Echinacoside koči malignu progresiju MCF-7 stanica raka dojke modulacijom prijenosa signala AKR1B10/ERK

Sažetak: Ova studija analizira utjecajehinakozid(ECH) u proliferaciji, metastazama i otpornosti na adriamicin (ADR).rak dojke(BC) MCF{{0}} stanice putem modulacije aldo-keto reduktaze obitelji 1 člana 10 (AKR1B10)/puta kinaze regulirane izvanstaničnim signalom (ERK). Prvi put je potvrđena kemijska struktura ECH. MCF-7 stanice su tretirane različitim koncentracijama (0, 10, 20, 40 ug·mL-1 ) ECH tijekom 48 h. Western blotting korišten je za analizu ekspresije proteina povezanih s AKR1B10/ERK stazom i test kompleta za brojanje stanica-8 (CCK-8) za određivanje vitalnosti stanica. MCF-7 stanice su prikupljene i klasificirane u kontrolnu skupinu, ECH skupinu, ECH plus Ov-NC skupinu i ECH plus OvAKR1B10 skupinu. Zatim je korišten Western blotting za analizu ekspresije proteina povezanih s putem AKR1B10/ERK. CCK-8 i 5-etinil-2'-deoksiuridin (EdU) testovi korišteni su za ispitivanje stanične proliferacije. Migracija stanica procijenjena je testom ogrebotina, testom transwell i Western blottingom. Na kraju, MCF-7 stanice su tretirane s ADR-om tijekom 48 sati kako bi se inducirala otpornost na ADR. Preživljavanje stanica ispitano je CCK-8 testom, a stanična apoptoza procijenjena je na temelju terminalne deoksinukleoitidil transferaze posredovane nick end označavanjem (TUNEL) testom i Western blotom. Na temelju Protein Data Bank (PDB) i molekularnog spajanja, procijenjen je afinitet vezanja ECH na AKR1B10. Različite doze ECH smanjile su ekspresiju proteina povezanih s putem AKR1B10/ERK na način ovisan o dozi i smanjile vitalnost stanica u usporedbi s kontrolnom skupinom. U usporedbi s kontrolnom skupinom, 40 ug·mL-1 ECH blokiralo je put AKR1B10/ERK u MCF-7 stanicama i inhibiralo proliferaciju, metastaze i otpornost stanica na nuspojave. U usporedbi sa skupinom ECH plus Ov -NC, skupina ECH plus Ov-AKR1B10 pokazala je oporavak nekih bioloških ponašanja MCF-7 stanica. ECH je također ciljao na AKR1B10. ECH može inhibirati proliferaciju, metastaze i otpornost na nuspojave BC stanica blokiranjem puta AKR1B10/ERK.

Ključne riječi:ehinakozid; AKR1B10/ERK signalizacija; rak dojke; otpornost na adriamicin

Rak dojke (BC) daleko je najčešći maligni tumor kod žena, s prosječnom dobi dijagnoze od oko 60 godina [1]. Udio novih slučajeva BC-a u Kini čini 12,2 posto globalnog udjela, a udio umrlih od BC-a u svijetu iznosi 9,6 posto [2]. Genetski i okolišni čimbenici kao što su prehrana bogata masnoćama, unos alkohola i nedovoljna tjelesna aktivnost čimbenici su rizika za rak dojke [3-4]. Suvremeni tretmani još uvijek uključuju operaciju, terapiju zračenjem i terapiju lijekovima [1]. Uobičajeni klinički lijekovi uključuju ciklofosfamid, 5-fluorouracil, pirarubicin, tamoksifen citrat, itd. [5], a postojanje rezistencije na lijekove u BC stanicama također donosi liječenje BC-a u određenoj mjeri. veliki izazov [6]. U isto vrijeme, kao heterogeni tumor, BC ima veću vjerojatnost da će metastazirati u organe kao što su kosti, pluća, jetra i mozak, što metastatski rak dojke čini uglavnom neizlječivim [7]. Cistanche je tradicionalni ljekoviti materijal u mojoj zemlji. Pripada obitelji biljaka i poznat je kao "pustinjski ginseng"[8].Ehinakozid(ECH) je feniletanoidni glikozid ekstrahiran iz Cistanche deserticola. Nedavne studije su to naglasileehinakozidima jaka antioksidativna, protuupalna i antikancerogena svojstva. Na primjer, inhibicijom puta mTOR/STAT3, ECH može ublažiti upalni odgovor i oksidativni stres kod ozljede jetre izazvane paracetamolom [9]. Višestruki dokazi potvrdili su da ECH uglavnom igra ulogu supresora tumora u BC-u, a njegov mehanizam može biti povezan s niskom regulacijom ekspresije miR-4306 i miR-4508 [10] ili blokiranjem Wnt/-katenina signalizacija [11].

