Ekspresija gena karakterističnih Toll-like receptora i glijalni odgovor u različitim regijama mozga prirodnog scrapiea, dio 3

Istraživali smo moguće korelacije između neuropatoloških obilježja prionske bolesti i ekspresije TLR gena u četiri različite regije mozga ovaca prirodno zaraženih scrapieom. U sva četiri područja mozga primijetili smo značajne razlike u taloženju PrPSc, spongiozi, astrogliozi i mikrogliozi u prirodno zaraženih u odnosu na kontrolne ovce.

Prionska bolest, također poznata kao bolest hramskog sajma, bolest izjedanja voska, itd., je akutna virusna infekcija uzrokovana prionima. Bolest se uglavnom prenosi konzumiranjem nekuhane hrane koja sadrži prione. Nakon što se zarazi prionima, može izazvati upalu mozga i oštećenje živčanog sustava, a mogu se pojaviti i simptomi poput glavobolje, povraćanja i groznice.

Međutim, kad se nađemo u takvoj situaciji, ne možemo izgubiti povjerenje u svoje pamćenje zbog postojanja prionske bolesti. Većina zaraženih ljudi može se oporaviti i vratiti pamćenje nakon liječenja.

Naravno, iz preventivne perspektive, možemo pokušati jesti više kuhane hrane kako bismo izbjegli prionsku infekciju. Istodobno, ako osjetite bilo kakve simptome, trebali biste što prije posjetiti liječnika kako biste spriječili pogoršanje bolesti.

U svakodnevnom životu možemo isprobati neke jednostavne treninge pamćenja, poput čitanja, sastavljanja popisa, organiziranja događaja i informacija itd. kako bismo poboljšali svoje pamćenje. Ovi treninzi ne zahtijevaju puno vremena i energije, ali su vrlo važni za održavanje zdravog mozga i učinkovite funkcije pamćenja.

Ukratko, kada se susrećemo s bolestima kao što je prionska bolest, trebamo se pozitivno suočiti s njom, potražiti stručnu liječničku pomoć i preventivne mjere te posvetiti pažnju svakodnevnim vježbama pamćenja kako bismo osigurali svoje fizičko zdravlje i učinkovit rad. Vidi se da moramo poboljšati pamćenje, a Cistanche može značajno poboljšati pamćenje jer može regulirati i ravnotežu neurotransmitera, poput povećanja razine acetilkolina i faktora rasta koji su vrlo važni za pamćenje i učenje. Osim toga, Cistanche također može poboljšati protok krvi i pospješiti opskrbu kisikom, što može osigurati da mozak dobije dovoljno hranjivih tvari i energije, čime se poboljšava vitalnost i izdržljivost mozga.

Kliknite znati načine poboljšanja funkcije mozga

Te su razlike bile najočiglednije u produljenoj moždini, najviše kaudalarea. Nasuprot tome, najblaže lezije primijećene su u frontalnom korteksu, najviše rostralarea. Ovaj sekvencijalni obrazac u skladu je s putem neuroinvazije i diseminacije priona kroz SŽS, počevši od ulaznih mjesta u leđnoj moždini i debelom tjelesnom tkivu i na kraju do frontalnog korteksa [1,5,51].

Neočekivano, s obzirom na njihovu anatomsku blizinu, uočili smo drastično smanjenje taloženja i vakuolizacije PrPSc, te značajno smanjenje astroglioze, kada se kreće od talamusa do hipokampusa, ne prateći postupnu kaudo-rostralnu progresiju patologije.

Specifična mikrogliamorfologija poznata kao štapićasta mikroglija primijećena je u blizini piramidalnih staničnih neurona na CA3, ali je nije bilo u svim ostalim proučavanim neuroanatomskim regijama.

Prema našim saznanjima, ovaj mikroglijalni profil do danas nije bio povezan s neuroinflamacijom potaknutom prionima, iako je nedavna studija izvijestila o prisutnosti štapićaste mikroglije u malom mozgu pacijenata s CJD [52].

Iako je malo proučavana od prvih opisa u 1900-ima, mikroglija štapića nedavno je prijavljena u neurološkim poremećajima kao što su epilepsija, demencija s Lewyjevim tjelescima, Huntingtonova bolest i AD, posebno u umjereno oštećenim područjima cerebralnog korteksa i hipokampusa [40,41,53]. Fenotipski izraz i funkcije štapićaste mikroglije još nisu jasni.

Međutim, činjenica da se ova morfološka značajka tipično podudara s prisutnošću neuronskih elemenata koji su oštećeni ili osjetljivi na oštećenje, sugerira neurozaštitnu ulogu [42,54,55].

