Različita renalna kronotoksičnost bromobenzena i njegovih intermedijarnih metabolita u miševa

Poznato je da bromobenzen (BB) predstavlja ozbiljnu prijetnju ljudskom zdravlju. Prethodno smo pokazali da je BB pokazao kronotoksičnost, to jest dnevne fluktuacije u ozbiljnosti hepatotoksičnosti izazvane u miševa. Iako je BB pokazao blagu nefrotoksičnost, nije primijećena dnevna fluktuacija u ovoj toksičnosti. To se može pripisati činjenici da se kronotoksičnost izazvana BB-om opaža samo u jetri, a ne ububregate da je oštećenje uzrokovano BB izraženo u jetri, prikrivajući dnevnu fluktuaciju nefrotoksičnosti. Kako bismo potvrdili ove dvije mogućnosti, ispitali smo dnevne fluktuacije nefrotoksičnosti zbog posrednih metabolita BB koji ciljaju nabubrega: 3-bromofenol, bromohidrokinon i 4-bromokatehol. Miševima je intraperitonealno ubrizgan 3-bromfenol, bromohidrokinon ili 4-bromkatehol u šest različitih vremenskih točaka u danu (zeitgeberovo vrijeme (ZT): ZT2, ZT6, ZT10, ZT14, ZT18 ili ZT22). Smrtnost je praćena 7 dana nakon injekcije. Miševi su bili osjetljiviji na akutnu toksičnost ovih metabolita oko izlaganja ZT14 (tamna faza) nego oko ZT2 (svjetla faza). Nadalje, miševi kojima je davana nesmrtonosna doza 4-bromokatekola pokazali su značajna povećanja razine dušika ureje u krvi ibubrežnimalondialdehid pri izloženosti ZT14. Štoviše, glutation peroksidaza-4, indikator feroptoze, bila je oslabljena pri izlaganju ZT14. Ovi rezultati pokazuju da je toksičnost metabolita BB bila veća tijekom izlaganja tamnoj fazi i pokazuju da je razlog zašto dnevna varijacija nefrotoksičnosti prema BB nije uočena u našem prethodnom izvješću tajbubrežništetabio maskiran zbog teškog oštećenja jetre.

Kliknite na Cistanche tubulosa Tablete za bolesti bubrega

Ključne riječi bromobenzen; dnevna varijacija; dnevni ritam; kronotoksičnost;bubreg

UVOD

Bromobenzen (BB) je opći industrijski reagens koji se obično koristi kao sirovina za sintezu farmaceutskih proizvoda, boja i pesticida.1,2) BB je organski zagađivač koji oštećuje prirodni okoliš i predstavlja ozbiljnu prijetnju ljudskom zdravlju . Jedna studija navodi da BB izaziva tešku i blagu hepatotoksičnostbubrežnitoksičnost kod miševa.3) Iako sam BB, nemetabolitni oblik, ima nisku toksičnost, njegovi intermedijarni metaboliti imaju toksične učinke na jetru ibubrega. Jetreni CYP450, kao što su CYP1A2, CYP1B1 i CYP2E1, metaboliziraju BB u četiri metabolita: 3-bromofenol (3-BrP), bromohidrokinon (BrHQ), 4-bromokatehol (4- BrC) i BB-3,4-oksid. BB-3,4-oksid pokazuje visoku hepatotoksičnost, a drugi metaboliti pokazuju nefrotoksičnost,4-6) što ukazuje da ti metaboliti imaju različite ciljne organe.