Aldo-keto reduktaza 1B10 (AKR1B10), član superobitelji aldo-keto reduktaze, može pretvoriti toksične tvari u netoksične tvari putem redoks reakcija i proizvesti odgovarajuće alkohole, čime djeluje zaštitni na stanice domaćina [12]. Studije pokazuju da se AKR1B10 uglavnom eksprimira u normalnim ljudskim tkivima kao što su debelo i tanko crijevo [13]. Više je studija otkrilo da AKR1B10 uglavnom djeluje kao onkogen kod raka dojke i može postati potencijalni biomarker raka dojke [14-16]. Kao ključni član obitelji MAPK, izvanstanične regulirane protein kinaze (ERK) kontroliraju razne evolucijski očuvane stanične procese u metazoama, a disregulacija ERK može dovesti do raznih bolesti [17]. LI J i suradnici [18] otkrili su da AKR1B10 može potaknuti napredovanje raka dojke aktiviranjem ERK signalizacije. Još zanimljivije, web stranica SwissTargetPrediction predvidjela je AKR1B10 kao potencijalnu metu ehinaceje. Međutim, nije poznato da li je ECH uključen u napredovanje raka dojke posredstvom AKR1B10/ERK signalizacije.

Ova se studija usredotočila na istraživanje specifičnih učinaka ECH na fenotip malignih stanica BC-a i razjašnjavanje odnosa između ECH-a i puta AKR1B10/ERK u stanicama BC-a.

1 materijal

Ljudska normalna stanična linija epitela dojke MCF-10A i stanična linija ljudskog raka dojke MCF-7 osigurao je Centar za stanične resurse Šangajskog instituta za biološke znanosti Kineske akademije znanosti; Stanice otporne na MCF-7 ADR kupljene su od Shanghai Huzhen Industrial Co., Ltd. Kupljeni su medij DMEM/F1 (broj serije PM150310), konjski serum (broj serije 164215) i fetalni goveđi serum (broj serije 164210). iz Wuhana Proceeds Life Technology Co., Ltd.; ECH (broj serije 07668) je nabavljen od Sigma-Aldrich, SAD; ADR (broj serije KGA8181) je kupljen od Jiangsu Kaiji Biotechnology Co., Ltd.; RIPA otopina za lizu (broj serije R0020) kupljena je od Beijing Soleibao Technology Co., Ltd.; Kvantitativni reagens BCA proteina (broj serije CX0013S) kupljen je od Kangwei Century Biotechnology Co., Ltd.; CCK-8 reagens (broj serije C0037) kupljen je od Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.; Lipofectamine 2000 transfekcijski reagens (broj serije 11668019) kupljen je od Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.

