentni test ATP-a nabavljen je od Promege (Madison, SAD). 5,5,6,6 -tetrakloro-1,1,3,3 -tetraetil benzimidazolil karbocijanin jodid (JC-1) komplet za analizu dobiven je od Beyotime Institute of Biotechnology (Haimen, Jiangsu, Kina). Cytochrome C ELISA komplet i fluorogenski supstrat Ac-DVD-AMC nabavljeni su od Invitrogena (Carlsbad, CA, USA). IL-1 i IL-6 ELISA setovi dobiveni su od Boster Bio-engineer limited company (Wuhan, Kina). Čitač mikropločica Spectramax M5 kupljen je od tvrtke Molecular Devices (Sunnyvale, CA, SAD).

2.2. Kultura stanica i liječenje. Stanice PC12 uzgajane su u RPMI-1640 s dodatkom 10 posto konjskog seruma i 5 posto fetalnog goveđeg seruma. Uvjeti su održavani na 37∘C u vlažnoj atmosferi koja je sadržavala 5 posto CO2 [19]. Stanice su stavljene u 96-pločice s jažicama pri gustoći od 2 × 105 stanica/mL. Nakon 80 posto konfluencije, stanice su prethodno inkubirane s različitim koncentracijama ehinakozida u mediju RPMI-1640 bez seruma tijekom 1 sata. Zatim je u jažice dodan 6-OHDA u konačnoj koncentraciji od 100 M i inkubiran još jedanput. Nakon tretmana, morfološke promjene promatrane su pod mikroskopom. Vijabilnost stanica procijenjena je MTT testom [19]. Ukratko, nakon tretmana, MTT u konačnoj koncentraciji od 0,5 mg/mL je dodan u svaku jažicu i inkubiran 4 sata na 37∘C.

2.3. Morfološke promjene i ispitivanje vitalnosti PC12 stanica. Nakon tretmana pod mikroskopom su promatrane morfološke promjene. Vijabilnost stanica procijenjena je MTT testom [19]. Ukratko, nakon tretmana, MTT u konačnoj koncentraciji od 0.5 mg/mL dodan je u svaku jažicu i inkubiran 4 sata na 37∘C. Zatim je supernatant uklonjen i produkt formazana je otopljen u 100 L dimetil sulfoksida uz miješanje 15 minuta na mućkalici za mikrotitarske ploče, a apsorbancija je očitana na 570 nm pomoću čitača mikropločica Spectramax M5. Komplementarna i alternativna medicina utemeljena na dokazima

2.4. Određivanje razine unutarstaničnog ATP-a. Stanična razina ATP-a izmjerena je s priborom za bioluminiscentnu analizu ATP-a prema uputama proizvođača. Luminescencija je praćena na čitaču mikropločica u modu luminescencije nakon dodatka 100 L luciferina i luciferaze [20].

2.5. Mjerenje oksidacijsko-redukcijske aktivnosti mitohondrija Resazurinom. Nakon tretmana, u jažice je dodan resazurin u konačnoj koncentraciji od 5 M i ispitan je intenzitet fluorescencije pri ekscitaciji od 530 nm i emisiji od 590 nm [21].

2.6. Mjerenje potencijala mitohondrijske membrane pomoću JC-1. Potencijal mitohondrijske membrane mjeren je pomoću kompleta za ispitivanje JC-1 prema uputama proizvođača. Nakon tretmana, medij kulture je uklonjen i napunjen s JC-1 otopinom 15 minuta na 37∘C u mraku. Intenzitet fluorescencije omjera crveno/zeleno određen je pri ekscitaciji od 490 nm i emisiji od 530 nm (zeleni fluorescentni monomeri) odnosno 590 nm (crveni fluorescentni agregati) [22].

2.7. Kvantifikacija otpuštanja citokroma C. Citosolne razine citokroma C mjerene su pomoću ELISA kita prema uputama proizvođača [23]. Ukratko, nakon tretmana, stanice su lizirane i centrifugirane na 1000 g tijekom 15 minuta, a zatim je supernatant sakupljen kao citoplazmatska frakcija i korišten za mjerenje otpuštanja citokroma C.

2.8. Određivanje aktivnosti kaspaze-3. Aktivnost kaspaze-3 izvedena je prema referencama s modifikacijama [24]. Ukratko, nakon tretmana, pufer za lizu je dodan u svaku jažicu i nakon toga je uslijedilo centrifugiranje na 12 000 g tijekom 10 minuta. Aktivnost kaspaze-3 ispitana je u rezultirajućim supernatantima mjerenjem proteolitičkog cijepanja fluorogenog supstrata Ac-DVD-AMC s valnom duljinom ekscitacije od 380 nm i valnom duljinom emisije od 460 nm.

