Dijetalni flavanoli kakaa poboljšavaju mitohondrijske funkcije u skeletnim mišićima i mijenjaju metabolizam cijelog tijela kod zdravih miševa
Mar 14, 2022
za više informacija kontaktirajte:tina.xiang@wecistanche.com
Sažetak: Mitohondrijska disfunkcija naširoko je prijavljena u raznim bolestima i pridonosi njihovoj patogenezi. Procijenili smo učinakflavanoli kakaasuplementacija na funkciju mitohondrija i cijeli metabolizam te smo istražili je li mitohondrijska deacetilaza sirtuin-3 (Sirt3) uključena ili ne. Istražili smo učinke 15 dana CF suplementacije kod divljeg tipa i Sirt3-/miševa. Metabolizam cijelog tijela procijenjen je neizravnom kalorimetrijom, a obavljen je oralni test tolerancije glukoze kako bi se procijenilometabolizam glukoze. Respiratorna funkcija mitohondrija procijenjena je u permeabiliziranim vlaknima i kvantificiran je sadržaj piridinskih nukleotida (NAD plus i NADH). Kod divljeg tipa, suplementacija CF značajno je promijenila metabolizam cijelog tijela promicanjem upotrebe ugljikohidrata i poboljšanom tolerancijom glukoze. Suplementacija CF-om izazvala je značajan porast mitohondrijske mase, dok je došlo do značajne kvalitativne prilagodbe za održavanje proizvodnje H2O2 i staničnog oksidativnog stresa. Suplementacija CF-om izazvala je značajno povećanje sadržaja NAD plus i NADH. Svi gore navedeni učinci bili su prigušeni kod Sirt3-7miševa. Zajedno, suplementacija CF-om potaknula je metabolizam NAD-a koji stimulira metabolizam sirtuina i poboljšala funkciju mitohondrija, što je vjerojatno pridonijelo uočenoj prilagodbi metabolizma cijelog tijela, s većom sposobnošću korištenja ugljikohidrata, barem djelomično putem Sirt3.
Ključne riječi: flavanoli kakaa; metabolizam NAD; mitohondrijska masa; metabolizam glukoze; skeletni mišić
1. Uvod
Mitohondriji su substanične organele koje su uključene u višestruke stanične funkcije, kao što je prijenos energije putem mitohondrijske oksidativne fosforilacije i mitohondrijske proizvodnje vodikovog peroksida ili aktivacije stanične smrti posredovane mitohondrijima [1-3]. Novi dokazi upućuju na to da je mitohondrijska disfunkcija uključena u mnoge patologije i igra središnju ulogu u njihovoj patogenezi [4]. Naša je skupina izvijestila o oštećenju mitohondrija u bolesnika s dijabetesom tipa 1 mnogo prije kliničkih komplikacija [5]. Štoviše, smanjenje oksidativnog kapaciteta mitohondrija događa se starenjem čak i kod zdravih ljudi [6]. Stoga su identifikacije strategija za ublažavanje ovih disfunkcija ili povećanje mitohondrijske mase prilika za sprječavanje ili barem smanjenje učestalosti mnogih poremećaja ili povećanje aerobnog kapaciteta zdravih subjekata.
U tom kontekstu, od interesa je identifikacija sigurnih i prirodnih spojeva koji poboljšavaju funkciju mitohondrija i metabolizam cijelog tijela sa ili bez ograničenih nuspojava. Među prirodnim spojevima,flavanoli kakaa(CF) smatraju se obećavajućim molekulama jer se pokazalo da njihova konzumacija pozitivno utječe na zdravlje kardiovaskularnog sustava, inzulinsku rezistenciju ili imunološku funkciju [7]. Doista, dokazano je da CF poboljšava metabolizam glukoze, a kratkotrajna primjena CF-a je praćena povećanjem inzulinske osjetljivosti, čak i kod hipertenzivnih bolesnika koji ne podnose glukozu [8,9].