Ne smatra se da je mikroglija štapića povezana s teškim lezijama, budući da se u ovim stanjima očekuje progresija prema ameboidnoj morfologiji [56]. Prisutnost štapićaste mikroglije u hipokampusu ovaca zaraženih scrapieom, ali ne i u drugim regijama mozga, može biti indikacija neuroprotektivnog okruženja, u dobrom skladu s ograničenim gubitkom neurona uočenim u ovom području.

Naša analiza ekspresije TLR otkriva izravnu korelaciju između težine lezije i prekomjerne ekspresije TLR gena koja se podudara s gore spomenutom kaudo-rostralnom progresijom prionske neuropatologije.

Nasuprot tome, TLR4 je bio slično prekomjerno izražen u svim područjima, bez obzira na težinu lezije. Prekomjerna ekspresija TLR4 u područjima blažeg neuronalnog oštećenja (tj. hipokampus i frontalni korteks) može odražavati aneuroprotektivnu ulogu, kao što je prethodno opisano za fagocitne stanice kao što su makrofagi i mikroglija [23,57]. Povišena regulacija TLR7 prethodno je prijavljena u mišjim modelima prionske bolesti i ljudi [22,26,31].

Promatrali smo samo regulaciju TLR7 u produženoj moždini, najoštećenijem području u kojem su otkrivene najviše razine taloženja spongioze i PrPSc.

Smrt neurona putem apoptoze prethodno je povezivana sa stimulacijom TLR7 [58,59], a njegova prekomjerna ekspresija u produljenoj moždini mogla bi biti povezana s ovim mehanizmom [60]. Iako uloga TLR1 u neurodegenerativnim bolestima još nije jasna, uključenost TLR2 u mikroglijalnu aktivaciju sve se više pokazuje kod amiotrofične lateralne skleroze, MS-a i AD [61,62].

Iako uloga TLR2 u prionskim bolestima nije u potpunosti shvaćena, predloženi su korisni učinci: vrijeme preživljavanja je smanjeno kod miševa koji ne eksprimiraju TLR2 nakon intracerebralne inokulacije scrapieom [22].

Prekomjerna ekspresija TLR2 i MyD88 također može biti indikacija fenotipa proupalne mikroglije, što bi moglo objasniti porast TNF-a i IL-6 koji smo primijetili u talamusu [8,63].

Zanimljivo je da su eksperimenti s EOC 13.31 stanicama, besmrtnom mišjom staničnom linijom sličnom mikrogliji, pokazali disregulaciju puta upalnog odgovora kao odgovor na aktivaciju TLR2 i sugerirali vezu između ekspresije TLR2 i nakupljanja mikroglije u stanju koje nije optimalno za fagocitozu [26] .

Stoga, prekomjerna ekspresija TLR2 u produljenoj moždini i talamusu, najoštećenijim područjima u kojima su također otkrivene prekomjerne razine fagocitne mikroglije, sugerira da disfunkcionalno uklanjanje PrPSc može dovesti do dugotrajne akumulacije PrPSc i oštećenja neurona [9,17].

Naši nalazi u hipokampusu ovaca zaraženih scrapie-om otkrivaju suprotan obrazac u usporedbi s drugim analiziranim područjima mozga, sa smanjenom regulacijom TLR1, TLR2 i MyD88 i bez promjena citokina.

To može značiti da mikroglija drugačije reagira u hipokampusu; doista, pokazalo se da nedostatak TLR2 u kulturama primarnih mikroglijalnih stanica, iz neonatalnih miševa (0–3 dana) i stimuliranih neurotoksičnim peptidom PrP106-126, pomiče aktivaciju mikroglije s neurotoksičnog na neuroprotektivni fenotip [63] ].

Međutim, relevantnost peptida PrP106-126 u prionskoj patologiji dovedena je u pitanje [64]. CD36 je drugačiji tip receptora za prepoznavanje uzoraka, sposoban prepoznati endogeno izvedene ligande kao što su peptidi koji stvaraju amiloid, koji je uspostavio ulogu u endocitnom preuzimanju tih komponenti [65,66]. Ovaj receptor je povezan s proinflamatornim statusom mikroglije [67].

In vitro, stimulacija BV-2 stanica, vrste imortaliziranih mikroglijalnih stanica, s PrP106-126 rezultira regulacijom CD36, povećanjem proupalnih citokina i proizvodnjom iNOS i NO [68,69].

Dodatno, prepoznavanje -amiloidnog peptida od strane CD36 pokreće sastavljanje novog heterotrimernog kompleksa CD36-TLR4-TLR6 koji aktivira urođeni imunološki odgovor [70,71].

U našem istraživanju sve su regije pokazale značajnu regulaciju CD36 osim hipokampusa. Pojačana regulacija CD36, TLR4 i TLR6 u najoštećenijim područjima, medulla oblongata i obex, sugerira uključenost ove trijade u izazivanje proupalnog mikroglijalnog statusa kao odgovor na prionsku infekciju.