Ov-AKR1B10 i Ov-NC plazmide osigurao je Chongqing Youbao Biotechnology Co., Ltd.; EdU reagens (broj serije C00003) i komplet TUNEL (broj serije C11026-1) kupljeni su od Guangzhou Ribo Biotechnology Co., Ltd.; DAPI (broj serije 40727ES10) je kupljen od Guangzhou Ribo Biotechnology Co., Ltd. od Shanghai Yisheng Biotechnology Co., Ltd.; Matrigel (lot br. 354230) i transwell komora (lot br. 3450) kupljeni su od Corning Company, SAD; Paraformaldehid (lot br. 158127), Crystal Violet (lot br. C0775) i otopinu Triton X-100 (lot br. T8787) osigurala je tvrtka Sigma iz Sjedinjenih Država; zec AKR1B10 (broj serije ab192865), fosforilirani ERK1/2 (p-ERK1/2, broj serije ab278538), ERK1/2 (broj serije ab184699), E-kadherin (E-kadherin, serija ab212059), N-kadherin (N -kadherin, serija ab76011), puž (partija ab216347), B-stanični limfom-2 (Bcl-2, serija ab182858), Bcl-2 povezani X protein (Bcl-2- pridruženi X, Bax, broj serije ab182733) protutijela i HPR-obilježena kozja anti-zečja sekundarna protutijela (broj serije ab6702) kupljeni su od Abcam-a, SAD; ECL luminiscencijski komplet (broj serije SL1350) kupljen je od Beijing Cool Lamb Technology Co., Ltd. Softver Image-Pro Plus kupljen je od Media Cybernetics, SAD; Leica DM1000 fluorescentni mikroskop i Leica DM ILLED invertni mikroskop kupljeni su od Leica Microsystems, Njemačka; Softver SPSS 22.0 kupljen je od IBM-a, SAD.

2 metode

2.1 Kultura stanica i rukovanje

MCF{{0}}A stanice uzgajane su u DMEM/F12 koji je sadržavao 5 posto konjskog seruma, 20 ng·mL-1 epidermalnog faktora rasta, 0,5 ug·mL-1 kortizola, 10 ng ·mL-1 inzulina, 100 ng·mL-1 medija kulture toksina kolere; MCF-7 i MCF-7/ADR stanice bile su

Uzgajano u mediju DMEM/F12 s 10 posto FBS. Svi mediji su dopunjeni s 1 posto dvostrukih protutijela i pohranjeni na 37 stupnjeva u vlažnoj atmosferi s 5 posto CO2. Nakon toga, MCF-7 stanice su intervenirane s ECH u različitim koncentracijama (0, 10, 20, 40 ug·mL-1) tijekom 48 h; i 1,0 mg·L-1 ADR primijenjeno je za održavanje rezistencije MCF-7/ADR stanica na lijekove. seks. 2.2 Western blot metoda Protein u MCF-7 stanicama ekstrahiran je RIPA lizatom, a koncentracija proteina je određena BCA reagensom. Proteini odvojeni 10 postotnom SDS-PAGE preneseni su pomoću PVDF membrane; nakon blokiranja s 5 posto obranog mlijeka tijekom 2 sata na sobnoj temperaturi, membrana je /10 000), E-kadherin (1/10 000), N-kadherin (1/5 000) , Puž (1/1 000), Bcl-2 (1/1 000), Bax (1/1 000) Primarno antitijelo je inkubirano preko noći na 4 stupnja, a zatim dodavanje HPR-obilježenog kozjeg anti-zečjeg sekundarnog protutijela (1/2 000) tijekom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ciljani protein detektiran je dodavanjem ECL pribora za luminiscenciju, a obilje proteina je analizirano softverom Image-Pro Plus.

Bogata Echinacoside Cistanche kava za liječenje raka dojke

2.3 CCK-8 test za preživljavanje stanica

Stanice MCF{{0}}A i MCF-7 nasađene su u 96-pločice s jažicama za kulturu (5×103 stanice po jažici), a nakon 24 h , primijenjene su različite koncentracije (0, 10, 20, 40 ug·mL-1) ECH. Nakon intervencije, 48 sati kasnije, tretirani su s 10 postotnim volumnim udjelom CCK-8 reagensa, a stanica vitalnost je otkrivena 2 sata kasnije. Kako bi se dalje istražio učinak ECH na vitalnost MCF-7 stanica, transficirane ili netransficirane MCF-7 stanice uzgajane su 24 sata, a različite koncentracije (0, 10, 20, 40 ug· mL-1) ECH korišteni su za intervenciju. , 10 posto volumnog udjela reagensa CCK-8 dodano je nakon 24, 48, odnosno 72 sata, a metoda detekcije vitalnosti stanica bila je ista kao gore. Kako bi se istražio učinak ECH na rezistenciju MCF-7 stanica na doksorubicin, stanice otporne na MCF-7/ADR su kultivirane zajedno s ECH 48 h, a zatim je CCK-8 radna otopina dodan za otkrivanje vitalnosti stanica.