U ovoj smo studiji ciljali na "kronotoksikologiju" jer smo prethodno sugerirali odnos između vremena primjene i ozbiljnosti toksičnosti kemikalija.7-9) Naša prethodna studija pokazala je značajne dnevne fluktuacije u jačini toksičnih odgovora na BB kod miševa, tj. , miševi su bili tolerantniji na oštećenje jetre izazvano BB-om tijekom izlaganja tamnoj fazi (2:00) nego tijekom izlaganja svijetloj fazi (14:00).8) Iako je BB pokazao blagu nefrotoksičnost , kronotoksičnost nije uočena ububrega. Stoga je kronotoksičnost izazvana BB-om vjerojatno uočena samo u jetri, a ne ububrega. U našoj prethodnoj studiji, streptomicin, antibiotik za koji se zna da izaziva definiranu nefrotoksičnost, pokazao je jasnu dnevnu varijaciju u induciranoj nefrotoksičnosti kod miševa.9) Na temelju dostupnih podataka, pretpostavili smo da je kronotoksičnost uzrokovana BB izraženija u jetri, a ne u thebubrega, čime se prikriva kronotoksičnost u potonjem organu. Metaboliti BB koji nastaju različitim metaboličkim putovima pojavljuju se u niskim koncentracijama i stoga mogu pridonijeti zanemarivom oštećenju bubrega; zbog toga se nefrotoksičnost izazvana metabolitom BB ne može klinički procijeniti. U ovoj smo studiji ispitali dnevne varijacije u nefrotoksičnosti međuproizvodnih metabolita BB: 3-BrP, BrHQ i 4-BrC (slika 1).

MATERIJALI I METODE

Liječenje životinja

Muški ICR miševi kupljeni su od Japan SLC Inc. (Shizuoka, Japan) i držani su u standardnim uvjetima kontrolirane temperature (24 ± 1 stupanj), vlažnosti (55 ± 5 posto) i svjetla (12: 12- h ciklusi svjetlo/mrak, svjetla se pale u 08: 00), uz slobodan pristup vodi i hrani. Eksperimentalni tretmani provedeni su na životinjama starim 7- tjedan dana. Nakon završetka pokusa, preživjeli miševi su žrtvovani pomoću pentobarbitala. Sve pokuse odobrio je Odbor za institucionalnu skrb o životinjama i eksperimente Sveučilišta Kinjo Gakuin.

Eksperimentalni protokol

Za analizu smrtnosti, {{0}} tjedana stari mužjaci ICR miševa primili su jednu intraperitonealnu (ip) injekciju od 500 mg/kg 3-BrP, 180 mg/kg BrHQ ili 220 mg/kg 4-BrC (u volumenu od 0,1 ml/10 g tjelesne težine; Tokyo Kasei Corp, Tokio, Japan). Ova se doza određuje prema vrijednosti LD50 u sigurnosno-tehničkim listovima za svaku kemikaliju. Za injekciju svakog metabolita, miševi su raspoređeni u šest skupina od po pet životinja. BB metaboliti primijenjeni su u šest različitih vremenskih točaka (vrijeme na satu: 10:00, 14:00, 18:00, 22:00, 02:{{21 }} i 06 : 00), opisana kao zeitgeberova vremena (ZTs): ZT2, ZT6, ZT10, ZT14, ZT18 i ZT22. Kontrolni miševi primili su isti volumen fiziološke otopine. Smrtnost je praćena 7 dana nakon injekcije.

Za analizu cirkadijanskih varijacija ububrežniozljeda, 7-tjednima starim mužjacima ICR miševa (5-9 miševa) primijenjena je i.p. injekcija od 165 mg/kg 4-BrC na ZT2 ili ZT14. Kontrolni miševi primili su isti volumen fiziološke otopine kao što je gore opisano. Životinje su eutanazirane pentobarbitalom, a uzorci njihove plazme prikupljeni su 24 sata nakon injekcije. Dobiveni uzorci plazme pohranjeni su na -80 stupnjeva. Thebubregasvih životinja sakupljeno je i pohranjeno na -80 stupnjeva.

Razine krvne uree dušika (BUN), aspartat aminotransferaze (AST) i bubrežnog malondialdehida (MDA) u plazmi

Razine BUN i AST u plazmi određene su pomoću BUN Wako testa i transaminaze CII-testa Wako (FUJIFILM Wako Chemicals, Osaka, Japan), prema uputama proizvođača.8) UkupnobubrežniRazine MDA izmjerene su putem kolorimetrijskog testa na mikroploči (Oxford Biomedical Research, MI, SAD), prema uputama proizvođača.8)

Western Blot analiza

Uzorci proteina (50 µg) ekstrahirani izbubregarazdvojeni su elektroforezom u 10 postotnom natrijevom dodecil sulfatu i poliakrilamidnom gelu.10) Primarna korištena protutijela bila su sljedeća (sva razrijeđena 1:1500): monoklonsko protutijelo mišjeg receptora (RIP) 1, monoklonsko protutijelo mišje RIP3 i mišji glutation peroksidaza 4 (GPX4) monoklonsko antitijelo (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, SAD); zečja poliklonska antitijela cijepana kaspaza-3 (tehnologija stanične signalizacije); i mišje -aktin monoklonsko antitijelo (Medical & Biological Laboratories Co., Ltd., Aichi, Japan).