2.9. Ispitivanje protočnom citometrijom u PC12 stanicama. Nakon tretmana, stanice su tripsinizirane, isprane dva puta s PBS-om, centrifugirane na 1000 o/min tijekom 5 minuta, a zatim fiksirane sa 70 postotnim etanolom preko noći na 4∘C. Stanice su centrifugirane i isprane dva puta s PBS-om, resuspendirane u PBS-u (koji sadrži 50 g/mL RNazeA), obojene s PI u konačnoj koncentraciji od 10 M tijekom 30 minuta na sobnoj temperaturi u mraku i očitane na protočnom citometru na 488 °C. nm pobuda [10].

2.10. Mjerenje razine IL-1 i IL-6 pomoću ELISA testa. Medij kultiviranih stanica PC12 sakupljen je nakon tretmana, a koncentracije IL-1 i IL-6 izmjerene su komercijalno dostupnim kompletima ELISA prema protokolu proizvođača.

2.11. Određivanje razine intracelularnih reaktivnih vrsta kisika. Nakon inkubacije s 6-OHDA, stanice su napunjene s 10M H2DCFH-DA tijekom 30 minuta na 37∘C u mraku. Intenzitet fluorescencije DCF-a mjeren je pri ekscitaciji

Komplementarna i alternativna medicina utemeljena na dokazima valne duljine od 495 nm i valne duljine emisije od 530 nm na čitaču mikropločica [25].

2.12. Statistička analiza. Svi podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SD. Statistička obrada rezultata provedena je jednosmjernom analizom varijance (ANOVA), nakon koje je uslijedio -test. Statistička značajnost je prihvaćena na <>

3. Rezultati

3.1. Učinak ehinakozida na morfologiju i vitalnost stanica u PC12 stanicama oštećenim 6-OHDA. Kao što je prikazano na slici 2(A), održivost stanica PC12 nije imala značajnu razliku pri koncentraciji 0.1~10 M tretmana ehinakozidom za

24 h. Kao što je prikazano na slici 2(B), unutar 24 sata od tretmana samo 6-OHDA, većina PC12 stanica je prošla kroz morfološke promjene kao što su mjehurići na membrani i skupljanje stanica. Zajednički tretman ehinakozidom zaštitio je stanice od 6-OHDA oštećenja. MTT test je pokazao da je tretman PC12 stanica samo sa 6-OHDA rezultirao smanjenjem preživljavanja stanica za približno 25 posto unutar 24 sata, dok je zajednički tretman sa {{10}}.1 M, 1 M, i 10 M echinacoside pokazali su smanjenje 6-OHDA-posredovane citotoksičnosti (svi < 0,01,="" slika="">

3.2. Učinak ehinakozida na disfunkciju mitohondrija izazvanu 6-OHDA u PC12 stanicama. Stanične razine ATP-a značajno su smanjene nakon 24 h inkubacije s 100M 6-OHDA, dok je zajednički tretman s 1 i 10 M ehinakozida ublažio 6-OHDA-posredovano smanjenje ATP-a anaboličke promjene u PC12 stanicama . Rezultati su pokazali da istodobno liječenje s 1 i 10 M ehinakozida može značajno ublažiti oštećenje oksidacijsko-redukcijske aktivnosti mitohondrija izazvano 6-OHDA (oba < 0,05="" i="" slika="">

Kao što je prikazano na slici 3(c), liječenje s 100 M 6- OHDA tijekom 24 sata rezultiralo je značajnim smanjenjem potencijala mitohondrijske membrane u usporedbi s netretiranom skupinom ( < {="" {11}}.01).="" međutim,="" smanjenje="" potencijala="" mitohondrijske="" membrane="" izazvano="" 6-ohda="" značajno="" je="" oslabljeno="" zajedničkim="" tretmanom="" s="" 0,1="" m,="" 1="" m="" i="" 10="" m="" ehinakozida="" (svi=""><>

3.3. Anti-mitohondrijski posredovana apoptoza ehinakozida u PC12 stanicama protiv 6-OHDA neurotoksičnosti. Rezultati su pokazali da je 6-izlaganje OHDA rezultiralo povećanjem citosolnog citokroma C za 167 posto u odnosu na neliječenu skupinu (< 0.{{10}}1).="" ehinakozid="" u="" dozi="" od="" 0.1="" m,="" 1="" m="" i="" 10m="" mogao="" bi="" značajno="" smanjiti="" otpuštanje="" citokroma="" c="" u="" citosol="" izazvano="" 6-ohda="">< 0,05,="">< 0,01="" i="">< 0,01,="" odnosno;="" slika="">