2.4 Transfekcija plazmida

MCF-7 stanice su nasađene i uzgojene u 6-pločama s jažicom (5×104 po jažici). Kada su stanice dosegle 60-70-postotnu konfluentnost, Ov-AKR1B10 i Ov-NC su privremeno transficirani u strogom skladu s uputama reagensa za transfekciju Lipofectamine 2000. Stanice u svakoj skupini su transfektirane, a transfekcija je završena nakon 48 h.

2.5 EdU bojenje za otkrivanje stanične proliferacije

Nakon što su MCF{{0}} stanice tretirane s ECH i transficirane plazmidima, 20 µmol·L-1 EdU je dodano u svaku jažicu i inkubirano na 37 stupnjeva 2 sata. Nakon toga, stanice su fiksirane i permeabilizirane s 4 posto paraformaldehida odnosno 0,5 posto Tritona X-100. Konačno, EdU-pozitivne stanice obojene DAPI-jem detektirane su pod fluorescentnim mikroskopom.

2.6 Test zacjeljivanja rana za otkrivanje migracije stanica

MCF{{0}} stanice u logaritamskoj fazi rasta dodane su u 6-ploče s jažicama, a kada su stanice dosegle 90 posto konfluencije, upotrijebite vrh sterilne pipete od 200 µL kako biste napravili crtu i isprali 3 puta s PBS-om. Širina rane izmjerena je 0 i 48 h pod invertnim mikroskopom i određen je broj prenesenih stanica.

2.7 Transwell test za otkrivanje invazije stanica

ECH-tretirane i plazmidom transfektirane MCF-7 stanice posađene su u gornju komoru transjažice koja sadrži Matrigel, a 500 µL DMEM medija koji sadrži 10 posto FBS je dodano u donju komoru transjažice. Nakon 24 sata, površinske stanice su obrisane vatom, a stanice su fiksirane i obojene paraformaldehidom, odnosno kristalno ljubičastom, a invazivne stanice su izbrojane pod mikroskopom.

2.8 TUNEL bojanje za otkrivanje apoptoze

Nakon intervencije s 15 µmol L-1 ADR, ECH-tretirane i plazmidom transfektirane MCF-7/ADR-rezistentne stanice posađene su u 96-pločice s jažicama i fiksirane s 4 posto paraformaldehida i {{ 8}}.5 posto Triton X-100 Nakon tretmana permeabilizacije, dodana je TUNEL otopina za detekciju i reakcija je provedena na 37 stupnjeva tijekom 45 minuta prema uputama za kit, a DAPI stanične jezgre su obojene . Pet vidnih polja nasumično je odabrano za promatranje apoptoze stanica pod fluorescentnim mikroskopom.

2.9 Molekularno spajanje

Trodimenzionalna struktura proteina AKR1B10 (PDB ID: 1ZUA) dobivena je iz PDB baze podataka (https://www.rcsb.org/). Upotrijebite softver PyMOL 2.2.0 za uklanjanje vode iz aktivnih sastojaka i uklanjanje nebitnih izvornih liganda, zatim pretvorite kemijsku strukturu ECH u mol2 format softverom OpenBabel 2.2.1 (http://openbabel.org/wiki) i na kraju upotrijebite Autodock 4.2 izvodi molekularno spajanje i odabire pozu s najnižom slobodnom energijom (-10.8 kcal·mol-1) za vizualizaciju.

2.10 Statistička analiza

U ovoj studiji korišten je softver SPSS 22.0 za analizu i obradu eksperimentalnih podataka i izražen kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (x ± s). Za usporedbu između skupina korištena je jednosmjerna analiza varijance. Kada je P<0.05, the difference was statistically significant.

3 rezultata

3.1 ECH inhibira AKR1B10/ERK signalizaciju u MCF-7 stanicama Prvo, rezultati Western blottinga otkrili su da s povećanjem doze izloženosti ECH-u, razine proteina AKR1B10 i pERK1/2/ERK1/2 u MCF{{11 }} stanica se smanjilo, a silazni trend bio je ovisan o dozi P<0.001) (Fig. 1). It can be speculated that ECH may participate in the malignant progression of BC by regulating AKR1B10/ERK signaling.

