Modeliranje bolesti s organoidima bubrega Ⅱ

4. Strategije za poboljšanje organoidnih platformi bubrega

Trenutačni izložak organoida bubregastrukture relevantne za bubregeali ne nalikujufunkcionalni odrasli bubrezi. Dakle, protokoli opisani u odjeljku2.2 uzrokuju organoide bubrega kojima nedostaje biofizičko okruženje slično in vivo, uključujući protok tekućine kroz tkiva. Nedavne studije poboljšale su sličnost organoida s bubregom odrasle osobe, koristeći tehnike kao što su transplantacija i kombiniranje različitih tipova organoida kako bi se postigla struktura bubrega višeg reda. Ove se tehnike mogu kombinirati s pristupima bioinženjeringa za istraživanje i poboljšanje sazrijevanja organoida. U nastavku ćemo istaknuti te strategije i raspravljati o novim razmatranjima za stvaranje sljedeće generacijeorganoidni sustavi bubrega. 

KLIKNITE OVDJE DA DOBIJETE CISTANCHE ZA LIJEČENJE CKD

4.1. Predstavljamo gradijente

Znamo da tijekom normalne embriogeneze mezonefros, metanefros i UB šalju signale jedan drugome kako bi oblikovali bubreg u razvoju [6]. Osim toga, biokemijski gradijenti uspostavljeni u ranom embriju ključni su za usmjeravanje pravilnog uzorka i razvoja bubrega [47]. Značajan problem u našim trenutnim protokolima razvoja organoida bubrega je njihova izolacija od drugih tjelesnih tkiva tijekom razvoja, a time i nedostatak biokemijskih gradijenata uspostavljenih putem interakcija s drugim tkivnim sustavima embrija koji se zajedno razvijaju. Stoga je vrijedno uključiti te interakcije u razvoj organoida. Taguchi i Nishinakamura (2017) i Tsujimoto et al. (2020) razmatrali su neke od tih interakcija kako bi olakšali sazrijevanje organoida [17,24]. U svojim strategijama prvo su upotrijebili čimbenike specifične za PIM i AIM kako bi razvili neovisne organoide, zatim presadili kokultivirane organoide MM i UB u miševe [17,24]. Organoidi bubrega razvijeni na ovaj način pokazali su strukture višeg reda, ali nisu mogli rekapitulirati opsežno in vivo nalik UB grananju. Iako ove studije naglašavaju važnost zajedničkog uzgoja susjednih tkiva, one pozivaju na poboljšanje organoida putem utvrđenih gradijenata uključenih od početka razvoja organoida.

Budući da je gotovo nemoguće uključiti svako tkivo embrija u razvoju i optimizirati njegove uvjete, predlažemo simulaciju okruženja u kojem stanice doživljavaju učinke susjednog tkiva. To se može postići inženjeringom biokemijskog gradijenta za rast stanica, pri čemu gradijent može oponašati prisutnost susjednih tkiva. Gradijent zatim može usmjeriti i AIM i PIM loze unutar iste suspenzije stanica, i tako inducirati stvaranje UB i MM istovremeno. Na primjer, mogli bismo uspostaviti gradijent GDNF-a i unaprijediti grananje UB-a unutar MM-a kako bismo inducirali formiranje zamršenog sustava sabirnih kanala odraslog bubrega.