Nasuprot tome, odsutnost prekomjerne ekspresije CD36 i TLR6 u hipokampusu sugerira da ovaj heterotrimer nije formiran, što opet ukazuje na aneuroprotektivno okruženje u ovoj regiji mozga.

Ostaje za objasniti zašto mikroglija različito reagira u ovoj regiji mozga. Dok bi tropizam stanica specifičan za soj priona mogao odrediti obrazac mikroglioze i astroglioze, nedavna otkrića sugeriraju da su obje reakcije uglavnom pod utjecajem regije mozga [18,72].

Ni mikroglija ni astroglija ne reagiraju jednako u CNS-u, a ovaj odgovor specifičan za regiju može rezultirati selektivnom ranjivošću nekih regija mozga u prionskim bolestima [16,18].

U tom smislu, pretpostavljeno je da je upalni odgovor mikroglije na prionsku infekciju reguliran sijalilacijom PrPSc [14,73-75] i da je sijalilacija PrPSc ovisna o regiji mozga [18]. Konkretno, viša razina sijalilacije PrPSc nalazi se u hipokampusu i korteksu nego u talamusu i moždanom deblu, što ukazuje na potencijalnu ulogu u selektivnoj ranjivosti ovih regija mozga [18,73,75].

Visoka razina sijalilacije PrPSc u hipokampusu može biti povezana s usporenom replikacijom priona, što dovodi do osebujne mikroglijalne aktivacije izazvane prionima u ovoj regiji, u skladu sa smanjenom osjetljivošću ove regije koju impliciraju naši nalazi.

Zanimljivo je da prethodni nalazi ukazuju na to da hipokampus može biti zaštićen od neurotoksičnosti priona u prirodnoj CJD infekciji [76,77], a detaljne neuropatološke studije slučajeva CJD-a prijavile su blaže lezije u hipokampusu nego u drugim regijama mozga [76].

Točnije, čini se da je arhikorteks, koji se prvenstveno sastoji od hipokampusa, relativno pošteđen u usporedbi s drugim kortikalnim regijama kod CJD-a [77]. Ova blaga zahvaćenost hipokampusa opisana u prirodnom CJD-u u skladu je sa sadašnjim nalazima kod ovaca prirodno zaraženih scrapieom.

Zanimljivo je da se ova djelomična zaštita protiv najmanje dvije prirodne prionske bolesti događa u hipokampusu, koji je filogenetski najstarija regija cerebralnog korteksa i sastoji se od najosnovnijeg tipa kortikalnog tkiva.

Bit će potrebna daljnja istraživanja kako bi se istražila relevantnost ove korelacije. Ukratko, naši rezultati otkrivaju posebno blagu neuropatologiju u hipokampusu ovaca zaraženih prirodnim scrapieom, karakteriziranu nižim razinama spongioze, taloženja PrPSc i astroglioze od očekivanih s obzirom na kaudalno -rostralno širenje scrapielezija.

Štoviše, prisutnost u hipokampusu ekskluzivne morfologije mikroglije, štapićaste mikroglije, koja može imati neurozaštitnu ulogu [54], zajedno s posebnim profilom ekspresije gena receptora za prepoznavanje uzoraka (TLR geni i CD36), dodatno razlikuje ovo područje mozga od ostalih neuroanatomskih regije kod prirodnih ovaca zaraženih scrapieom.

Ovi nalazi upućuju na stupanj neuroprotekcije protiv prirodne prionske infekcije u hipokampusu koji zaslužuje daljnje istraživanje. Neurodegenerativne bolesti uzrokovane pogrešnim savijanjem proteina uključuju začarani krug upale koji se sastoji od pogrešno savijenog proteina, aktivacije glije i otpuštanja glijalnih upalnih medijatora, koji pogoršavaju taloženje proteina i neuroinflamacija.

Prekidanje ovog začaranog kruga ciljanjem aktivacije mikroglije pomoću specifičnih inhibitora TLR-a u određenoj fazi bolesti može predstavljati obećavajući pristup ograničavanju daljnje neuroupale. Naši nalazi ističu smanjenje regulacije TLR2 kao potencijalnu metu za takav pristup, budući da to može inducirati promjenu mikroglije iz neurotoksičnog u aneuroprotektivni fenotip [63].

Konačno, iako je postignut veliki napredak u karakterizaciji raznolikosti glijalfenotipa korištenjem mišjih modela neurodegenerativnih bolesti, pitanje je da li mišji modeli vjerno odražavaju ključne aspekte prionskih bolesti predmet je rasprave [78,79].

Naši rezultati u transgenskom modelu tg338 reproducirali su uobičajene patološke znakove prionske infekcije, uključujući izrazito taloženje PrPSc, neuropilnu spongiozu, astrogliozu i mikrogliozu.