Među flavanolima, (-)-epikatehin (EPI) je najčešći monomer u CF-u, a EPI se smatra glavnom bioraspoloživom i bioaktivnom molekulom CF-a [10]. Konzistentan skup dokaza pokazuje da dodatak EPI poboljšava funkciju mitohondrija i/ili sadržaj u skeletnim mišićima [11]. Suplementacija EPI-ja stimulira višestruke putove konvergiranja na receptoru gama koaktivatoru 1-alfa(PGCl) aktiviranom proliferatorom peroksisoma i glavnim nuklearnim transkripcijskim kompleksima. EPI izravno pojačava stvaranje dušikovog oksida, što stimulira biogenezu mitohondrija [11]. Paralelno, sirtuini 1 i 3 su također stimulirani dodatkom EPI [11]. Upotreba proantocijanidina, oligomeraflavonoidikoji sadrže EPI, pokazalo se da povećava unutarstanične razine nikotinamid adenin dinukleotida (NAD plus ) povećanjem nekoliko prekursora za biosintezu NAD i pojačava razinu sirtuin-1 mRNA u jetri štakora [12]. Porodica sirtuina (Sirt), NAD-ovisna deacetilaza, sastoji se od sedam članova koji se razlikuju po substaničnoj distribuciji, specifičnosti supstrata i staničnim funkcijama [13]. Sirt1, opsežno proučavan član ove obitelji, stimulira mitohondrijsku biogenezu promicanjem deacetilacije PGCl, čime se pojačava njegova transkripcijska aktivnost [14]. Sirte, ključni metabolički senzor, stimuliran je nakon primjene EPI [12,15-17]. Međutim, utjecaj EPI na druge sirtuine nije istražen. Procjena EPI učinka bit će posebno zanimljiva na sirtuinima koji se nalaze unutar mitohondrija (Sirt3, Sirt 4 i Sirt5), za koje je poznato da moduliraju aktivnost Krebsovog ciklusa i enzima respiratornog lanca [18]. Sirt3, koji je visoko izražen u tkivima s visokim metaboličkim prometom i sadržajem mitohondrija, od posebnog je interesa s obzirom na njegovu kritičnu ulogu u održavanju normalne funkcije mitohondrija putem reverzibilne deacetilacije proteina lizina [19-21] Štoviše, Sirt3 igra važnu ulogu u regulacija metabolizma cijelog tijela [20. Pokazalo se da je Sirt3 promijenjen u skeletnim mišićima modela dijabetesa tipa 1 i tipa 2 i kardiovaskularnih bolesti [22,23]. Nadalje, sugerirano je da bi aktivacija Sirt3 mogla predstavljati obećavajuću terapijsku strategiju za poboljšanje mitohondrijske funkcije i metabolizma [23,24]. Stoga je od interesa utvrditi je li Sirt3 dio korisnih učinaka suplementacije CF-om na metabolizam cijelog tijela i funkciju mitohondrija.
U ovoj smo studiji upotrijebili integrativni pristup kako bismo istražili, kod miševa, učinak 15--dnevne CF suplementacije. Pretpostavili smo da bi suplementacija CF-om: (i) modificirala metabolizam cijelog tijela imetabolizam glukoze, (ii) povećati funkciju mitohondrija u oksidativnim i glikolitičkim mišićima u permeabiliziranim vlaknima, i (ii) potaknuti metabolizam NAD. Također smo istražili pretpostavljenu uključenost Sirt3 u biogenezu mitohondrija izazvanu CF-om i metabolizam cijelog tijela. Naše su hipoteze bile da bi učinci CF-a na metabolizam cijelog tijela i mitohondrijsku masu bili oslabljeni kod Sirt3-7miševa.
2. Metode
2.1. Životinje i prehrana
Za ovu studiju, mužjaci miševa stari 129S1/SvlmJ 10- tjedan dana kupljeni su od Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, SAD). Kako bismo utvrdili jesu li sirtuini uključeni u prilagodbu mitohondrijske mase i funkcije izazvanu primjenom CF-a, također smo upotrijebili 10-tjedne stare Sirt3 nokautirane mužjake miševa istog soja kao divlji tip [25]. Sirt3/miševi korišteni su za istraživanje uključenosti Sirt3 u biogenezu mitohondrija izazvanu CF-om i prilagodbe metabolizma cijelog tijela. Miševi su držani u prostoriji na reguliranoj temperaturi od 23-25 stupnjeva i kontroliranoj rasvjeti (12-h ciklusi svjetla i tame). Životinje su imale pristup hrani za glodavce i vodi iz slavine ad libitum.
