Razlike u izlučevinama korijena Haloxylon Ammodendrona u različitim godinama sastojina i odgovor na klijavost sjemena Cistanche Deserticola

 

Sažetak

Da pojasnimo kako izlučevine korijenaHaloxylon ammodendron(saxaul) variraju ovisno o dobi sastojine i kakoCistanche deserticola(Cistanche) klijanje sjemena odgovara ovim razlikama, istražili smo saksualne sastojine stare 1, 3 i 6 godina u regiji Alar, Xinjiang, Kina. Uzorci korijenskog eksudata prikupljeni su i analizirani korištenjem neciljane metabolomike temeljene na LC-MS kako bi se karakterizirale razlike u sastavu. Paralelno,Cistanchesjeme je tretirano izlučevinama korijena iz različitih dobnih skupina i određena je klijavost sjemena.

Rezultati su pokazali značajne razlike uCistanchestopa klijanja među tretmanima. Tretman eksudatom 3-godišnje sastojine proizveo je najveću stopu klijanja, značajno veću od tretmana koji su koristili eksudate iz 1-godišnjih i 6-godišnjih sastojina, dok nije otkrivena značajna razlika između 1-godišnjih i 6-godišnjih tretmana. Metabolomička analiza pokazala je da se ukupni metabolički profili izlučevina saksualnog korijena jasno razlikuju između starosti sastojina, a najveći broj različitih metabolita javlja se između 3-godišnjih i 1-godišnjih sastojina. Diferencijalni metaboliti uglavnom su bili obogaćeni šećerima, molekulama povezanim s vitaminom B6, flavonoidima/fenolima i molekulama povezanim s lipidima. Glavne razlike u putovima uključuju metabolizam alfa-linolenske kiseline, metabolizam vitamina B6 i putove povezane s flavonoidima. Daljnji probir integracijom fenotipova klijanja pokazao je da su reprezentativne diferencijalne značajke u skladu s većom klijavošću također koncentrirane u ovim kategorijama metabolita i putevima.

Ovi nalazi ukazuju na jasnu kemijsku diferencijaciju izlučevina korijena saksaula među dobima sastojina i sugeriraju da 3-godišnje sastojine saksaula mogu razviti kemijsku pozadinu izlučevina povoljniju zaCistancheklijanje sjemena. Rezultati daju teorijsku osnovu za razvoj i optimizacijuCistanchetehnike inokulacije.

Ključne riječi: Haloxylon ammodendron; Cistanche deserticola; izlučevine korijena; metabolomika; stand-age gradijent

Uvod

Obnova sušnih pustinjskih ekosustava često se oslanja na uspostavljanje i kontinuirano širenje ključnih grmova [1-2].Haloxylon ammodendronje tipična vrsta drveća za fiksiranje pijeska u pustinjskim regijama sjeverozapadne Kine i igra izvanrednu ulogu u vjetrobranima i fiksiranju pijeska, stabilizaciji površine i održavanju strukture vegetacije [3-4]. Oko upravljanja i poboljšanja ekološke funkcije plantaža saksaula postupno se formirao sveobuhvatan put "ekološke obnove – upravljanja šumom – korištenja resursa" [5-7]. Među tim pristupima, cijepljenjeCistanche deserticolapod plantažama saksaula smatra se reprezentativnim razvojnim modelom koji uravnotežuje ekološke i industrijske koristi [8–9].

 

Baza uzgoja Cistanche u Xinjiangu, Kina

 

Cistanche deserticolaima značajnu ekonomsku vrijednost i potaknuo je potražnju za umjetnim uzgojem [10-11]. Međutim, u proizvodnji velikih razmjera, stopa uspješnosti inokulacije parazita uvelike varira, što utječe na stabilnost i skalabilnost ovog modela [12].

U sustavu saxaul-Cistanche, klijanje sjemena i rano prepoznavanje domaćina ključni su koraci koji određuju može li se uspostaviti parazitski odnos [12-13].Cistanchesjemenke su izuzetno male, a početak klijanja uvelike ovisi o stimulaciji izlučevina korijena domaćina [14-15]. Nakon klijanja, sadnice moraju u kratkom vremenu pronaći korijenje domaćina i ući u proces formiranja haustorija [16]. Stoga se intenzitet i sastav signala domaćina izravno odražavaju na učinkovitost klijanja i naknadne stope uspješnosti parazitiranja [16-17]. Za obligatne parazitske biljke, ti signali također mogu formirati vremensko-prostornu "kombinaciju uvjeta" koja će vjerojatnije potaknuti klijanje, tj. takozvani prozor klijanja [18-19].

Eksudati korijena Saxaul sadrže više klasa spojeva koji mogu sudjelovati u procesima prepoznavanja i indukcije domaćina, kao što su kinoni, organske kiseline i molekule povezane s hormonima. Na njihov sastav utječu i stadij razvoja biljke i okoliš [20-21]. Prethodne studije sugeriraju da se izlučevine korijena dinamički razlikuju kroz godišnja doba ili faze rasta, što dalje može dovesti do razlika uCistanchebrzina klijanja, učinkovitost formiranja haustorija i uspostavljanje parazita [22]. Iz perspektive upravljanja plantažama, gradijent stadijuma često odgovara razvoju korijenskog sustava domaćina, nakupljanju unosa ugljika i stabilizaciji mikrookoliša rizosfere. Posljedično, kemijska pozadina eksudata može biti podvrgnuta sustavnim prilagodbama [23-26].