Međutim, zaraženi miševi pokazali su značajnu prekomjernu ekspresiju TLR1 i TLR2 i sklonost prekomjernoj ekspresiji TLR7. Iako je pojačana regulacija ovih gena prethodno opisana u drugim modelima miševa zaraženih scrapieom [22,26], ovaj obrazac je u suprotnosti s našim nalazima u mozgu ovaca. Zanimljivo je da u mišjem mozgu nismo primijetili nikakve promjene u ekspresiji TLR4, gena za koji su najveće promjene u ekspresiji primijećene u uzorcima ovaca.

Ovi proturječni nalazi mogu biti posljedica različitih putova infekcije i/ili razina ekspresije prionskih proteina kod tg338 miševa [80,81]. Unatoč tome, naši rezultati u konačnici pokazuju da intracerebralnokulacija scrapie u prevelikih tg338 miševa ne reproducira imunološki odgovor opažen kod prirodne infekcije scrapieom.

4. Materijali i metode

4.1. Scrapie zaražene i kontrolne ovce

Dvadeset i jedna ženka ovce Rasa Aragonesa (u dobi od 2 do 6 godina) bila je uključena u ovu studiju. Svi su genotipizirani za PRNP polimorfizme, kao što je ranije objavljeno [82], i otkriveno je da pokazuju ARQ/ARQ genotip. Kontrolne životinje (n=8) odabrane su iz jata u kojem nisu prijavljeni slučajevi grebeža.

Životinje zaražene scrapieom (n=13) dobivene su iz jata zaraženih scrapieom i dijagnosticirana im je imunohistokemijom (IHC) biopsija rektalne sluznice. Infekcija je potvrđena postmortalnom imunodetekcijom PrPSc u obexu prema objavljenim kriterijima [83].

Životinje su eutanazirane intravenskom prekomjernom dozom barbiturata i iskrvavivanjem.

U vrijeme eutanazije, sve ovce zaražene scrapie-om pokazivale su kliničke znakove različite težine: neke su životinje pokazivale početne znakove poput pruritusa na leđima i bokovima nakon digitalne stimulacije i blagog smanjenja tjelesnog stanja, dok su druge pokazivale uznapredovale kliničke znakove poput spontanog češanja korijen repa, lumbalno područje i udovi, neurološki znakovi uključujući ataksiju i drhtanje glave i škripanje zubima, gubitak vune i intenzivan gubitak težine [84].

4.2. Infekcija Tg338 miša

Za procjenu ekspresije TLR gena u mozgu mišjeg modela scrapiea, deset tjedana starih tg338 miševa (n=8) (prekomjerno izražavanje ovčjeg VRQ/VRQ PrPC 8- do 10-fold [ 85]) inokulirani su s pulom mozga prirodne ovce Rasa Aragonesa zaražene scrapieom žrtvovane u kliničkom stadiju.

Miševi su inokulirani s 20 uL inokuluma scrapie (razrijeđenog 2% w/v u PBS) u desnu moždanu hemisferu pod anestezijom izofluranom. Intracerebralne injekcije su izvedene pomoću štrcaljke od 50 µL i igle od 25G. Nakon inokulacije, miševima je davana supkutana injekcija buprenorfina (0,3 mg/kg) za induciranje analgezije.

Kao kontrole, tg338 miševi (n=8) inokulirani su homogenatom mozga iz ovce negativne na scrapie slijedeći isti gore opisani postupak. Miševi su praćeni na razvoj kliničkih znakova i eutanazirani dislokacijom cerviksa kada su se pojavili terminalni znakovi bolesti kao što su teška ataksija i nemogućnost hranjenja.

Miševi zaraženi scrapie-pozitivnim inokulumom pokazali su srednje vrijeme preživljavanja od 187 ± 26 dpi.

4.3. Prikupljanje tkiva

Uzorci iz CNS-a su prikupljeni i podijeljeni sagitalno u dvije polovice; jedan je fiksiran u 10% neutralno puferiranom formalinu za histopatološku i imunohistokemijsku analizu, a drugi je izravno zamrznut i održavan na -80 ◦C za analizu proteina ili stabiliziran u RNAlaterTM otopini (InvitrogenTM, Waltham, MA, SAD) za ekstrakciju RNA te zatim zamrznut i pohranjen na −80 ◦C.

4.4. PRNP sekvenciranje

DNK je ekstrahirana iz uzoraka krvi Speedtools Tissue DNA Extraction kitom (Biotools, Madrid, Španjolska) prema uputama proizvođača. PCR amplifikacija i sekvenciranje učinjeni su kako je prethodno opisano [82].

4.5. Imunohistokemija

Tkiva fiksirana formalinom obrađena su prema standardnim histopatološkim postupcima. Sekcije tkiva su uklopljene u parafin, izrezane na rezove debljine 4 µm i obojene hematoksilin-eozinom (HE) za procjenu vakuolizacije i neuropilne spongioze.