Nakon najmanje tjedan dana privikavanja u objektu za životinje, pokusne životinje primile su dodatak CF oralnom sondom prirodnog ekstrakta (302,1 mg/kg tjelesne težine dva puta dnevno tijekom 15 dana) resuspendiranog u karboksimetilcelulozi (Sigma-Aldrich, St. Louis). , Mo, SAD). Sastav kakao praha opisan je u tablici 1 i dobiven je od Naturexa (Quart de Poblet, Španjolska). Sastav je utvrđen metodom tekućinske kromatografije visoke učinkovitosti, a 100 mg ekstrakta odgovara prosječno 475 mg suhih sjemenki kakaovca. Kontrolni miševi oralno su primili nosač sastavljen od sličnog sadržaja teobromina i kofeina otopljenog u karboksimetilcelulozi. Dnevna doza određena je u skladu s industrijskim smjernicama koje pretvaraju dozu za ljude u ekvivalentne doze za životinje na temelju površine tijela, a dozu za ljude pomnožili smo s 12,3 [26]. Oralnu gavažu izveo je iskusni tehničar.
2.2. Prikupljanje tkiva1
Dvadeset i četiri sata nakon zadnje oralne gavaže, životinje koje nisu gladovale anestezirane su ketaminom i ksilazinom (odnosno: 100 i 10 mg/kg). Prikupljanje tkiva je obavljeno odmah nakon postizanja anestezije. Soleus i bijeli dio gastrocnemiusa su izrezani. Uzorci su ili odmah zamrznuti u tekućem dušiku i pohranjeni na -80 stupnjeva za naknadnu analizu ili korišteni za pripremu skiniranih mišićnih vlakana.
2.3. Procjena metabolizma i tjelesne aktivnosti
Indirektna kalorimetrija i spontana tjelesna aktivnost mjereni su korištenjem Opsežnog sustava za praćenje laboratorijskih životinja (CLAMS; Columbus Instruments, Columbus, OH, SAD). Miševi su smješteni pojedinačno u komorama na 28 stupnjeva, sa svjetlom od 07h00 do 19h00 i ad libitum pristupom hrani za glodavce i vodi iz slavine. Miševi su bili aklimatizirani na metaboličke kaveze tri dana prije prvog dana prikupljanja podataka. Prikupljanje podataka obavljeno je petnaestog dana suplementacije. Potrošnja kisika (VO2), proizvodnja ugljičnog dioksida (VCO2) i omjer respiratorne izmjene (RER) izmjereni su s protokom zraka od 0.5 L/min i uzorkom zraka od 0.4 L/ min. Postotak relativne kumulativne učestalosti (PCRF) RER određen je tijekom 24- h razdoblja kako su prethodno opisali Riachi et al. (2004). Ukratko, PCRF je određen dodavanjem učestalosti svake podatkovne točke prethodnoj sekvenci povećanja (od 0,65 do 1,20 s povećanjem od 0,01)[27]. Metabolička fleksibilnost određena je Hillovim nagibom (H vrijednost) i 50. percentilom (EC50) PRCF krivulje te mjerenjem RER amplitude tijekom 24 sata (Riachi et al. 2004). Opća tjelesna aktivnost praćena je korištenjem senzorskog sustava upravljanog infracrvenom zrakom koji je detektirao aktivnost osi x i z. Procijenjeni su i ukupni brojevi (svaki put kada je greda slomljena) i ambulantni brojevi (svaki put kada je nova greda slomljena). X-ukupni broj (X-TOT) registrira se kada se životinja pomiče vodoravno više od 0,5 in i predstavlja male, ponavljajuće aktivnosti, kao što su češanje i njegovanje. X-ambulatorno brojanje (X-AMB) mjeri stvarnu lokomociju registrirajući brojanje samo kada životinja prekine novu gredu. Z-ukupni broj (Z-TOT) bilježi se kada se dogodi okomito kretanje od 1,5 in, tj. podizanje (Abreu-Vieira 2016). Za procjenu ugljikohidrata i mastioksidacijaiz VO2 i VCO2, koristili smo tablicu neproteinskog respiratornog kvocijenta od Péronneta i Massicottea koja je prethodno korištena na miševima [28,29].