Statistička analiza

Višestruke usporedbe provedene su korištenjem Tukey-Kramer post-hoc testa. Sve statističke analize provedene su pomoću softvera SPSS 25.0 (Chicago, IL, SAD). Rezultati sa str< 0.05="" were="" considered="" statistically="">

REZULTATI I RASPRAVA

U ovoj smo studiji usporedili kronotoksičnost tri međuproizvodna metabolita BB (3-BrP, BrHQ i 4-BrC) za koje je poznato da inducirajububrežnitoksičnost. Prvo smo istražili učinak vremena ubrizgavanja na smrtnost izazvanu posrednim metabolitom BB. Slika 2 prikazuje broj preživjelih životinja i srednje vrijeme preživljavanja (MST) 7 dana nakon injekcije. Kada je 3-BrP primijenjen na ZT10 i ZT14, svi miševi su uginuli (0 posto) unutar 4 sata (Slika 2A). Nasuprot tome, kada je 3-BrP primijenjen na ZT6 i ZT22, tri miša (60 posto) su preživjela; kada su davani na ZT2 i ZT18, broj preživjelih miševa bio je jedan i dva (20 odnosno 40 posto). Nakon primjene BrHQ, smrt miševa primijećena je samo unutar 4 sata nakon primjene u svim ZT skupinama. 7 dana nakon primjene, nijedan miš nije preživio u skupinama ZT14 i ZT18, a tri (60 posto) su preživjela u skupinama ZT2 i ZT6. U skupinama ZT10 i ZT 22, broj preživjelih miševa bio je dva odnosno jedan (40 odnosno 20 posto) (slika 2B). Nakon primjene 4-BrC, svi su miševi umrli unutar 3 dana kada su dobili dozu ZT14 ili ZT18 (0 posto), a samo su jedan ili dva (20 ili 40 posto) preživjeli u drugim ZT skupinama (Slika 2C). MST je bio gotovo u skladu s brojem preživjelih miševa u svim skupinama (Slike 2D-F). Ovi rezultati ukazuju na letalnu kronotoksičnost tri međuproduktna metabolita BB. Nakon primjene na ZT14 (tamna faza), sva tri metabolita pokazala su visoku toksičnost. Zanimljivo je da su obrasci kronotoksičnosti ovih BB metabolita različiti od onih samog BB-a, to jest, miševi izloženi BB-u u mračnoj fazi imali su nižu osjetljivost na toksičnost. 8) Prethodno smo izvijestili da je streptomicin, koji pokazuje nefrotoksičnost, bio visoko toksičan nakon izlaganje tamnoj fazi i manje toksično nakon izlaganja svijetloj fazi.9) Ovi nalazi prethodnih studija nisu u suprotnosti s onima ove studije, sugerirajući da se razlike u toksičnosti BB-a i tri međuproizvodna metabolita BB-a pripisuju njihovim ciljnim organima . BB cilja na jetru, dok njegovi intermedijarni metaboliti ciljaju na jetrububrega.

Zatim smo ispitali učinak vremena ubrizgavanja na ozbiljnost toksičnosti organa koristeći nesmrtonosnu dozu 4-BrC (165 mg/kg). Kako je primijećena rana smrt unutar 4 sata s 3-BrP i BrHQ injekcijama, kako je gore opisano, odabrali smo samo 4-BrC za sljedeće eksperimente. Radi praktičnosti eksperimenta, odabrali smo ZT2 i ZT14 kao vremena ubrizgavanja. U skupini ZT2, razina BUN-a u plazmi, pokazatelja nefrotoksičnosti, nije bila povećana nakon izlaganja 4-BrC; međutim, razina BUN bila je značajno povećana u skupini ZT14 (slika 3A). Paralelno s BUN-om mjerili smo razinu AST u plazmi, pokazatelj hepatotoksičnosti. Otkrili smo da davanje 4-BrC nije utjecalo na razine AST u plazmi ni u ZT2 ni u ZT14 (Slika 3B), što sugerira da je 4-BrC toksičan samo zabubrega. Dodatno, procijenili smo razine MDA kao pokazatelja oksidativnog stresa ububrega. Primjena 4-BrC značajno je povećala bubrežnu razinu MDA u skupinama ZT14 i ZT2. Međutim, razina MDA u skupini koja je primala injekciju ZT2 bila je značajno niža od one u skupini koja je primala ZT14 (slika 3C).