Međutim, nedostatni su dokazi o tome kako razlike u dobi preoblikuju kemijski spektar izlučevina korijena saksaula i mogu li takve promjene proizvesti mjerljive reakcije klijanja. Ovaj nedostatak također ograničava izravne kvantitativne smjernice za odabir starosti sastojina domaćina i zakazivanje ključnih razdoblja upravljanja.

Metabolomika može otkriti promjene u profilima metabolita korijena i eksudata. Multivarijantne statističke metode kao što su analiza glavnih komponenti (PCA) i ortogonalna parcijalna diskriminantna analiza najmanjih kvadrata (OPLS-DA) mogu se koristiti za razlikovanje skupina i identifikaciju diferencijalnih metabolita [27-28]. Daljnje označavanje puta i analiza obogaćivanja pomaže u tumačenju smjera biokemijskih promjena [29-30]. Sinkronim uspoređivanjem metabolomičkih izlaza s funkcionalnim fenotipovima (npr. stopa klijanja sjemena), kemijske razlike u eksudatima mogu se povezati s mjerljivim ishodima - "je li klijanje pospješeno i u kojoj mjeri" - pružajući izravniju potporu za upravljanje i odluke o primjeni [31-33].

Stoga se ova studija usredotočila na sastojine saksaula različite starosti u regiji Alar na rubu pustinje Taklamakan. Prikupili smo izlučevine korijena iz različitih dobi sastojina za LC-MS neciljano profiliranje metabolomike i proveliCistancheispitivanja klijavosti sjemena korištenjem ovih eksudata kao tretmana. Istraživali smo promjene u profilima metabolita korijena i eksudata uzrokovane starošću (ukupno odvajanje, diferencijalni probir metabolita i obogaćivanje puta) i usporedili ih s razlikama u brzini klijanja. Studija daje kvantitativne reference za poboljšanjeCistancheuspjeh inokulacije i nudi empirijske metabolomičke dokaze za kemijske interakcije između domaćina i parazitskih biljaka u sušnim regijama.

 

1 Materijali i metode

1.1 Područje istraživanja

Područje istraživanja nalazi se u prijelaznoj zoni između pustinje i oaze grada Alar, na sjevernom rubu pustinje Taklamakan, Xinjiang, Kina. Regija ima tipičnu umjerenu toplu, izrazito sušnu klimu, s jakim djelovanjem vjetra i pijeska, oskudnim oborinama i intenzivnim isparavanjem. Srednja godišnja količina padalina je 40,1-82,5 mm, a srednja godišnja evaporacija 1876,6-2558,9 mm. Izvori svjetlosti i topline su izdašni, a dnevne temperaturne razlike velike. Površinskom vegetacijom dominira pustinjsko grmlje i rijetko bilje. Saxaul je glavna konstruktivna vrsta koja se koristi za lokalne pojaseve za zaštitu od vjetra i za pričvršćivanje pijeska, a regija je također važno proizvodno područje za cijepljene saxaulCistanche.

1.2 Prikupljanje i obrada uzoraka

Uzorkovanje je obavljeno u travnju 2025. (proljeće) u regiji Alar. Eksudati korijena i uzorci sinkronog tla prikupljeni su iz sastojina saksaula starih 1, 3 i 6 godina.Cistanchenakon uzorkovanja provedeni su pokusi klijanja sjemena.

Tretmani u trajanju od 1, 3 i 6 godina označeni su kao AO, AT, odnosno AS. Svaki tretman uključivao je tri biološka ponavljanja, označena AO1–AO3, AT1–AT3 i AS1–AS3. Jednogodišnje sastojine predstavljaju ranu fazu osnivanja; 3-godišnje sastojine predstavljaju fazu snažnog rasta s aktivnim procesima rizosfere; a 6-godišnje sastojine predstavljaju relativno stabilan stadij. Na temelju razlika u razvojnim fazama domaćina, usporedili smo kemijske varijacije korijenskog eksudata po dobi sastojina i njihov odnos sCistancheklijanje sjemena.

1.2.1 Prikupljanje eksudata korijena

Eksudati korijena prikupljeni su metodom ekstrakcije in situ na terenu. Na svakoj parceli sa starošću odabrane su jedinke saksaula sa sličnim statusom rasta i bez očitih štetnika ili bolesti. Uzorkovane su tri biljke po starosti sastojine kao biološke replike. Korijenje je pažljivo iskopano oko baze biljke, minimalizirajući mehaničke ozljede. Prilijepljena zemlja nježno je uklonjena; korijenje je isprano deioniziranom vodom; zatim je korijenje spakovano u vrećice i ponovno zakopano in situ za 24 h predtretmana.