IHC za detekciju PrPSc provedena je korištenjem mišjeg monoklonskog primarnog antitijela L42 kod ovaca (1:500 razrjeđenje na sobnoj temperaturi tijekom 30 minuta) (R-Biopharm, Darmstadt, Njemačka) i zečjih poliklonskih antitijela R486 kod miševa (1: 8000 razrjeđenja, preko noći na 4 ◦C) (R. Jackman, neobjavljeno) kao što je prethodno opisano [86,87].

Sekcije su također podvrgnute konvencionalnom imunološkom bojenju za astrocitni marker glialni fibrilarni kiseli protein (GFAP) (1:500; Dako, Glostrup, Danska) i mikroglija marker ionizirana molekula adaptora za vezanje kalcija 1 (Iba1) (1:1000; Wako, Richmond , VA, SAD), prema objavljenim protokolima [88]. Sve histološke i IHC procjene obavila su dva veterinarska patologa koji su bili slijepi za kliničke podatke.

Procjene intenziteta bojenja spongioze i PrPSc provedene su polukvantitativno i prilagođene prema kriterijima opisanim u prethodnim studijama: vakuolizacija neuropila i perikarije ocijenjena je od 0 (odsutna) do 5 (vrlo brojna i konfluentna) [51], PrPSc signal je kvantificiran na temelju stupnja imunološkog bojenja od 0 (bez označavanja) do 5 (intenzivno uniformno označavanje) kao što je prethodno objavljeno [89], a opseg GFAP i Iba1 imunološkog označavanja ocijenjen je na ljestvici u rasponu od {{ 8}} do 5 (0=slabo bojenje; 5=značajno imunološko označavanje u čitavom području) kako je opisano [88]. Procijenjena su četiri područja mozga: frontalni korteks (Fc), talamus (Th), formacija hipokampusa (Hc) i produljena moždina (Mo), a svako područje je globalno analizirano za bodovanje i grafički predstavljeno kao srednja vrijednost ± standardna pogreška.

4.6. Zapadni Mrlja

100 mg moždanog tkiva svakog područja mozga (Fc, Th, Hc i Mo) od 13 ovaca zaraženih scrapieom, 8 s uznapredovalim kliničkim znakovima i 5 s početnim kliničkim znakovima, homogenizirano je u 1 mL pufera za lizu.

Hemiencefaloni 8 zaraženih i 8 kontrolnih miševa su homogenizirani na 10% (w/v) u puferu za lizu. Uzorci tkiva su homogenizirani u epruvetama za mljevenje (Bio-Rad, Hercules, CA, SAD) pomoću TeSeEPrecess 48 TM homogenizatora (Bio-Rad, Hercules, CA, SAD), a koncentracija proteina je mjerena pomoću kompleta PierceTM BCA Protein Assay (ThermoScientificTM, Waltham, MA, SAD) prema uputama proizvođača.

Za PrPres analizu, jednake količine proteina iz homogenata tkiva su inkubirane 10 minuta na 37 ◦C s otopinom proteinaze K, kao što je prethodno opisano [90].

Dobiveni uzorci podvrgnuti su elektroforezi u 12% CriterionTM XT Bis-Tris proteinskom gelu (Bio-Rad, Hercules, CA, SAD) i prebačeni na PVDF membrane koje su blokirane 1 h s 2% nemasnog suhog mlijeka u TBST (Tris- puferirana fiziološka otopina s 0.1% Tween20).

Za imunoblotiranje, membrane su inkubirane preko noći na 4 ◦C s primarnim antitijelom Sha31 (SPI-Bio, Montigny-le-Bretonneux, Francuska) u koncentraciji od 1 µg/mL, nakon čega je uslijedila 1 h inkubacije na sobnoj temperaturi (RT) s peroksidazom hrena- konjugirano anti-mišje IgG sekundarno protutijelo (1:5000) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, SAD).

Imunoreaktivnost je detektirana korištenjem kemiluminescentnog supstrata ImmobilonCrescendo Western HRP (Merck, Darmstadt, Njemačka). Ekspresija proteina TLR4 analizirana je iz tkivnih homogenata pomiješanih s 2×Laemmli uzorkom pufera (Bio-Rad, Hercules, CA, SAD) prema uputama proizvođača .

Četrdeset mikrograma ukupnih proteina napunjeno je po jažici, propušteno u 7,5%CriterionTM TGXTM Precast Midi Protein Gel (Bio-Rad, Hercules, CA, SAD) i preneseno na PVDF membrane, koje su zatim blokirane 2 h s 4% goveđeg serumskog albumina (BSA) (Merck, Darmstadt, Njemačka) u TBST na RT. Membrane su inkubirane preko noći na 4 ◦C sa zečjim poliklonskim anti-TLR4 protutijelom (Novus Biological, Minneapolis, MN, SAD) u koncentraciji od 0.5 µg/mL, a zatim isprane i inkubirane s kozjim antizečjim IgG ( H + L) HRP sekundarno antitijelo (ThermoScientificTM, Waltham, MA, SAD) u 1:20, 000 tijekom 1 sata na sobnoj temperaturi.