Do danas su prijavljeni različiti putevi stanične smrti kao što su apoptoza, nekroptoza i feroptoza.11) Osim toga, objavljeno je da je stanična smrt uzrokovana 4-BrC uglavnom posredovana nekrozom.6) Istražiti vrste stanične smrti izazvane 4-BrC, analizirali smo razine proteina povezanih sa staničnim smrću: cijepana kaspaza-3 za apoptozu, RIP1/RIP3 za nekroptozu i GPX4 za feroptozu. Nisu primijećene očite promjene u razinama cijepane kaspaze-3, RIP1 i RIP3 ni u jednoj skupini, što sugerira da apoptoza i nekroptoza nisu inducirane 4-BrC (Slika 4). Nasuprot tome, opaženo je smanjenje razine GPX4 nakon primjene 4-BrC na ZT14 (slika 4). Histopatološkom analizom nismo primijetili 4-BrC-induciranu bubrežnu nekrozu (podaci nisu prikazani). To je sugeriralo da je koncentracija 4-BrC korištena u ovoj studiji uzrokovala blago oštećenje bubrega i nije dovela do nekroze. Iz ovih rezultata može se sugerirati da 4-BrC uzrokuje feroptozu, koja pokazuje dnevne varijacije.

U ovoj studiji pokazali smo da BB intermedijarni metaboliti induciraju kronotoksičnost ububreg. Nasuprot tome, naš prethodni rezultat pokazao je nefrotoksičnost izazvanu BB-om. Međutim, bubrežna kronotoksičnost nije se promijenila između svijetle faze i tamne faze.8) Iako kritični razlog za razliku između prethodnih i trenutnih istraživanja još nije jasan, mislimo da je došlo do prikrivanja bubrežne kronotoksičnosti induciranjem teške jetrene ozljeda. U budućem eksperimentu trebamo izmjeriti akumulirane količine svakog BB-međuproizvodnog metabolita budući da se te količine mogu promijeniti ovisno o CYP i/ili razinama ozljede.

Mnogi biološki čimbenici pokazuju cirkadijalni ritam u svojim razinama ekspresije. Na primjer, Xu et al. izvijestili su o dnevnim varijacijama ekspresije gena antioksidansa u jetri kod miševa.12) Glutation (GSH) je antioksidans koji je ključan za održavanje zdravlja i zaštitu od toksičnih spojeva. Prijavljeno je da i 4-BrC i 3-BrP smanjuju bubrežnu razinu GSH.4,13) Feroptoza je predložena 2012. kao oblik stanične smrti izazvan elastinom, koji inhibira uvoz cisteina, što dovodi do smanjenja GSH i inaktivacije GPX4.14) Naši rezultati su pokazali da je GPX4 bio potisnut samo na ZT14 pomoću 4-BrC. Stoga se proteini ili geni povezani s GSH mogu povezati s kronotoksičnošću.

Da zaključimo, naše sadašnje istraživanje pokazuje da BB izaziva oštećenje bubrega, kao i oštećenje jetre putem svojih metabolita, kao što su 3-BrP, BrHQ i 4-BrC. Razlog zašto dnevna varijacija nefrotoksičnosti prema BB nije primijećena u našem prethodnom izvješću je taj što je oštećenje bubrega bilo prikriveno zbog jakog oštećenja jetre.

REFERENCE

1) Lau SS, Redovnici TJ. Doprinos bromobenzena našem trenutnom razumijevanju kemijski izazvanih toksičnosti. Life Sci., 42, 1259-1269 (1988).

2) Zhao H, Cheng N, He L, Peng G, Liu Q, Ma T, Cao W. Hepatoprotektivni učinci meda Apis cerana Fabricius na oštećenje jetre izazvano bromobenzenom u miševa. J. Food Sci., 83, 509–516 (2018).