Nakon predtretmana, korijenje je uklonjeno i ponovno nježno isprano deioniziranom vodom. Segmenti korijena omotani su navlaženim filter papirom kako bi se održala vlažnost, stavljeni u epruvete za centrifugiranje od 50 mL, zapečaćeni parafilmom i ponovno zakopani in situ. Nakon 24 sata, segmenti korijena omotani filtarskim papirom su sakupljeni, držani na ledu i transportirani u laboratorij.

U laboratoriju je dodano 100 mL deionizirane vode, a uzorci su mućkani 30 minuta radi ekstrakcije. Ekstrakt je vakuumski filtriran, koncentriran pod smanjenim tlakom i pohranjen na -80 stupnjeva za naknadne LC-MS neciljane metabolomske analize. Isti ekstrakti također su korišteni za testove tretiranja sjemena.

1.2.2 Uzimanje uzoraka tla i određivanje fizikalno-kemijskih svojstava tla

Uzorci tla skupljani su istovremeno s izlučevinama korijena. Uzorci su osušeni na zraku prirodno, nečistoće su uklonjene i propušteni kroz sito od 2 mm za fizikalno-kemijska mjerenja uključujući pH, ukupni dušik (TN), ukupni fosfor (TP), ukupni kalij (TK), dušik koji se može hidrolizirati (AN), dostupni fosfor (AP), dostupni kalij (AK) i organsku tvar u tlu (SOM). Detaljne metode navedene su u tablici 1.

Tablica 1. Fizikalno-kemijski pokazatelji tla i analitičke metode

Indikator	Kratica	Analitička metoda
pH	-	Potenciometrijska metoda
Ukupni dušik	TN	Kjeldahl metoda
Ukupni fosfor	TP	Kolorimetrija fuzije NaOH – molibden antimon (spektrofotometrija)
Ukupni kalij	TK	NaOH fuzijska metoda
Dušik koji se može alkalijski hidrolizirati	AN	Metoda alkalne difuzije
Dostupan fosfor	AP	Spektrofotometrijska metoda
Dostupan kalij	AK	Metoda ekstrakcije amonijevim acetatom
Organska tvar tla	SOM	Metoda oksidacije kalijevim dikromatom

1.3 LC-MS neciljana metabolomika i pretprocesiranje podataka

Uzorci korijenskog eksudata analizirani su uporabom tekućinske kromatografije ultravisoke učinkovitosti – masene spektrometrije visoke rezolucije (UHPLC-HRMS) u pozitivnom i negativnom načinu ionizacije elektrosprejom. Neobrađeni podaci podvrgnuti su ekstrakciji vrha, korekciji vremena zadržavanja, poravnanju vrha, rukovanju nedostajućim vrijednostima i normalizaciji prije nizvodnih analiza.

Uzorci za kontrolu kvalitete i prazne kontrole korišteni su za uklanjanje vrhova pozadinske interferencije i značajki s slabom obnovljivošću radi poboljšanja stabilnosti i usporedivosti podataka. Identifikacija i označavanje metabolita temeljilo se uglavnom na točnoj masi, retencijskom vremenu i obrascima fragmentacije MS/MS, usklađenim s HMDB, METLIN, MassBank i mapiranim na KEGG za analizu puta. Rezultati anotacija filtrirani su prema podudaranju pouzdanosti, a provedena je kategorizacija kemijske klase i sažetak na razini puta.

1.4 CistanchePokus klijanja sjemena

1.4.1 Predtretman sjemena

PrikupljenoCistanchesjeme je stavljeno na 30 stupnjeva u inkubator na konstantnoj temperaturi 1 sat. Ovojnice sjemena su uklonjene, a sjemenke su površinski sterilizirane u 2% natrijevom hipokloritu 15 minuta, isprane tri puta sterilnom destiliranom vodom i osušene na sterilnom filter papiru.

1.4.2 Prethodni pokus i određivanje bazalnih uvjeta klijanja

Kako bi se osigurala usporedivost između tretmana s eksudatima iz različitih starosnih dobi, proveden je predeksperiment kako bi se provjerili uvjeti dodavanja giberelina i fluridona. Na temelju rezultata prije testiranja, kombinacija s boljim učinkom klijanja i stabilnom ponovljivošću odabrana je kao osnovni uvjet klijanja: dodatak 1 mL 1 g·L−1^{-1}−1 giberelina i 1 mL 10 mg·L−1^{-1}−1 fluridona.

1.4.3 Tretmani s izlučevinama korijena iz različitih starosti sastojina

U jedinstvenim bazalnim uvjetima proklijanja, dodani su jednaki volumeni uzoraka korijenskog eksudata iz 1-, 3- i 6-godišnjih sastojina saxaul za usporedbuCistanchereakcije klijanja sjemena. Ova se studija usredotočila na učinke tretmana eksudata iz različitih dobi sastojina i nije uključivala gradijent koncentracije eksudata.

Za svaki tretman, 50 prethodno tretiranih sjemenki stavljeno je u Petrijeve zdjelice metodom filter-papira i inkubirano na 25 stupnjeva u mraku. Klijavost je zabilježena nakon 10 dana. Kao kriterij klijavosti korištena je duljina radikule (klicine cijevi) > 1 mm. Svaki tretman imao je tri ponavljanja.