Mrlje su vizualizirane kako je gore opisano. Zatim su membrane očišćene RestoreTM Western Blot Stripping puferom (ThermoScientificTM, Waltham, MA, SAD) 15 minuta na 37 ◦C, isprane i ponovno blokirane.

Zatim su membrane inkubirane preko noći na 4 ◦C s mišjim monoklonskim -aktinskim primarnim protutijelom (Santa CruzBiotechnology, Dallas, TX, USA) pri 1:1000, isprane i inkubirane s anti-mišjim m-IgGkBP-HRP sekundarnim protutijelom (Santa Cruz Biotehnologija, Dallas, TX, SAD) 1 h. Nakon ispiranja, mrlje su razvijene kako je gore opisano.

Denzitometrija je provedena softverom ImageJ, a vrijednosti su normalizirane pomoću -aktina. Normalizirane vrijednosti predstavljene su pomoću GraphPad Prism 6.0 (SanDiego, CA, SAD).

Statističke analize za usporedbu zaraženih i kontrolnih skupina provedene su Studentovim t-testom, a jednakost varijanci određena je Leveneovim testom pomoću softvera SPSS (SPSS Statistics for Windows, Version 17.0, Chicago, IL, SAD). Razlike između skupina smatrane su statistički značajnim na * str<0.05.

4.7. Ekstrakcija RNA, sinteza cDNA i ekspresija gena

Ukupna RNK ovaca ekstrahirana je iz 90 mg uzoraka tkiva iz frontalnog korteksa, talamusa, hipokampusa i produžene moždine. Mozgovi miša podijeljeni su na srednjoj liniji i iz njih je ekstrahirana ukupna RNK<90 mg obtained from the thalamic area. 

Tkiva su homogenizirana korištenjem TeSeEPrecess 48TM homogenizatora (Bio-Rad) s RNeasy LipidTissue Mini Kit (Qiagen, Hilden, Njemačka) u kombinaciji s TURBO DNazom (Invitrogen TM, Waltham, MA, SAD) kako bi se uklonila moguća kontaminacija genomskom DNA. Koncentracija RNA određena je spektrofotometrijski NanoDrop spektrofotometrom (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, SAD), a za svaki uzorak analizirani su omjeri 260/280 i 260/230 kako bi se potvrdila čistoća uzorka.

Jedan mikrogram komplementarne DNA (cDNA) sintetiziran je pomoću qScriptTM cDNA SuperMix (Quantabio BiosciencesTM, Beverly, MA, SAD) prema uputama proizvođača. Dodatno, učinkovitost liječenja DNazom procijenjena je u RT-negativnim uzorcima. Nakon obrnute transkripcije, ista serija razrijeđene cDNA podvrgnuta je qPCR-u za pojačavanje TLR-ova.

Dva često korištena gena za kućnu pomoć (HK) odabrana su za normalizaciju ekspresije ciljnih gena: gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza (GAPDH) i aktin-beta (ACT) [91]. Stabilnost ovog HK gena potvrđena je u našim eksperimentalnim uvjetima. Ekspresija glasničke RNA (mRNA) određena je qPCR-om za 1 do 10 ovčjih TLR gena, 1 do 9 mišjih TLR gena i MyD88 gena za obje vrste.

Dva proupalna (TNF- i IL-6) i dva protuupalna (IL-10 i TGF-) citokina također su proučavana u talamusu i hipokampusu ovaca. Slijedovi i učinkovitosti početnika prethodno su objavljeni ili su dizajnirani pomoću alata Primer3Plus [92] (Tablica 2).

Provjerili smo učinkovitost svakog gena koji generira standardnu ​​krivulju pojačavanjem 1:2 serijskih razrjeđenja kontrolne cDNA i zatim provjerom linearnosti između početne koncentracije uzorka i vrijednosti praga ciklusa (Ct). Svi geni pokazali su korelacijski koeficijent između 0.9 i 0.99, s vrijednošću nagiba standardnih krivulja u rasponu od −3,2 do −3,5 i učinkovitošću qPCR-a od 90–110%.

Reakcije qPCR provedene su korištenjem Applied BiosystemsTM QuantStudioTM 5 RealTime PCR System, 96-bušotine s univerzalnim uvjetima amplifikacije: korak početne aktivacije i denaturacije cDNA od 10 minuta na 95 ◦C, nakon čega slijedi 40 ciklusa od 3 s na 95 ◦C i 30 sat 60 ◦C.