Iako ovi pristupi temeljeni na gradijentu nisu istraženi za utvrđivanje organoida bubrega, korišteni su za poboljšanje sazrijevanja drugih organoida. Na primjer, Ben-Reuven i Reiner et al. (2020) ugradili su zrnca koja otpuštaju morfogen u hidrogel kako bi pomogli u oblikovanju prednje-stražnje osi moždanih organoida [48]. U drugoj studiji, Kamperman i sur. (2019) uspostavili su stanični supstrat s biotiniliranim morfogenima [49]. Osim ovih statičkih pristupa, istraživači su također razvili mikrofluidne čipove s dodatkom morfogena koji pokreću drugi. Na primjer, Cui i sur. (2020.) koristili su komoru s komorama za kemotaksiju za distribuciju morfogena i komore u kojima se matične stanice mogu uzgajati u hidrogelovima [50]. Stoga istraživači mogu primijeniti slične sustave za programiranje razvoja organoida bubrega koristeći specifične čimbenike koji su prostorno kontrolirani kako bi posredovali u njihovim učincima. Ovo bi uspostavilo gradijent i oponašalo prirodne distribucije morfogena relevantne za embrionalni razvoj bubrega. Na primjer, zrnca s čimbenicima specifičnim za diferencijaciju AIM i PIM mogu se posaditi na suprotnim stranama hidrogela kako bi se oponašali prirodni gradijenti AIM-PIM. Alternativno, za kontrolu diferencijacije hiPSC-a, stanice ili organoidi mogu se usaditi u mikrofluidne uređaje, tako da su stanice/organoidi različitih linija na suprotnim stranama (vidi sliku 5A). HiPSC-i ugrađeni u hidrogelove mogu se uzgajati između ove dvije strukture, koje mogu poslužiti kao izvori morfogenih čimbenika. Ovaj se pristup može upotrijebiti za oponašanje interakcija između mesonephrosa i metanephrosa, što trenutačnim protokolima za organoid bubrega nedostaje u njihovoj postavci (vidi sliku 5A). Stoga bi budući rad trebao imati za cilj oponašanje biokemijskih znakova iz više tipova tkiva koji su relevantni za razvoj bubrega, uključujući one između UB i MM, kao i između bubrega u razvoju i vaskulature. Srodni dizajn sustava može istražiti mogućnosti uspostavljanja gradijenata za oponašanje tih interakcija.

4.2. Perfuzija organoida mikrofluidikom

Protok tekućine je vitalan zafiziologija bubregabudući da inicira kaskadu unutarstaničnih događaja kao odgovor na mehanosenziranje i olakšava transport kroz tkiva [51]. Stoga, ako želimo generirati funkcionalne bubrežne organoide i održati ih dulje vrijeme, moramo integrirati stabilne i perfuzibilne vaskularne mreže u naše modelne sustave organoida. Protok tekućine je uveden u organoide bubrega na dva glavna načina, mikrofluidikom i transplantacijom. Homan i sur. (2019) uključili su biofizičke znakove u 3D bio-isprintani čip, gdje su organoidi uzgajani u komori s dinamičkim protokom tekućine [52]. Ova postavka simulirala je mikrofluidne kolege i pospješila stvaranje vaskularne mreže, ali nije rekapitulirala perfuziju kroz vaskularne i tubulne strukture kako bi replicirala fiziologiju bubrega. Ipak, ova je studija istaknula važnost biofizičke okoline u sazrijevanju organoida.

Slika 5. Predložena poboljšanja organoidnih platformi bubrega. (A) Pristupi za stvaranje gradijenata u kojima se hiPSC mogu uzgajati da bi evoluirali u organoide bubrega. S lijeva na desno: iPSC klaster u hidrogelu okružen kuglicama koje emitiraju morfogene, hiPSC klaster u hidrogelu okružen organoidima koji emitiraju morfogene, sustav čipova s ​​više komora s hiPSC klasterom uzgojenim u hidrogelu i obostrano izložen morfogenima NP i UB linije sadržanih u tekućini. (B) Predloženi sustav čipova za uzgoj organoida bubrega pored razgranatog endotelnog kanala, s provođenjem kroz hidrogel (npr. kolagenski matriks). (C) Predložene postavke skele, u kojima se organoidi bubrega mogu uzgajati i potom presađivati. S lijeva na desno: porozna skela s razgranatim endotelnim kanalima (crveno), zasađeni organoidi bubrega i zasađene kuglice morfogena (crvene i plave kuglice); porozna skela s NP organoidima koji okružuju UB organoide

Vjerujemo da se mogu razviti organoidi u kanaliziranoj mikrofluidnoj platformi organ-na-čipu za modeliranje ljudskog bubrega, kao što je izvedeno u drugim sferoidnim sustavima. Na primjer, za razliku od Homan et al. (2019), koji je smjestio organoid u komoru s tekućinom, Nashimoto et al. (2017) uzgojili su sferoide fibroblasta ljudskih pluća u izvanstaničnom matriksu (ECM) između dva endotelna kanala [52,53]. Kanali su doveli do perfuzibilne vaskularne mreže formirane putem angiogeneze. Koristeći donekle sličan pristup Nashimotu et al. (2017.), predlažemo postavljanje hiPSC klastera pored perfuzibilne endotelne žile koja se može ugraditi u čip, kao što je prikazano na slici 5B [53]. S naknadnim dodavanjem klijajućih signala specifičnih za organoid bubrega, vaskularni kanal može se usmjeriti na grananje i invaziju na organoid dok se počinje diferencirati. Ova konfiguracija bi replicirala rane faze razvoja bubrega [54]. Uz kontinuiranu perfuziju potrebnih morfogenetskih signala za razvoj bubrega, organoidi bubrega trebali bi biti u stanju bolje replicirati stvarne procese stvaranja ljudskih bubrega. Također je važno da se parametri sustava, poput naprezanja tekućine, sastava i konfiguracije ECM-a i stadija organoida pažljivo razmotre i optimiziraju. Nadalje, budući da su Schumacher i sur. (2021) su pokazali da hipoksija dovodi do povećane angiogeneze u organoidima bubrega, takav ex vivo sustav može se uzgajati u prisutnosti smanjenog kisika kako bi se učinkovitije inducirala vaskularizacija [55]. U konačnici, ove strategije trebale bi olakšati sazrijevanje organoida, rekapitulirati vaskularnu i tubularnu perfuziju i obavljati fiziološke funkcije koje se odvijaju in vivo.