Sl.1 Učinakehinakozidna prijenos signala AKR1B10/ERK u MCF-7 stanicama (x̄  s, n=3)

3.2 Prekomjerna ekspresija AKR1B10 poništila je inhibitorni učinak ECH na proliferaciju stanica MCF-7

Eksperimentalni podaci CCK{{0}} pokazali su da, u usporedbi s normalnim stanicama MCF-10A, izloženost različitim koncentracijama ECH (0, 10, 20, 40 ug·mL{{6} }) rezultiralo je smanjenjem aktivnosti stanica raka MCF-7 ovisno o koncentraciji (P< 0.05), and when the mass concentration of ECH was 40 μg·mL-1, the cell activity decreased most significantly, so 40 μg·mL-1 ECH was used for subsequent experiments. To further verify whether ECH regulates BC development by regulating AKR1B10/ERK signaling, MCF-7 cells were first transfected with the Ov-AKR1B10 plasmid. After transfection of Ov-AKR1B10, the expression level of AKR1B10 was significantly increased (P<0.001). Western blotting results showed that transfection of Ov-AKR1B10 plasmid induced ECH exposure-induced reduced AKR1B10 and p-ERK1/2 protein levels again increased (P<0.001). In addition, the experimental data of CCK-8 and EdU demonstrated that the inhibitory effect of ECH treatment on the proliferation of MCF-7 cells could be alleviated by the up-regulation of AKR1B10 (P<0.05) (Fig. 2). Thus, overexpression of AKR1B10 rescued the inhibitory effect of ECH on the proliferative capacity of BC cells.

Slika 2. Učinak ehinozida na proliferaciju stanica MCF-7 reguliranjem ekspresije AKR1B10 (fluorescentno bojenje, ×200; x̄  s, n=3)

3.3 Prekomjerna ekspresija AKR1B10 poništila je inhibitorni učinak ECH na migraciju stanica MCF-7. Slično tome, u usporedbi s kontrolnom skupinom, primjena ECH rezultirala je značajnim smanjenjem broja migracija stanica i invazije (P<0.001); In contrast, increased expression of AKR1B10 resulted in enhanced cell migration and invasion (P<0.05). In addition, compared with the control group, the protein levels of N-cadherin and Snail were significantly decreased after ECH treatment, while the level of E-cadherin was significantly increased (P<0.001); The protein levels of cadherin and Snail increased, while the level of E-cadherin decreased (P<0.001) (Fig. 3). In conclusion, up-regulation of AKR1B10 expression rescued the inhibitory effect of ECH administration on BC cell migration and invasion.

Slika 4. Učinak ehinozida na otpornost MCF-7 stanica na ADR reguliranjem ekspresije AKR1B10 (fluorescentno bojenje, ×200; x̄  s, n=3)

4 Rasprava

Rak dojke označava nekontroliranu proliferaciju epitelnih stanica dojke pod djelovanjem različitih kancerogenih čimbenika, a ujedno je i glavni uzrok smrti od raka kod žena [1]. Metastaze tumora jedna su od najopasnijih karakteristika tumora, a ujedno su i osnovni uzrok dugotrajnog izlječenja tumora [19]. Kemoterapija je uobičajena metoda kliničkog liječenja raka dojke [20]. Kontinuiranim napretkom i ažuriranjem metoda i koncepata liječenja raka dojke, prognoza raka dojke je značajno poboljšana [20]. Međutim, pojava rezistencije na lijekove uvelike ograničava kliničku učinkovitost lijekova [21]. Studije su otkrile da će oko 90 posto pacijenata s metastatskim rakom dojke i 50 posto pacijenata s uznapredovalim rakom dojke razviti otpornost na lijekove [22]. ADR je antraciklinski antibiotik koji se naširoko koristi u kliničkom liječenju metastatskog ili recidivirajućeg raka dojke djelovanjem na kemijsku strukturu DNK i može učinkovito smanjiti stopu recidiva i smrtnost pacijenata s rakom dojke [23]. Stoga se ova studija usredotočila na proliferaciju, metastaze i otpornost na nuspojave BC stanica, kako bi se dublje otkrio regulatorni mehanizam napredovanja BC-a i potražile potencijalne molekularne mete za intervenciju.