Kako bismo identificirali prisutnost nespecifičnih PCR amplikona ili visokih razina primerdimera, izveli smo protokol krivulje disocijacije nakon svake qPCR reakcije. Svaki uzorak je analiziran u triplikatu u ukupnom reakcijskom volumenu od 10 µL, koji se sastoji od 15 ng cDNA, 5 µL Fast SYBR Green Master Mix (2X) (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, SAD), i potrebne količine naprijed i nazad početnice (Tablica 2).

Dodana je voda bez nukleaza do konačnog volumena od 10 µL. Razine ekspresije gena određene su komparativnom Ct metodom. Rezultati su predstavljeni kao promjena puta i razlike u ekspresiji gena u odnosu na srednju razinu kontrolne skupine skalirane na 1.

4.8. Analiza podataka i statistika

Svi prikupljeni kvantitativni podaci testirani su na normalnost Shapiro-Wilkovim Wtestom. Histološke i imunohistokemijske razlike između zaraženih i kontrolnih skupina procijenjene su Studentovim t-testom ili Mann-Whitneyjevim U testom, ovisno o parametarskoj ili neparametarskoj distribuciji podataka.

Statističke razlike između četiri različite regije mozga kod ovaca zaraženih scrapieom određene su pomoću jednosmjerne analize varijance (ANOVA) praćene Bonferronijevim post hoc testom ili Kruskal-Wallisovim testom, ovisno o parametarskoj ili neparametarskoj distribuciji podataka. Statističke analize podataka qPCR-a provedene su iz srednjih vrijednosti ∆Ct za svaki gen.

Za statističku usporedbu zaraženih i kontrolnih skupina, proveden je Studentov t-test ili Mann–Whitneyjev U test ovisno o normalnoj distribuciji svakog gena, a jednakost varijanci određena je Leveneovim testom. Smatra se da su razlike u ekspresiji značajne pri p < 0.05.

Za označavanje p-vrijednosti na slikama korištene su sljedeće oznake: * p < 0.05; ** p Manje od ili jednako 0.01; # p < 0.1. Za statističke analize korišten je softver SPSS (SPSS Statistics for Windows, Version 17.0, Chicago, IL, USA). Grafikoni su generirani s GraphPad Prism 6.0 (San Diego, CA, SAD), a podaci prikazani na slikama predstavljaju srednju vrijednost i standardnu ​​pogrešku srednje vrijednosti (srednja vrijednost ± SEM).

5. Zaključci

Koliko znamo, ova je studija prva koja opisuje razine ekspresije gena TLR u različitim regijama mozga prirodnih ovaca zaraženih scrapieom i prevelikih tg338 miševa eksperimentalno zaraženih scrapieom.

Naše istraživanje jasno pokazuje da su TLR, a posebno TLR4 kod ovaca i TLR1 i TLR2 kod miševa, uključeni u patogenezu grebeža. Osim toga, za razliku od svih drugih proučavanih regija, poseban profil ekspresije TLR gena, zajedno s jedinstvenom morfologijom mikroglije i blaga neuropatologija uočena u hipokampusu, sugerira imunološki odgovor specifičan za regiju mozga kod infekcije prirodnim grebanjem.

Međutim, bit će potrebna daljnja istraživanja kako bi se karakterizirala ekspresija TLR-a u mikrogliji, astrogliji i neuronima kod infekcije scrapieom kako bi se razumio precizan doprinos svake vrste stanica neuroinflamaciji. Nadalje, tek treba utvrditi je li aktivacija TLR-a izravan odgovor na toksičnost priona ili se javlja sekundarno u odnosu na druge upalne mehanizme.

TLR predstavljaju obećavajuću metu za terapijske pristupe prionskim bolestima i stoga će biti potrebno bolje razumijevanje neuroupalnih odgovora reguliranih TLR-om kako bi se osigurao daljnji napredak u ovom području.

Dopunski materijali: Sljedeći su dostupni online nahttps://www.mdpi.com/article/10.3390/ijms23073579/s1.

Doprinosi autora: Konceptualizacija, istraživanje i čuvanje podataka, MCG i LMC; pisanje-izvorna priprema nacrta, MG-M., MCG i LMC; eksperimentalna metodologija, MG-M.; pisanje-recenzija i uređivanje, MG-M., MCG, LMC i AO; in vivo metodologija, MB; prikupljanje sredstava, RB i JJB; molekularna metodologija, BS-P.; nadzor, MCG i JJB Svi su autori pročitali i složili se s objavljenom verzijom rukopisa.

Financiranje: ovo istraživanje financirao je "Departamento de Ciencia, Universidad y Sociedad delConocimiento" (Vlada Aragona) kroz projekt "A05_20R: Enfermedades Priónicas, Vectoriales y Zoonosis Emergentes".