4.3. Unaprjeđenje sazrijevanja organoida putem transplantacije

Studije su pokazale da transplantacija organoida bubrega u domaćina, poput miša, kokošjeg jajeta ili štakora, može pružiti održiv put za vaskularizaciju [16,33,56]. Međutim, transplantirani organoidi pokazuju ograničen uspjeh kao funkcionalne strukture. Glavna prepreka u ovoj strategiji je rekapitulacija opsežnog UB grananja unutar MM transplantiranih organoida. Osim toga, segmenti nefrona unutar organoida nemaju pravilnu orijentaciju prema sabirnom kanalu. Ove su značajke bitne da bi presađeni organoidi obavljali funkciju bubrega odraslog čovjeka. Štoviše, organoidi nakon transplantacije integriraju se s domaćinom, što otežava razlikovanje granica između organoida i tkiva domaćina i time ograničava analizu specifičnu za organoid.

Strategije inženjeringa tkiva pružaju širok raspon alata zapoboljšati razvoj organoida bubregau smislu sazrijevanja i funkcionalne integracije. Tipično, pristupi inženjeringa tkiva koriste skele (npr. skele fibroina svile) u različitim konfiguracijama, kao što su filmovi, prostirke, hidrogelovi i spužve, za podršku rasporedu stanica i rekapitulaciju različitih biofizičkih znakova željenih problema. Na primjer, u jednoj studiji, Gupta et al. (2019) koristili su porozne svilene skele za uzgoj organoida, nakon čega je uslijedila transplantacija [31]. U ovom pristupu, biomaterijal i konfiguracija skele pružili su okvir za podršku razvoju organoida i davanje stabilnosti nakon transplantacije. Međutim, ovom sustavu nedostajali su funkcionalni znakovi koji bi podržali sazrijevanje organoida, kao što je zajednički razvoj vaskulature sa suputnikom u blizini drugih struktura u razvoju.

Buduće studije mogu razviti slične strategije i uključiti funkcionalne znakove za potporu sazrijevanju organoida. Na primjer, kao što je prikazano na slici 5C, porozna skela može se konfigurirati s perfuzijskim kanalima i napuniti morfogenim čimbenicima za razvoj relevantnog sustava za razvoj organoida putem transplantacije. Prethodno zasijavanje endotelnim stanicama može podržati usmjereni razvoj žila, dok se otvorena porozna struktura može zasijati hiPSC-ima i programirati putem morfogenetskih čimbenika za razvoj organoida. Alternativno, izvanstanični matriks (ECM) izlučen iz tkiva bubrega može, sam po sebi, poslužiti kao skela za tkivni inženjering organoida bubrega. Na primjer, decelularizirani bubrezi korišteni su za potporu sazrijevanju organoida. Te matrice mogle bi se koristiti za uzgoj i presađivanje organoida ili za izvođenje skela za tkivni inženjering iz tih biomaterijala.

Nadalje, skele predstavljaju neiskorištenu priliku za ugradnju više organoidnih loza zajedno na odabrane položaje. Na primjer, Taguchi i Nishinakamura (2017) i Tsujimoto et al. (2020.) transplantirali su i UB i NP organoide, omogućujući im vaskularizaciju [17,24]; međutim, nedostajala im je izvanstanična skela za usmjeravanje njihovih organoida s više linija. Korištenjem skela mogli bismo oponašati stvaranje nefrona oko jedne sabirne strukture usmjeravanjem UB organoida u središte i dno skele. U isto vrijeme, možemo zasijati NP organoide duž vanjske strane (vidi sliku 5C). Slični pristupi inženjeringa tkiva mogu se razviti kako bi se unaprijedilo sazrijevanje organoida. Unatoč tome, pri osmišljavanju pristupa koji se temelji na tkivnom inženjerstvu za presađivanje organoida, sve parametre kao što su konfiguracija i kompatibilnost biomaterijala treba pažljivo odabrati, u skladu s potrebama bubrega.