Echinacea je feniletanoidni spoj dobiven iz rizoma prirodnih biljaka Cistanche deserticola i Echinacea purpurea. Ima različite farmakološke učinke kao što su antioksidativni, antidepresivni, protuupalni, antivirusni, antitumorski i antibakterijski [24-25]. Nedavne studije su izvijestile da ECH može inhibirati proliferaciju, metastaze i angiogenezu stanica raka jajnika reguliranjem puta PI3K/Akt [26]; ECH može ispoljiti svoju antikancerogenu aktivnost kod raka jetre aktiviranjem TGF-1/Smad puta [27]. ECH može spriječiti rast tumora BC inaktivacijom Wnt/-katenin signalnog puta [11]. U ovoj je studiji SwissTargetPrediction prvi put predvidio da će AKR1B10 biti potencijalna meta ECH-a. Stoga autori nagađaju da ECH može sudjelovati u progresiji BC bolesti reguliranjem signalnih putova povezanih s AKR1B10-. Do sada je utvrđeno da je ekspresija AKR1B10 povećana u različitim vrstama raka i igra ulogu u promicanju raka [28]. Osim toga, AKR1B10 može pogoršati razvoj raka mokraćnog mjehura, adenokarcinoma pluća i BC-a aktiviranjem ERK signalizacije [18, 29-30]. Ektopična ekspresija AKR1B10 u stanicama raka dojke potiče fosforilaciju ERK 1/2 za aktivaciju ERK signalnog puta [18]. ERK signalni put potiče degradaciju izvanstaničnog matriksa aktiviranjem MMP-a, posebno MMP2, čime se potiče invazija tumorskih stanica i tumorske metastaze [31-33]. Rezultati ovog eksperimenta također su pokazali da se ekspresija proteina povezanih s putem AKR1B10/ERK smanjila ovisno o dozi nakon tretmana s različitim koncentracijama ECH, što ukazuje da ECH može sudjelovati u mehanizmu regulacije BC-a inhibicijom AKR1B10/ERK put. Osim toga, izloženost ECH također je rezultirala različitim stupnjevima smanjenja vitalnosti BC stanica. Kako bi dodatno dokazala ovu tvrdnju, ova je studija transficirala plazmid prekomjerne ekspresije AKR1B10 u MCF-7 BC stanice i otkrila da su inhibicijski učinci ECH tretmana na stazu AKR1B10/ERK i staničnu proliferaciju, migraciju i invaziju te epitelno-mezenhimalni prijelaz bili prekomjerno izraženi od strane AKR1B10 spašen. Nadalje, u stanicama otpornim na MCF-7/ADR, izloženost ECH-u rezultirala je smanjenjem IC50 i povećanjem broja apoptotskih stanica; dok je prekomjerna ekspresija AKR1B10 u ovom okruženju opet povećala IC50 i smanjila proizvodnju apoptotičkih stanica. Na kraju eksperimenta, odnos ciljanja između ECH i AKR1B10 također je u potpunosti potvrđen. Gore navedeni eksperimentalni rezultati pokazuju da,

Prekomjerna ekspresija AKR1B10 postiže antagonistički učinak na razvoj BC-a potisnutog ECH-om.

Zaključno, primjena ECH-a može oslabiti proliferaciju, migraciju, invaziju, EMT i ADR otpornost BC stanica, a mehanizam bi mogao biti povezan s ciljanjem AKR1B10 i inhibicijom AKR1B10/ERK signalnog puta. Ova je studija u početku razjasnila potencijalni mehanizam ECH-a u BC-u i pružila vrijednu eksperimentalnu osnovu i teoretsku potporu za primjenu ECH-a u lijekovima protiv BC-a. Međutim, još uvijek postoje neki nedostaci u ovoj studiji. Prvo, ovaj eksperiment nije uključivao analizu utjecaja ECH na stopu preživljenja i prognozu bolesnika s BC-jem; drugo, ovoj studiji nedostajali su in vivo pokusi na životinjama za daljnju provjeru uloge ECH u rastu BC tumora. U budućim studijama dodatno će se istražiti klinički značaj ECH-a u liječenju raka dojke.

podrška:

wallence.suen@wecistanche.com 0015292862950