3) Vedi M, Sabina EP. Procjena hepatoprotektivnog i nefroprotektivnog potencijala withaferina A na ozljede izazvane brombenzenom u švicarskih albino miševa: moguća uključenost mitohondrijske disfunkcije i upale. Cell Biol. Toxicol., 32, 373–390 (2016).

4) Danković DA, Billings RE. Uloga 4-bromfenola i 4-bromkatekola u kovalentnom vezanju brombenzena i toksičnosti u izoliranim hepatocitima štakora. Toxicol. Appl. Pharmacol., 79, 323-331 (1985).

5) Lau SS, Monks TJ, Gillette JR. Identifikacija 2-bromohidrokinona kao metabolita bromobenzena i o-bromofenola: implikacije za nefrotoksičnost izazvanu bromobenzenom. J. Pharmacol. Exp. Ther., 230, 360–366 (1984).

6) Rush GF, Newton JF, Maita K, Kuo CH, Hook JB. Nefrotoksičnost fenolnih metabolita bromobenzena u miševa. Toksikologija, 30, 259–272 (1984).

7) Miura N, Yoshioka H, ​​Nishimori A, Ohtani K, Hasegawa T, Hwang GW, Ikeda M, Nonogaki T. Višesmjerne analize jetrene kronotoksičnosti inducirane kadmijem i kod miševa. J. Toxicol. Sci., 42, 597–604 (2017).

8) Yoshioka H, ​​Nonogaki T, Fukuishi N, Shinohara Y, Hwang GW, Ohtani K, Miura N. Kronotoksičnost bromobenzenom inducirane hepatične ozljede u miševa. J. Toxicol. Sci., 42, 251–258 (2017).

9) Yoshioka H, ​​Tominaga S, Shinohara Y, Hwang GW, Maeda T, Miura N. Kronotoksičnost streptomicinom izazvane bubrežne ozljede u miševa. Biol. Pharm. Bull., 43, 53–58 (2020).

10) Yoshioka H, ​​Ichimaru Y, Fukaya S, Nagatsu A, Nonogaki T. Pojačavajući učinak acetaminofena i hepatotoksičnosti izazvane ugljikovim tetrakloridom posredovan je aktivacijom proteina interakcije receptora u miševa. Toxicol. Mech. Metode, 28, 615–621 (2018).

11) Kim EH, Wong SW, Martinez J. Programirana nekroza i bolest: Prekidamo vaše redovno programiranje kako bismo vam donijeli nekro upalu. Cell Death Differ., 26, 25-40 (2019).

12) Xu YQ, Zhang D, Jin T, Cai DJ, Wu Q, Lu Y, Liu J, Klaassen CD. Dnevne varijacije hepatičke antioksidativne ekspresije gena u miševa. PLOS ONE, 7, e44237 (2012).

13) Monks TJ, Hinson JA, Gillette JR. Toksičnost bromobenzena i p-bromofenola i kovalentno vezanje in vivo. Life Sci., 30, 841-848 (1982).

14) Dixon SJ, Lemberg KM, Lamprecht MR, Skouta R, Zaitsev EM, Gleason CE, Patel DN, Bauer AJ, Cantley AM, Yang WS, Morrison B 3rd, Stockwell BR. Ferroptoza: oblik nenapoptotičke stanične smrti ovisan o željezu. Cell, 149, 1060–1072 (2012).

Hiroki Yoshioka, a,b,# Sarah Tominaga, a,# Mai Nishikawa, a Yasuro Shinohara, a Makoto Nakao, a Masae Yoshikawa, a Tohru Maeda,*, a i Nobuhiko Miura*,c

Fakultet farmacije, Sveučilište Kinjo Gakuin; 2–1723 Omori, Moriyama-Ku, Nagoya 463–8521, Japan: b Centar za kraniofacijalna istraživanja, Zdravstveni znanstveni centar Sveučilišta Teksas u Houstonu, Stomatološki fakultet; 1941 East Road, Houston, TX 77054, SAD: i cOdjel zdravstvenih znanosti, Farmaceutsko sveučilište Yokohoma; 601 Momono-Cho, Totsuka-Ku, Yokohama 245–2006, Japan. Primljeno 30. kolovoza 2020.; prihvaćeno 25. listopada 2020

za više informacija: Ali.ma@wecistanche.com