1.5 Statistička analiza

Nakon predprocesiranja i normalizacije, metabolomički podaci analizirani su korištenjem hijerarhijske analize klasteriranja, PCA i OPLS-DA kako bi se procijenile ukupne razlike između starosti sastojina. Diferencijalni metaboliti ispitani su korištenjem VIP > 1 i P < 0,05. Vennovi dijagrami, grafikoni vulkana, grupirane toplinske karte i analize obogaćenja KEGG puta korištene su za tumačenje glavnih diferencijalnih metaboličkih značajki.

Cistanchestope klijavosti sjemena analizirane su jednosmjernom ANOVA-om; post hoc usporedbe provedene su pomoću Tukeyeva testa. Razina značajnosti postavljena je na =0.05\\alpha=0.05 =0.05.

 

2 Rezultati i analiza

2.1 Fizikalno-kemijska svojstva tla

Fizikalno-kemijski pokazatelji tla pokazali su neke varijacije među različitim dobima sastojina, ali ukupna veličina promjene bila je ograničena (Tablica 2). Tla su na svim plohama bila alkalna, s pH u rasponu od 8,35 do 8,83. Sadržaj ukupnog dušika, ukupnog fosfora, ukupnog kalija i organske tvari općenito je bio nizak. Trogodišnje sastojine imale su relativno više TN, TK, SOM i AK; 6-godišnje sastojine imale su nešto više TP i AP; a jednogodišnje sastojine imale su relativno veći AN. Sveukupno, pozadina tla donekle je fluktuirala po dobi sastojine bez dosljednog trenda usmjerenja. Stoga su se naknadne analize uglavnom usredotočile na razlike korijena i eksudata i njihovu korespondenciju sCistanchereakcije klijanja sjemena.

Tablica 2. Fizikalno-kemijska svojstva tla

Liječenje	pH	TN (g·kg⁻¹)	TP (g·kg⁻¹)	TK (g·kg⁻¹)	AN (mg·kg⁻¹)	AP (mg·kg⁻¹)	AK (mg·kg⁻¹)	SOM (g·kg⁻¹)
AO	8.83	0.129	0.591	6.76	11.672	7.171	159.783	2.660
NA	8.35	0.165	0.604	10.69	9.114	7.381	377.900	3.186
KAO	8.82	0.101	0.649	7.08	10.697	8.086	185.962	2.547

Bilješke:AO=1-godina stajanja; U=3-godišnjem stanju; KAO=6-godišnji stalak.

 

2.2 Učinci izlučevina korijena iz različitih starosti sastojina naCistancheKlijanje sjemena

Cistanchestope klijavosti sjemena značajno su se razlikovale među tretmanima s korijenskim izlučevinama iz različite starosti sastojine (Slika 1). Trogodišnji tretman eksudatom (AT) dao je najveću stopu klijavosti od 84,66% ± 1,15%. Jednogodišnji (AO) i 6-godišnji (AS) tretmani dali su 80,89% ± 2,04% odnosno 80,67% ± 0,67%. Jednosmjerna ANOVA pokazala je značajnu razliku između tretmana (P=0.022). Tukeyev post hoc test pokazao je da je AT bio značajno viši od AO (P=0.038) i AS (P=0.030), dok se AO i AS nisu značajno razlikovali (P=0.980).

Slika. 1 Razlike u brzini klijanja sjemena Cistanche deserticola pod tretmanima korijenskim eksudatom iz sastojina Haloxylon ammodendron različite starosti

 

Ovi rezultati upućuju na to da tijekom proljetnog razdoblja izlučevine korijena iz različitih dobi sastojina odgovaraju jasnim razlikama uCistanchereakcije klijanja sjemena, a izlučevine iz trogodišnjih sastojina pokazuju jači potencijal za poticanje klijanja. Kako bismo dodatno objasnili ove razlike, zatim smo analizirali ukupno odvajanje profila metabolita i različite metaboličke značajke.

2.3 Sveukupne razlike u izlučevinama korijena po dobi sastojine

2.3.1 Sveukupno odvajanje metaboličkih profila korijena i eksudata

Metabolički profili korijenskih eksudata jasno su se razlikovali među dobima sastojine. Globalna toplinska karta (Slika 2) pokazala je da se većina uzoraka unutar iste starosti sastojine grupira na istoj grani, što ukazuje na dobru dosljednost unutar grupe. Uzorci iz različitih starosti sastojina pokazali su relativno jasne obrasce grupiranja, što sugerira da se sastav eksudata reorganizirao sa starošću sastojine.

Rezultati PCA (Slika 3) pokazuju da prve dvije glavne komponente objašnjavaju 46,5% ukupne varijance; PC1 i PC2 objasnili su 32,1% odnosno 14,4%. Uzorci iz različitih starosti sastojina pokazali su prepoznatljivu distribuciju u ordinacijskom prostoru. Konkretno, 1-godišnji uzorci pokazali su ukupni trend distribucije različit od 3- i 6-godišnjih uzoraka, što ukazuje na strukturnu diferencijaciju u ukupnom sastavu eksudata sa starošću sastojine. Iako je ostala određena varijabilnost unutar grupe, trend razdvajanja vezan uz dob bio je jasan.