2.4. Ukupna tjelesna i masna masa
Ukupna masna masa i ukupna nemasna masa određene su u neanesteziranih miševa kvantitativnom analizom rezonantne interferencije pomoću EchoMRI analizatora magnetske rezonancije cijelog tijela (Echo Medical System, Houston, TX, SAD). Ukupna masna masa predstavljala je zbroj svih masnih naslaga u tijelu. Ukupna nemasna masa uključuje uglavnom mišiće i unutarnje organe. Poznato je da skeletna mišićna masa čini najveći dio ukupne nemasne mase.
2.5. Oralni test tolerancije glukoze (OGTT)
Glikemija je mjerena pomoću kapi krvi sakupljene iz repa glukometrom (Accu-Chek Performa, Roche, Argentina). OGTT je izveden na miševima koji su gladovali 5 do 6 h. Mjerenje je obavljeno zadnjeg dana CF suplementacije. Nakon mjerenja bazalne glikemije (vrijeme O), miševima je zatim injicirana per os otopina 20 posto glukoze u sterilnoj vodi u dozi od 1,5 g glukoze na kg tjelesne težine-1. Glikemija je mjerena 15, 30, 60, 90 i 120 minuta nakon injekcije otopine glukoze. Inkrementalna površina krivulje glukoze je zatim izračunata kao mjera tolerancije glukoze.
2.6.qRT-PCR analiza
The forward (F) and reverse (R) primers of the selected genes used in this study are presented in Table 2. Total RNA was obtained from pulverized frozen white gastrocnemius muscle using Trizol reagent (Invitrogen Life Technologies, Rockville, MD, USA). The purity, integrity, and quantity of RNA were evaluated using a microplate reader (Synergy H1(Biotek Instruments, Winooski, Vermont). The sample was considered pure when the ratio OD260/OD280 was>1.8. cDNA je sintetizirana iz ukupne RNA （2 µL） koristeći iScript supermix reverzne transkripcije za RT-qPCR (Biorad, Hercules, CA, SAD). Ukupni RT proizvodi analizirani su kvantitativnom lančanom reakcijom polimeraze (PCR) koristeći 2x Platinium SYBR Green qPCR SuperMix-UDG prema specifikacijama proizvođača (Invitrogen Lige Technologies, Burlington, Kanada). Ciklus je postignut u cikleru CFX96 (Biorad, Hercules, Kalifornija; uvjeti: 95 stupnjeva C tijekom 10 minuta i 40 ciklusa od 95 stupnjeva tijekom 30 s, 55 stupnjeva tijekom 45 sekundi i 72 stupnja tijekom 45 sekundi). Na kraju svakog ciklusa, odsutnost formiranja primer-dimera i prisutnost jedinstvenog amplikona potvrđeni su pomoću krivulje taljenja. Vrijednosti praga ciklusa (Ct) upotrijebljene su prema 2-A△Ct metodi za analizu qPCR podataka, s ß-aktinom ili HPRT1 kao kućnim genom【30】. Kvantitativne vrijednosti RT-PCR bile su povezane s onima kontrolne skupine, koje su bile postavljene na 1.
2.7. Enzimske aktivnosti
Mjerenje specifične aktivnosti kompleksa transportnog lanca elektrona i citrat sintaze provedeno je spektrofotometrijski kako je prethodno opisano [31]. Pulverizirani smrznuti bijeli gastrocnemius mišići (~30 mg) homogenizirani su vibrirajućim homogenizatorom mikrozrnaca u 500 uL pufera za homogenizaciju (120 mM KCl, 20 mM HEPES, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA i 5 mg·mL-I BSA , pH 7,4) nakon čega je uslijedilo dodavanje 500 μL hipotoničnog medija （25 mM kalijevog fosfata i 5 mM MgCl, pH 7,2). Uzorci su zatim podvrgnuti tri kruga ciklusa smrzavanja i odmrzavanja u tekućem dušiku. Uzorci su centrifugirani 10 minuta na 600×g na 4 stupnja, a supernatant je držan na ledu do analize. Sadržaj proteina određen je u supernatantu u triplikatu korištenjem Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA).