Izjava institucionalnog nadzornog odbora: Svi postupci koji uključuju životinje pridržavali su se smjernica uključenih u španjolski Zakon o zaštiti životinja RD53/2013 i Direktivu Europske unije 2010/63 o zaštiti životinja koje se koriste u pokusne svrhe. Protokol je odobrio Odbor za etiku pokusa na životinjama Sveučilišta u Zaragozi (Broj dozvole: PI38/159 listopada 2015. i PI19/14 11 travnja 2014.).

Izjava o informiranom pristanku: Nije primjenjivo.

Izjava o dostupnosti podataka: Podaci predstavljeni u ovoj studiji dostupni su unutar teksta članka, slika i dodatnog materijala.

Zahvale: Zahvaljujemo Olivieru Andreolettiju (UMR INRAEENVT 1225-IHAP) i Vincentu Beringueu (UMR VirologieImmunologieMoleculaires (VIM-UR892), INRAE, Universite Paris-Saclay) što su ljubazno ustupili tg338 miševe korištene za ove eksperimente.

Sukob interesa: Autori izjavljuju da nema sukoba interesa. Financijeri nisu imali nikakvu ulogu u dizajnu studije; u prikupljanju, analizi ili interpretaciji podataka; u pisanju rukopisa ili u odluci o objavi rezultata. Slike i brojke u ovom rukopisu izvorni su podaci.

Reference

1. Andreoletti, O.; Berthon, P.; Marc, D.; Sarradin, P.; Grosclaude, J.; van Keulen, L.; Schelcher, F.; Elsen, JM; Lantier, F. Rana akumulacija PrP(Sc) u limfoidnom i živčanom tkivu povezanom s crijevima osjetljivih ovaca iz stada Romanov s prirodnim grebanjem. J. Gen. Virol. 2000., 81, točka 12, 3115–3126. [CrossRef] [PubMed]

2. Prusiner, SB Prionske bolesti i BSE kriza. Znanost 1997, 278, 245–251. [CrossRef] [PubMed]

3. McBride, PA; Schulz-Schaeffer, WJ; Donaldson, M.; Bruce, M.; Diringer, H.; Kretzschmar, HA; Beekes, M. Rano širenje scrapiea iz gastrointestinalnog trakta u središnji živčani sustav uključuje autonomna vlakna splanhičnog i vagusnog živca.J. Virol. 2001, 75, 9320–9327. [CrossRef]

4. Mabbott, NA; MacPherson, GG Prioni i njihovo smrtonosno putovanje do mozga. Nat. Rev. Microbiol. 2006, 4, 201–211. [CrossRef]

5. Wemheuer, WM; Benestad, SL; Wrede, A.; Wemheuer, WE; Brenig, B.; Bratberg, B.; Schulz-Schaeffer, WJ PrPSc obrasci širenja u mozgu ovaca povezani s različitim tipovima priona. Veterinar. Res. 2011, 42, 32. [CrossRef]

6. Betmouni, S.; Perry, VH; Gordon, JL Dokazi za ranu upalnu reakciju u središnjem živčanom sustavu miševa sa scrapie. Neuroscience 1996, 74, 1–5. [CrossRef]

7. Sandberg, MK; Al-Doujaily, H.; Sharps, B.; De Oliveira, MW; Schmidt, C.; Richard-Londt, A.; Lyall, S.; Linehan, JM; Brandner,S.; Wadsworth, JD; et al. Prionska neuropatologija prati nakupljanje alternativnih izoformi prionskog proteina nakon što je infektivni titar dosegao vrhunac. Nat. Komun. 2014, 5, 4347. [CrossRef]

8. Vincenti, JE; Murphy, L.; Grabert, K.; McColl, BW; Cancellotti, E.; Freeman, TC; Manson, JC Definiranje mikroglije koja reagira na vremenski tijek kronične neurodegeneracije. J. Virol. 2015, 90, 3003–3017. [CrossRef]

9. Aguzzi, A.; Zhu, C. Microglia u prionskim bolestima. J. Clin. Istražite. 2017., 127, 3230–3239. [CrossRef]

10. Obst, J.; Simon, E.; Mancuso, R.; Gomez-Nicola, D. Uloga mikroglije u prionskim bolestima: paradigma funkcionalne raznolikosti. Front. Neurosci starenja. 2017, 9, 207. [CrossRef]

11. Lawson, LJ; Perry, VH; Dri, P.; Gordon, S. Heterogenost u distribuciji i morfologiji mikroglije u normalnom mozgu odraslog miša. Neuroscience 1990, 39, 151–170. [CrossRef]

13. Matjaš, V.; Kettenmann, H. Heterogenost u morfologiji i fiziologiji astrocita. Brain Res. Rev. 2010, 63, 2–10. [CrossRef][PubMed]

For more information:1950477648nn@gmail.com