 

2.3.2 Diskriminacija između grupa

Za daljnju usporedbu razlika između starosti sastojina, usporedbe po parovima (AO naspram AT, AO naspram AS, AT naspram AS) provedene su na temelju podataka o modu negativnih iona (Slika 4). Sve tri usporedbe pokazale su jasno odvajanje i dobro grupiranje bioloških replika, pokazujući stabilne metaboličke razlike između starosti sastojina.

Svi modeli OPLS-DA pokazali su dobru prilagodbu i prediktivnu izvedbu, s R2Y=0.998–1.000 i Q2=0.663–0.873, što ukazuje na snažnu diskriminaciju uzoraka korijenskog eksudata među dobima sastojine. Razdvajanje je bilo najizraženije između AS i AO, što ukazuje na najveću ukupnu razliku u sastavu između 1- i 6-godišnjih izlučevina sastojina. AT je također pokazao stabilno odvajanje od AO i AS, što ukazuje da 3-godišnji eksudati već posjeduju različite karakteristike specifične za stadij. Sveukupno, profili metabolita korijenskog eksudata bili su vrlo različiti po dobi sastojina, podupirući nizvodne analize različitih metabolita i njihovu povezanost s razlikama u klijanju.

Slika. 3 Analiza glavne komponente

Slika. 4 Usporedba parova OPLS-DA rezultata korijenskih eksudata Haloxylon ammodendrona različite dobi

 

2.4 Glavne diferencijalne metaboličke značajke eksudata korijena Saxaul

2.4.1 Brojevi različitih metabolita i zajedničke značajke

Svaka parna usporedba između starosti sastojina sadržavala je određeni broj različitih metabolita (Slika 5). Najveći broj pojavio se u AT naspram AO, s 31 diferencijalnim metabolitom. AS naspram AO i AS naspram AT imali su 24, odnosno 18 različitih metabolita, što ukazuje da su razlike između 3-godišnjih i 1-godišnjih eksudata bile najizraženije.

Sedam različitih metabolita podijeljeno je u sve tri usporedbe, što ukazuje na relativno stabilan skup metabolita koji reagiraju na dobne promjene. U međuvremenu, svaka je usporedba zadržala neke jedinstvene diferencijalne metabolite, odražavajući jasne značajke specifične za stadij u promjenama eksudata. Sveukupno, razlike u dobi stajanja izražene su ne samo u broju metabolita, već iu strukturi u kojoj koegzistiraju zajednički i stadiju specifični diferencijalni metaboliti.

 

Slika . 5 Vennov dijagram diferencijalnih metabolita u izlučevinama korijena Haloxylon ammodendrona u različitim dobima sastojina

 

2.4.2 Obrasci promjena u diferencijalnim metabolitima

Grafički prikazi vulkana i grupirane toplinske karte ukazivali su na modularne obrasce promjena u izlučevinama korijena po dobi sastojina. U sve tri usporedbe (Slika 6), značajni metaboliti bili su raspoređeni na obje strane vulkanskih parcela, što ukazuje na metabolite regulirane prema gore i prema dolje u dobi sastojina. Mnoge značajne značajke pokazale su velike promjene nabora i veliki značaj, što sugerira da je razdvajanje grupa zajednički potaknuto skupom koncentriranih metaboličkih pomaka, a ne raspršenim pojedinačnim varijacijama.

Na temelju komentara metabolita, glavne diferencijalne kategorije bile su koncentrirane na šećere, molekule povezane s vitaminom B6, flavonoide/fenole i molekule povezane s lipidima. Reprezentativni diferencijalni metaboliti uključivali su saharozu, izopiridoksal, linolenat (18:3), PA 40:7, metil giberelin A9 i sekologanin.

AT u odnosu na AO sadržavao je najveći broj različitih metabolita, što sugerira jači pomak kemijske proizvodnje s jednogodišnjeg na trogodišnji stalak. Razlike između AT i AS također su bile stabilne, što ukazuje da 3-godišnji stadij nije samo linearni prijelaz između 1-godišnjih i 6-godišnjih sastojina, već ima različite značajke specifične za stadij. Sveukupno, razlike među dobima sastojina uglavnom odražavaju koordinirane promjene među gornjim kategorijama metabolita, a ne izolirane fluktuacije pojedinačnih metabolita.