Aktivnost citrat sintaze (CS) određena je spektrofotometrijski na 412 nm nakon redukcije 2 mM 5,5'-ditio-bis(2-nitrobenzojeve kiseline) u prisutnosti 0.1 mM acetil -CoA i 12 mM oksaloctene kiseline u 200 mM Tris puferu (pH 7,4). Ispitivanje NADH-decilubikinon oksidoreduktaze (kompleks I) osjetljivo na rotenon provedeno je na 340 nm pomoću akceptora 2,3-dimetoksi-5-metil-6-n-decil-14-benzokinona （ 80 μM） i NADH kao donor elektrona （200 μM） u 10 mM Tris puferu（pH 8,0）. Dodatak 4 μM rotenona korišten je za kvantificiranje aktivnosti osjetljive na rotenon. Aktivnost citokrom oksidaze (kompleks IV) izvedena je na 550 nm korištenjem 10 μM reduciranog citokroma c kao donora i 2,5 mM n-dodecil-ß-maltozida za permeabilizaciju obje mitohondrijske membrane u 100 mM puferu kalijevog fosfata (pH 7,0).
Svi enzimski testovi određeni su u triplikatu, a rezultati su povezani s onima kontrolne skupine, koji su postavljeni na 100.
2.8. Procjena mitohondrija
Mitohondrijsko disanje i proizvodnja mitohondrijskog H2O2 proučavani su in situ u vlaknima propusnim za saponin korištenjem bijelih mišića gastrocnemiusa i soleusa|1]. Ukratko, vlakna su odvojena pod binokularnim mikroskopom u otopini A na 4 stupnja (u mM: 2,77 CaK2 EGTA, 7,23 K, EGTA, 6,56 MgCl2, 20 taurini,0.5 DTT,5{ {50}} K-metan sulfonati, 20 imidazola, 5,7 Na2 ATP i 15 kreatin-fosfata, pH 7,1) i permeabilizirani u otopini A s 50 ug·mL-I saponina tijekom 30 minuta na 4 stupnja. Respiratorna funkcija mitohondrija određena je u oksimetru opremljenom elektrodom tipa Clark (Oxygraph, Hansatech Instruments, Glasgow). Komora je napunjena s 1 mL otopine B (u mM: 2,77 CaK, EGTA, 7,23 K, EGTA, 6,56 MgCl, 20 taurina, 0,5 DTT, 50 K-metan sulfonata i 20 imidazola, pH 7,1) i nakon snimanja osnovnog sadržaja kisika u komori, jedan snop od 1-2 mg suhe težine permeabiliziranih miofibera stavljen je u komoru, koja je zatim zapečaćena. Nakon očitanja osnovne vrijednosti, dodani su sljedeći dodaci: palmitoil karnitin i malat (160 μM∶5 mM), glutamat (10 mM), sukcinat (25 mM), rotenon (0,5 μm), razdvojač CCCP (1 μM), antimicin -A （8 uM）, i N,N',N'-tetrametil-p-fenilendiamin dihidroklorid i askorbat (0,9:9 mM). Disanje je mjereno na 23 stupnja uz kontinuirano miješanje. Na kraju svakog testa, vlakna su pažljivo uklonjena iz ksilografske ćelije, upijena i osušena najmanje 24 sata na ~80°C za određivanje težine vlakana. Stope potrošnje O2 (JO2) izražene su u nmol O2 min-1.(mg suhe težine)-I. Sva mjerenja su provedena najmanje u duplikatu.