Aktivnost kaspaze{{0}} povećana je za oko 3.3-puta u usporedbi s netretiranom grupom nakon 6-izlaganja OHDA (< 0.01="" ).="" suprotno="" tome,="" zajedničko="" liječenje="" s="" 1="" m="" i="" 10="" m="" ehinakozida="" pokazalo="" je="" značajno="" smanjenje="" aktivnosti="" kaspaze-3="" u="" usporedbi="" sa="" stanicama="" tretiranim="" 6-ohda="" (oba="">< 0,05="" i="" slika="" 4(="" b)).pi="" je="" propusnost="" membrane="" i="" općenito="" je="" isključena="" iz="" živih="" stanica.="" stoga="" se="" obično="" koristi="" za="" identifikaciju="" mrtvih="" stanica="" u="" populaciji.="" rezultati="" su="" pokazali="" da="" je="" stopa="" apoptoze="" značajno="" povećana="" nakon="" 24="" h="" inkubacije="" sa="" 100="" m="" 6-ohda,="" dok="" je="" zajednički="" tretman="" s="" 1="" i="" 10="" m="" ehinakozidom="" značajno="" smanjio="" 6-ohda-induciranu="" apoptozu="">< 0,05,="">< 0,01,="" odn.,="" slika="">

3.4. Protuupalni učinak ehinakozida u stanicama PC12 izazvan 6-OHDA. Rezultati su pokazali da je 6-izloženost OHDA rezultirala povećanjem razine IL-1 u usporedbi s neliječenom skupinom (< 0.05;="" slika="" 4(a)).="" međutim,="" 10="" m="" ehinakozida="" moglo="" bi="" značajno="" smanjiti="" otpuštanje="" il-1="" izazvano="" 6-ohda=""><0,05; slika="">

Razina IL{{0}} također je značajno povećana u usporedbi s neliječenom skupinom (< 0.01).="" međutim,="" zajedničko="" liječenje="" s="" 0,1,="" 1="" i="" 10="" m="" ehinakozida="" značajno="" je="" smanjilo="" otpuštanje="" il-6="" u="" usporedbi="" sa="" 6-ohda-tretiranim="" stanicama="" (oboje="">< 0,05="" i="" slika="">

3.5. Učinak ECH na proizvodnju ROS-a izazvanu 6-OHDA u PC12 stanicama. Stanice tretirane s 6-OHDA pokazale su značajno povećanje (oko 1.4-puta) unutarstaničnog ROS-a u usporedbi s netretiranim stanicama (< 0.01).="" ovo="" povećanje="" značajno="" je="" oslabljeno="" kokubacijom="" s="" 0.1,="" 1="" i="" 10="" m="" ehinakozidom="">< 0.05,="">< 0,01="" i="">< 0,01,="" odnosno;="" slika="" 6.)="">

4. Rasprava

Ehinakozid je jedan od glavnih sastojaka feniletanoidnih glikozida ekstrahiranih iz poznatog tradicionalnog ehinakozida koji ima antiapoptotička i neuroprotektivna svojstva kod neurodegenerativnih bolesti [18]. Studija in vivo objavila je da je ehinakozid imao neuroprotektivne učinke i poboljšao ponašanje u mišjem modelu dopaminergičkog oštećenja neurona izazvanog MPTP-om, dok je daljnje istraživanje otkrilo da je ehinakozid inducirao nižu regulaciju aktivacije kaspaze-3 i kaspaze-8 u MPP plus -inducirana apoptoza neurona cerebelarnih granula [16]. Drugo in vivo istraživanje izvijestilo je o neuroprotektivnim učincima ehinakozida na strijatalne dopaminergičke neurone oštećene 6-OHDA [17]. Međutim, stanični i molekularni mehanizmi koji leže u pozadini ovih djelovanja nisu u potpunosti shvaćeni, osobito zbog njihovog utjecaja na mitohondrijske funkcije i upalne reakcije. Stoga je naša trenutna studija istraživala učinke ehinakozida na mitohondrijske funkcije i upalne reakcije kako bi razjasnila njegov mehanizam protiv PD-a. Rezultati su prvo pokazali da je ehinakozid značajno ublažio 6-OHDA-induciranu neurotoksičnost u PC12 stanicama zaštitom mitohondrijske funkcije i protuupalnim djelovanjem.

Mitohondrijska disfunkcija dugo je bila uključena u smrt dopaminergičkih neurona nigrostrijata kod Parkinsonove bolesti i njezinih eksperimentalnih modela [26]. Mitohondriji su duboko uključeni u proizvodnju reaktivnih kisikovih vrsta (ROS) putem prijenosnika elektrona respiratornog lanca u neurodegenerativnim bolestima [27]. Tijekom normalnog metabolizma u biološkim sustavima proizvodi se veliki broj ROS-a, ali njihova akumulacija nadilazi

potrebna količina može potencijalno oštetiti lipide, proteine ​​i nukleinske kiseline.

6-OHDA, analog kateholamina, uzrokuje specifičnu degeneraciju neurona substancije nigre. Neurotoksičnost izazvana 6-OHDA djelomično je posljedica proizvodnje ROS [28-32].