 

Slika. 6 Vulkanski dijagrami različitih metabolita u izlučevinama korijena Haloxylon ammodendrona u različitim dobima sastojina

 

Toplinska karta reprezentativnih diferencijalnih metabolita (Slika 7) nadalje je pokazala dobro grupiranje bioloških replika i jasno odvajanje između starosti sastojina, što ukazuje da su se razlike u starosti sastojina izravno odrazile na profile diferencijalnih metabolita. Trogodišnja skupina (AT) pokazala je djelomične sličnosti s AO ili AS u različitim modulima metabolita, ali je zadržala vlastite različite značajke. Neki su metaboliti dosegnuli vrhunac u AT dok su ostali niži u AO i AS; drugi su bili niži u AT, ali viši u AO ili AS. Dakle, trogodišnji stadij nije slijedio jednostavan monotoni obrazac povećanja/smanjenja, već jasnu reorganizaciju specifičnu za stadij. Značajno, molekule povezane s vitaminom B6 (npr. izopiridoksal, piridoksat), flavonoidi/fenoli (npr. kvercetin, izokvercitrin, skopolin) i molekule povezane s lipidima (npr. linolenat 18:3, PA 40:7, FA 18:1; O2) pokazale su dosljedne modularne obrasce među dobima sastojina, dosljedno s analizama diskriminacije.

Slika. 7 Toplinska karta hijerarhijskog grupiranja reprezentativnih diferencijalnih metabolita

 

2.4.3 Uključeni glavni metabolički putovi

Analiza KEGG puta pokazala je da razlike vezane uz dob u izlučevinama korijena saxaul primarno uključuju metabolizam lipida, metabolizam vitamina/kofaktora i sekundarni metabolizam povezan s flavonoidima (Slika 8). Metabolizam alfa-linolenske kiseline pojavio se s relativno visokim faktorom utjecaja na put, predstavljajući istaknuti put vezan uz lipide pod razlikama u dobi stajanja. Metabolizam vitamina B6 također je pokazao veliki značaj, što ukazuje na značajne promjene u malim molekulama povezanim s kofaktorima i redoks-homeostazom.

U sekundarnom metabolizmu, biosinteza flavonoida, biosinteza flavona i flavonola i razgradnja flavonoida bili su obogaćeni, što ukazuje da je fenolno-flavonoidni modul glavni smjer varijacije u dobi stajanja. Dodatno, putevi aromatskih spojeva kao što je razgradnja benzoata pokazali su određene reakcije. Sve u svemu, razlike u eksudatima korijena saksaula uzrokovane dobi uglavnom su strukturirane oko metabolizma lipida, metabolizma vitamina B6 i sekundarnog metabolizma flavonoida/fenola.

2.5 Reprezentativni diferencijalni metaboliti pregledani na temelju fenotipova klijanja

Kako bi se dodatno razjasnile veze između razlika eksudata iCistanchefenotipovi klijanja, različiti metaboliti integrirani su s obrascima brzine klijanja. Ispitivanja klijavosti pokazala su da je tretman AT imao najveću stopu klijavosti, dok su AO i AS bili niži i nisu se značajno razlikovali. Ovaj obrazac sugerira da 3-godišnji eksudati saksaula mogu sadržavati kemijske komponente koje su povoljnije za promicanjeCistancheklijanje sjemena.

Na temelju ovog fenotipa dali smo prioritet metabolitima koji su se (i) pojavili u usporedbama AT naspram AO i AT naspram AS i (ii) pokazali trendove promjena u skladu s većom klijavošću (Tablica 3). Ove diferencijalne značajke kandidata bile su uglavnom koncentrirane na šećere, molekule povezane s lipidima, molekule povezane s vitaminom B6 i flavonoide/fenole, te su bile povezane s metabolizmom alfa-linolenske kiseline, metabolizmom vitamina B6 i putevima povezanim s flavonoidima. Ovi rezultati ukazuju na jasno grupiranje kategorija među metaboličkim značajkama kandidata u skladu s većom klijavošću, sugerirajući da ovi metaboliti ili srodni putovi mogu doprinijeti fenotipu klijanja.

Slika. 8 Dijagram mjehurića čimbenika koji utječu na metabolički put

 

 

Tab. 3 Podudarnost između različitih značajki korijenskih izlučevina iz sastojina Haloxylon ammodendron različite starosti i klijavosti sjemena Cistanche deserticola

Grupa za usporedbu	Vrsta odgovora na klijanje	Glavne diferencijalne kategorije	Karakteristike razlike	Reprezentativni diferencijalni metaboliti
AT protiv AO	Stopa klijavosti uNA višeodAO	Šećeri, povezani s vitaminom B6, flavonoidi/fenolne kiseline, lipidi	Značajna modularna reorganizacijau eksudatima kod3-godišnjistarost sastojine	saharoza; Isopyridoxal; Pyridoxate; kvercetin; Isoquercitrin; Linolenat (18:3)
AS protiv AT	Stopa klijavosti uKAO nižeodNA	Šećeri, flavonoidi, giberelini	Razlikovanje između6-godišnjii3-godišnjistoji nasignalizacijaisekundarni-metabolizamrazine	saharoza; Isoquercitrin; Metil giberelin A9
AS protiv AO	Razlika u brzini klijanjanije značajno	Povezano s vitaminom B6, Lipidi	Velike metaboličke razlikeizmeđu1-godišnjii6-godišnjistoji, alinema značajne razlike u klijavosti	izopiridoksal, itd.