5. Zaključci

Razvojorganoid bubregaje veliko otkriće in vitromodeliranje bolesti bubrega. Organoidi bubregaomogućiti individualizirano proučavanjegenetske bolesti bubregai probir lijekova u platformi koju su proizveli ljudi. Iako imaju velika obećanja, organoidi bubrega su nezreli i izolirani u svom trenutnom obliku. Za istinski modelljudski bubregi srodnih bolesti, moramo ih sazrijeti rekapitulacijom razvoja interakcija bubrega. Konkretno, moramo unaprijediti interakcije između UB i MM in vitro i u organoide bubrega uvesti vaskulaturu koja potiče od ljudi. Moramo također razmotriti pristupe morfogena temeljene na gradijentu za paralelni in vivo ljudski embrionalni razvoj. Organoidi bubrega imaju veliki potencijal za genetička istraživanja odraslih ifetalna bubrežna bolesti pregled lijekova. Njihov napredak može dovesti do razvoja spašavanja životabolest bubregatretmane na način koji je brži i precizniji nego ikad prije.

Reference

1. Bannier-Hélaouët, M.; Post, Y.; Korving, J.; Trani Bustos, M.; Gehart, H.; Begthel, H.; Bar-Ephraim, YE; van der Vaart, J.; Kalmann, R.; Imhoff, SM; et al. Istraživanje ljudske suzne žlijezde korištenjem organoida i jednostaničnog sekvenciranja.Matične stanice stanica2021, 28, 1221–1232.e7. [CrossRef] [PubMed]

2. Lee, J.; Rabbani, CC; Gao, H.; Steinhart, MR; Woodruff, BM; Pflflum, ZE; Kim, A.; Heller, S.; Liu, Y.; Shipchandler, TZ; et al. Ljudska koža s dlakama u potpunosti je nastala od pluripotentnih matičnih stanica.Priroda2020, 582, 399–404. [CrossRef] [PubMed]

3. Takahashi, K.; Yamanaka, S. Indukcija pluripotentnih matičnih stanica iz kultura mišjih embrija i odraslih fibroblasta definiranim čimbenicima.Ćelija2006, 126, 663–676. [CrossRef] [PubMed] 

4. Globalne činjenice: o bolestima bubrega. Dostupno online:https://www.kidney.org/kidneydisease/global-facts-about-kidney disease#:~{}:text=10%25%20of%20the%20populacije%20wide%20wide%20access%20to%20priuštivo %20liječenje(pristupljeno 6. srpnja 2022.).

5. Rehman, S.; Ahmed, D.Embriologija, Bubrezi, mokraćni mjehur i ureter; StatPearls: Otok s blagom, FL, SAD, 2022.

6. Reidy, KJ; Rosenblum, ND Stanična i molekularna biologija razvoja bubrega.Semin. Nefrol.2009, 29, 321–337. [CrossRef] [PubMed] 

7. Ryan, D.; Sutherland, M.; Flores, TJ; Kent, AL; Dahlstrom, J.; Puelles, V.; Bertram, J.; McMahon, AP; Little, MH; Moore, L.; et al. Razvoj bubrega ljudskog fetusa od sredine do kasne gestacije u muške i ženske dojenčadi.eBiomedicina2017, 27, 275–283. [CrossRef] 

8. Al-Awqati, Q.; Oliver, JA Matične stanice u bubregu.Kidney Int.2002, 61, 387–395. [CrossRef] 

9. Tran, F.; Klein, C.; Arlt, A.; Imm, S.; Knappe, E.; Simmons, A.; Rosenstiel, P.; Seibler, P. Matične stanice i organoidna tehnologija u preciznoj medicini kod upale: Jesmo li već stigli?Ispred. Immunol.2020, 11, 573562. [CrossRef]

10. Drost, J.; Clevers, H. Translacijske primjene organoida izvedenih iz matičnih stanica odraslih osoba.Razvoj2017, 144, 968–975. [CrossRef] 

11. Hishikawa, K.; Takase, O.; Yoshikawa, M.; Tsujimura, T.; Nangaku, M.; Takato, T. Odrasle matične stanice u bubregu.Svijet J. Matične stanice2015, 7, 490–494. [CrossRef]