OHDA dovodi do smrti neurona utječući na funkciju mitohondrija, uključujući smanjenje proizvodnje ATP-a, poremećaj metabolizma ROS-a i indukciju apoptoze [10, 33, 34]. U ovoj studiji naši su rezultati također pokazali da je 6-OHDA oštetila oksidativno-redukcijsku funkciju mitohondrija, smanjila potencijal mitohondrijske membrane, inducirala apoptozu posredovanu mitohondrijima i povećala proizvodnju ROS-a u PC12 stanicama.

Resazurin je fluorescentni indikator koji je posredan samo između konačnih redukcija molekularnog kisika i citokrom oksidaze. Stoga, oksidativno-redukcijski potencijal resazurina omogućuje respiratornom lancu da funkcionira skoro potpuno, što će pružiti točniju i osjetljiviju indikaciju mitohondrijske funkcije. JC-1 je sonda osjetljiva na membranski potencijal koja se lokalizira na unutarnjoj membrani mitohondrija gdje stvara ili monomere (zeleno) ili agregate (crveno) na temelju potencijala mitohondrijske membrane. Stoga su resazurin i JC-1 vrijedni analitički alati za ispitivanje mitohondrijske funkcije [35]. Ova studija je pokazala da smanjenje aktivnosti mitohondrijske oksidativne redukcije i potencijala mitohondrijske membrane mogu igrati važnu ulogu u dopaminergičkoj neurotoksičnosti izazvanoj 6-OHDA. Naš je rezultat također pokazao mitohondrijsko oksidativno-redukcijsko djelovanje i potencijal mitohondrijske membrane. Ovi rezultati pokazuju da bi poboljšanje mitohondrijske disfunkcije moglo biti bolji način za usporavanje progresivne dopaminergičke neurodegeneracije koja se obično povezuje s PD-om.

Općenito je prihvaćeno da je stanična apoptoza izazvana 6- OHDA posredovana mitohondrijskom disfunkcijom, karakteriziranom otpuštanjem citokroma C i aktivacijom kaspaze-3 [36]. Apoptotski podražaj pokreće otpuštanje citokroma C iz mitohondrija u citosol gdje zatim aktivira kaspazu-3 i druge nizvodne kaspaze. U ovoj studiji rezultati su pokazali da stanice PC12 izložene 100 M 6-OHDA pojačanog otpuštanja citokroma C i kaspaze ovisno inhibiraju otpuštanje citokroma C i aktivacije kaspaze- 3. Ovi rezultati sugeriraju da bi ehinakozid mogao inhibirati apoptozu posredovanu mitohondrijima smanjujući otpuštanje citokroma C iz mitohondrija u citosol i aktivaciju kaspaze-3.

Upala je neuropatološka značajka Parkinsonovih mozgova i također u eksperimentalnim modelima bolesti. Terapeutske strategije usmjerene na smanjenje upale i inhibiciju proizvodnje ovih upalnih čimbenika mogu biti obećavajuća neuroprotektivna strategija za liječenje Parkinsonove bolesti i srodnih stanja [37]. Nekoliko studija također provedenih u cerebrospinalnoj tekućini i tijekom postmortem analize kod pacijenata s Parkinsonijom otkrilo je povećane razine citokina, kao što su interleukin-1 (IL-1) i interleukin-6 (IL{{4} }), što ukazuje na aktivaciju aproupalnog odgovora [38, 39]. U ovoj studiji, rezultati su pokazali da je izlaganje 100 Mof6-OHDA izazvano oslobađanjem IL-1 i IL-6 u stanicama PC12. Međutim, liječenje ehinakozidom moglo bi ovisno o dozi inhibirati otpuštanje IL-1 i IL-6 izazvano 6-OHDA. Rezultati sugeriraju da je smanjenje upalnih odgovora također uključeno u mehanizme ehinakozida protiv 6-OHDA-inducirane neurotoksičnosti.

Zaključno, rezultati ovog istraživanja pokazali su da je ehinakozid uspio blokirati 6-OHDA-induciranu neurotoksičnost u PC12 stanicama, a mehanizmi mogu biti povezani sa zaštitom mitohondrija i protuupalnim djelovanjem putem smanjenja proizvodnje ROS-a. Informacije dobivene ovim radom bit će korisne za razjašnjavanje mehanizma ehinakozida za anti-PD. Zaključeno je da ehinakozid može biti obećavajuća terapijska opcija za prevenciju i liječenje PB.

Sukob interesa

Autori su izjavili da nema sukoba interesa

Priznanja

Ovaj rad je podržan grantovima Nacionalne zaklade za prirodne znanosti Kine (81473383) i Nacionalnog velikog projekta za znanost i tehnologiju (2012ZX09103101-078; 2013ZX09103-001-008; i 2013ZX09102106).