3 Rasprava

3.1 Starost sastojine pokreće kemijsku diferencijaciju izlučevina korijena saksaula

Eksudati korijena biljaka nisu statični; oni se dinamički prilagođavaju razvojnom stupnju, raspodjeli resursa i promjenama okoliša rizosfere. McLaughlin i sur. [22] pokazali su da izlučevine korijena značajno variraju ovisno o biljnim vrstama i vremenskim skalama, što ukazuje na jaku prostorno-vremensku dinamiku. Chen i sur. [23] nadalje su izvijestili da i starost stabla i sezona značajno mijenjaju strategije izlučivanja korijena i sastav metabolita u plantažama kineske jele, pokazujući jasne razlike u stadijumu starosti u metaboličkim rezultatima. Ove studije podupiru fiziološko-ekološku osnovu za diferencijaciju kemijskog sastava korijenskog eksudata na temelju stupnja razvoja.

U ovoj studiji, eksudati korijena saksaula pokazali su jasnu diferencijaciju između starosti sastojina na razini ukupnog profila metabolita. Grupiranje toplinske karte, PCA i OPLS-DA pokazali su stabilno razdvajanje između starosti sastojina, što ukazuje da starost sastojine može potaknuti kemijsku reorganizaciju eksudata korijena saksaula specifičnu za stadij. Ovo se slaže s postojećim saznanjima da stadij rasta biljke utječe na sastav eksudata i sugerira da u sustavu domaćina saxaul-Cistanche varijacije u dobi mogu biti važan ekološki čimbenik koji oblikuje pozadinu signala izvedenih iz korijena.

Štoviše, dobne promjene ne odgovaraju samo razvojnom stadiju domaćina nego i promjenama u okolišnoj pozadini rizosfere. Razina hranjivih tvari u tlu, pH, organska tvar i uvjeti saliniteta mogu utjecati na stjecanje hranjivih tvari u biljci, obrasce raspodjele ugljika i stabilnost rizosfere, čime se dodatno regulira sastav i procesi oslobađanja korijenskih eksudata.

3.2 Eksudati iz 3-godišnjeg Saxaula odgovaraju višimCistancheStope klijavosti sjemena

Klijanje sjemena parazitskih biljaka uvelike ovisi o kemijskim signalima domaćina. Nelson [16] primijetio je da se korijenske parazitske biljke u Orobanchaceae tipično oslanjaju na signalne molekule koje otpušta korijen domaćina kako bi otkrile prisutnost domaćina i pokrenule klijanje; takvo "klijanje izazvano domaćinom" ključni je adaptivni mehanizam.

U ovoj studiji,Cistanchestopa klijavosti sjemena bila je najveća kod 3-godišnjeg tretmana saxaul eksudatom, značajno veća od tretmana s 1-godišnjim i 6-godišnjim eksudatom, dok nije uočena značajna razlika između 1-godišnjih i 6-godišnjih tretmana. Ovo ukazuje da različiti domaćini u stadiju vjerojatno ne daju samo različite količine eksudata, već i kemijski različitu pozadinu koja potiče klijanje. Činjenica da je AT u odnosu na AO imao najviše različitih metabolita sugerira da je kemijska reorganizacija iz jednogodišnjih u trogodišnje sastojine bila najveća, u skladu sa smjerom veće klijavosti.

Ovaj se obrazac može odnositi na razlike u fazi rasta saksaula i odgovarajućih strategija raspodjele resursa. Jednogodišnji saxaul je u ranoj fazi uspostavljanja, gdje biljke nisu potpuno stabilizirane, korijenski sustavi i nabava resursa su relativno ograničeni, a metabolički rezultati mogu biti više usmjereni na održavanje vlastitog rasta. Šestogodišnji saksaul je u relativno zreloj fazi, gdje se raspodjela resursa može pomaknuti prema održavanju, strukturnoj stabilnosti i prilagodbi okolišu, što dovodi do stabilnijih strategija eksudacije. Nasuprot tome, 3-godišnji saxaul općenito je u snažnoj fazi rasta, s aktivnijim širenjem korijena, unosom hranjivih tvari i podzemnim metabolizmom, zbog čega je vjerojatnije da će formirati bogatiji i varijabilniji profil korijenskog eksudata. Na temelju toga, izražena reorganizacija metabolita i veća stopa klijanja u trogodišnjem tretmanu mogu odražavati povoljnije okruženje signala rizosfere za početakCistancheklijanje sjemena tijekom proljetnog prozora.

3.3 Glavne diferencijalne metaboličke značajke u skladu s odgovorima klijanja

Metabolomika učinkovito otkriva promjene profila metabolita u složenim uzorcima. Kada se integrira s analizom obogaćivanja puta, omogućuje identifikaciju glavnih smjerova promjena na razini sustava. Prethodne studije [31-33] sugeriraju da kombiniranje rezultata metabolomike s funkcionalnim fenotipovima kao što je klijanje sjemena pomaže u ciljanju potencijalnih metabolita ili putova koji su u skladu s fenotipskim promjenama. Za korijenske eksudate, strategija "prvo fenotip, praćenje metabolita" posebno je korisna za identificiranje potencijalnih metaboličkih značajki povezanih sa specifičnim biološkim učincima.