Neto otpuštanje H2O2 disanjem mitohondrija izmjereno je u permeabiliziranim snopovima vlakana s fluorescentnom sondom Amplex Red（20 μM∶emisija pobude∶563-587 nm）, kao što je prethodno opisano [32]. Nakon pripreme permeabiliziranih vlakana, uzoraka
namijenjeni mjerenju H2O2 isprani su tri puta u puferu Z(u mM:110 K-Mes, 35 KCl,1 EGTA,5 K2HPO4, 3MgCl,6H2O i 0.5 mg:mL{ {14}} BSA, pH7,3 na 4 stupnja). Snopovi vlakana ({{20}}.3-1.0 mg suhe težine) su inkubirani na 37 stupnjeva u kvarcnoj mikrokiveti uz kontinuirano magnetsko miješanje u 600 uL pufera Z (pH 7,3 na 37C) dopunjen s 1,2 U·mL-I peroksidaze hrena. Osnovna očitanja fluorescencije uzeta su u odsutnosti bilo kakvih egzogenih respiratornih supstrata. Sljedeći dodaci su tada napravljeni sekvencijalno: glutamat (5 mM), sukcinat (5 mM), rotenon (0,5 uM), ADP (10 mM) i antimicin-A (8 µM). Na kraju svakog testa, vlakna su pažljivo izvaditi iz kivete, upijati i osušiti da se odredi težina vlakana. Brzine proizvodnje H2O2 izražene su u AU·min-1.(mg suhe težine)-I i po oksfosnom kapacitetu koji je odgovarao maksimalnom mitohondrijskom disanju u stanju fosforilacije. Sva mjerenja su provedena najmanje u duplikatu.
Kapacitet mitohondrijske retencije kalcija (CRC) procijenjen je u bijelim gastronemiusnim mišićnim vlaknima kao što je prethodno opisano [33]. Ukratko, vlakna su inkubirana u kvarcnoj mikrokiveti uz kontinuirano miješanje u 600 μL CRC pufera （u mM∶250 saharoze, 10 MOPS, 0,005 EGTA i 10P;-Tris, pH7,3). Vlakna su zatim izložena jednom pulsu od 20 nM Ca2 plus. Promjene u ekstramitohondrijskoj koncentraciji kalcija praćene su fluorometrijski upotrebom Calcium green 5N (1 mM: ekscitacija-emisija: 505-535 nm). Osjetljivost pora na prijelaz propusnosti (PTP) procijenjena je mjerenjem vremena potrebnog za otvaranje PTP, a CRC je uzet kao ukupna količina Ca' akumulirana u mitohondrijima prije njegovog otpuštanja. Na kraju svakog testa, vlakna su pažljivo uklonjena iz kivete, upijena i osušena kako bi se odredila težina vlakana. CRC vrijednosti su izražene u nM Ca2 plus po mg suhe težine.
2.9. Western Blot analiza
Proteini iz mišića bijelog gastrocnemiusa i soleusa razrijeđeni su u Laemmli puferu i odvojeni na Mini-PROTEAN TGX Stain-Free 10 posto gotovim poliakrilamidnim gelovima (Biorad); interni standard je napunjen na svaki gel. Elektroforetsko odvajanje je učinjeno na 200 V tijekom 35 minuta u migracijskom puferu (25 mM TrisBase, 0.2 M glicin i 1 posto SDS (p/v)). Stain-Free(SF) tehnologija sadrži zaštićeni tri halo spoj koji reagira s proteinima, čineći ih vidljivima kroz UV izlaganje. SF snimanje je provedeno korištenjem softvera ChemiDoc MP Imager i Image Lab4.0.1 (Biorad, Hercules, Kalifornija, SAD) s 5-min vremenom aktivacije mrlja, te su stoga vizualizirani ukupni uzorci proteina. Proteini su zatim prebačeni na 0,2 um nitroceluloznu ploču koristeći Trans-Blot Turbo Transfer System (Biorad). Kvaliteta prijenosa kontrolirana je slikovnim membranama pomoću SF tehnologije. Nakon koraka prijenosa, karbonilni proteini su derivatizirani dinitrofenilhidrazinom razrijeđenim u 2N HCL i konačno su opsežno isprani metanolom. Membrane su blokirane s 5 posto nemasnog suhog mlijeka u tris-puferiranoj slanoj otopini koja sadrži Tween-20 (TBST: 15 mM Tris/HCl, pH7,6, 140 mM NaCl i 0,05 posto Tween-20) za 1 h na sobnoj temperaturi. Membrane su zatim inkubirane na 4 stupnja preko noći ili 2 h na sobnoj temperaturi sa sljedećim primarnim protutijelima: proteinsko karbonilno primarno protutijelo (Anti-DNP; #STA-308, Cell Biolabs) i SOD2 (#Ab13533, Abcam). Nakon tri ispiranja od 10 minuta u TBST-u, membrane su ispitane sekundarnim antitijelima za protein karbonil (HRP-konjugat; #STA-308, Cell Biolabs) i SOD2 (anti-zečji IgG-HRP povezan; #7074, Cell Signalling) u otopini za blokiranje 2 h na sobnoj temperaturi i na kraju su opsežno isprani s TBST. Razrjeđenje primarnih i sekundarnih protutijela optimizirano je za svako protutijelo. Detekcija kemiluminiscencije provedena je pomoću ECL Clarity (Biorad), a snimanje slika učinjeno je pomoću ChemiDocMP. Sve slike analizirane su softverom Image Lab 4.0.1. Normalizacija intenziteta signala proteina provedena je nakon kvantifikacije odgovarajućih ukupnih razina proteina na SF slikama, kontroli uzorka i internim standardima.