U ovoj studiji, probir vođen fenotipom pokazao je da su reprezentativne diferencijalne značajke u skladu s većom stopom klijanja u trogodišnjem tretmanu uglavnom koncentrirane u šećerima, molekulama povezanim s vitaminom B6, flavonoidima/fenolima i molekulama povezanim s lipidima, uključujući metabolizam alfa-linolenske kiseline, metabolizam vitamina B6 i puteve povezane s flavonoidima. Mehanički gledano, šećeri mogu odražavati promjene u opskrbi i raspodjeli ugljika u rizosferi; molekule povezane s lipidima mogu se odnositi na remodeliranje lipida membrane i regulaciju signala stresa; flavonoidi/fenoli mogu sudjelovati u prepoznavanju domaćin-parazit i prijenosu signala rizosfere; a molekule povezane s vitaminom B6 mogu biti povezane s metaboličkom homeostazom i puferiranjem stresa. Ove metaboličke kategorije pokazale su usklađene promjene u AT skupini.

CistancheIstraživanja u vezi s njima pokazuju da fenolne kiseline dobivene iz domaćina mogu utjecati na procese indukcije, a fenolni/aromatski sekundarni metaboliti u korijenima domaćina mogu igrati ulogu u odgovorima parazita [14]. Iako ova studija ne može izravno dokazati da je jedan metabolit odlučujući čimbenik koji pokreće pojačanu klijavost, promjene grupirane po kategorijama uočene u trogodišnjoj skupini sugeriraju da prednost u promicanju klijanja vjerojatnije proizlazi iz koordinirane reorganizacije više klasa metabolita koji tvore složenu kemijsku pozadinu, a ne slučajnog povećanja pojedinačne molekule.

3.4 Praktične implikacije i ograničenja studije

Iz perspektive proizvodne prakse, rezultati sugeriraju da bi tijekom proljetnog razdoblja trogodišnji saksaul mogao imati bolji potencijal zaCistancheinokulacija, pružajući referencu za izbor domaćina prema starosti u podšumiCistancheuzgoj i mogući pravci tehničkog razvoja za poboljšanje uspjeha cijepljenja.

Međutim, ova se studija temelji na jednom proljetnom uzorkovanju, a zaključci uglavnom odražavaju odnose tijekom proljetnog razdoblja; izravna ekstrapolacija na cijelu godinu još nije podržana. Osim toga, uloga pozadine tla u oblikovanju značajki metabolita eksudata ostaje u velikoj mjeri inferencijalna i treba je dodatno potvrditi korelacijskim analizama, kontroliranim eksperimentima ili pristupima multi-omike. Neciljana metabolomika također ima ograničenja kao što su interferencija izomera i ograničena pouzdanost identifikacije za neke metabolite. Stoga bi se molekule povezane s lipidima, vitaminom B6 i flavonoidnim/fenolnim molekulama trebale smatrati smjernicama kandidata, a ne potpuno potvrđenim ključnim čimbenicima indukcije. Konačno, na praktične rezultate inokulacije utječu brojni čimbenici uključujući naseljavanje parazita, formiranje haustorija, naknadni rast, uvjete vode i soli u polju i metode upravljanja. Potreban je daljnji rad koji kombinira terenske inokulacijske pokuse, istraživanja parazitskih objekata i ciljanu provjeru valjanosti ključnih potencijalnih metabolita kako bi se ojačao prijevod na proizvodnju u stvarnom svijetu.

 

4 Zaključci

Kemijska reorganizacija sastava korijenskog eksudata saksaula po dobi sastojine jasno je odgovarala razlikama uCistanchereakcije na klijanje sjemena, naglašavajući važnost razvojnog stadija domaćina u regulaciji fenotipova klijanja parazitskog sjemena. U travnju su se metabolički profili korijenskog eksudata značajno razlikovali među dobima sastojine. Trogodišnji eksudati saksaula pokazali su najizraženije razlike i odgovarali najvišimCistanchestopa klijavosti sjemena. Reprezentativne diferencijalne značajke u skladu s većom klijavošću uglavnom su bile koncentrirane na šećere, molekule povezane s vitaminom B6, flavonoide/fenole i molekule povezane s lipidima, uključujući metabolizam alfa-linolenske kiseline, metabolizam vitamina B6 i puteve povezane s flavonoidima. Odnos dob stajanja – eksudat – klijanje nije slijedio jednostavno linearno poboljšanje; srednja dob sastojine bila je vjerojatnija da će stvoriti kemijsku pozadinu u skladu s višim odgovorom na klijanje.

 

Autorski doprinosi

Zhao Zhen: konceptualizacija, metodologija, istraživanje, obrada podataka, analiza podataka, izrada, vizualizacija.
Fan Jinglong: metodologija, pregled i uređivanje, vizualizacija, nadzor, administracija projekta, prikupljanje sredstava.
Dong Weikang: istraživanje, čuvanje podataka.
Zhou Zhibin: resursi, nadzor, nabava sredstava.
Li Bingwen, Wang Shijie: metodologija, resursi, nadzor, prikupljanje sredstava.