2.10. NAD mjerenje
Ukupne razine NAD i NADH izmjerene su u homogeniziranom bijelom gastrocnemiusu korištenjem komercijalnog kompleta (#K337-100, Biovision, SAD) i prema uputama proizvođača. Ukratko, ekstrahiran je ukupni skup NAD (NADt= NADt i NADH). Za svaki od ekstrahiranih uzoraka, polovica uzorka zagrijavana je na 60 stupnjeva 30 minuta kako bi se razgradio NADt, a NADH ostao netaknut. Uzorci NADt i NADH pomiješani su s cikličkim enzimom NAD, a apsorbancija je izmjerena na 450 nm. NADt i NADH su kvantificirani usporedbom sa standardnom krivuljom NADH i normalizacijom na mg proteina. Na kraju je izračunat omjer NAD plus (NADt-NADH) prema NADH. Sva ispitivanja su izvedena u tri primjerka.
2.11. Statistika
Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD). Normalnost podataka procijenjena je D'Agostino-Pearsonovim testom normalnosti. Analiza podataka provedena je korištenjem Studentovog t-testa i dvosmjerne ANOVA (grupa i vrijeme) za ponovljena mjerenja praćena Bonferronijevim post hoc testom korištenjem Prism8.4.1 (GraphPad Software, San Diego, CA, SAD). Primijenjena je dvostrana razina od 5 posto za pogrešku tipa I.
3. Rezultati
3.1. Sastav tijela i metabolizam cijelog tijela
Petnaest dana CF suplementacije, kod miševa divljeg tipa (WT), nije promijenilo tjelesnu težinu (p=0.091), nemasnu masu (p=0.{{24} }73) i masa masnog tkiva procijenjena pomoću EchoMRI (p=0.89; Slika 1A). Stope potrošnje O2 izražene po nemasnoj masi bile su značajno veće u ciklusu tame (8±8 posto, p=0.042), dok su ostale slične u ciklusu svjetlosti (p =0 .392; Slika 1B.). Nije bilo promjena u lokomotornoj aktivnosti (podaci nisu prikazani). CF miševi pokazali su značajno povećanje potrošnje energije cijelog tijela za 15±15 posto (p =0.042; Slika 1C) i u unos hrane (0,08±0,01 naspram 0,11±0,01 g po nemasnoj tjelesnoj težini, odnosno skupini CF i WT, p=0.013, slika 1D).
Suplementacija CF-om značajno je promijenila metabolizam cijelog tijela: glavni učinak većeg RER-a u skupini koja je primala CF primijećen je tijekom 24 sata (p=0.023, slika 2A), a srednji RER tijekom 12 sati bio je veći u CF skupini u ciklusima svjetla i tame (plus 5±3 posto, p=0.035 odnosno plus 9±4 posto, p=0.026). Štoviše, suplementacija CF-om pospješila je korištenje ugljikohidrata (CHO) (51±13 posto potrošnje energije ovisilo je o oksidaciji CHO-a u CF skupini naspram 37±12 posto u kontrolnoj skupini tijekom svjetlosnog ciklusa, p=0).108 i 71±21 posto u CF skupini naspram 47±24 posto u kontrolnoj skupini tijekom ciklusa tame, p=0.004; Slika 2B.). Međutim, kada se izrazi u kJ, nije bilo razlike u CHO oksidaciji niti oksidaciji masnih kiselina (CHOoksidacija: 3,7±1,4 kcal·d-1 u kontroli naspram 4,4±1,7 kcal. nemasne tjelesne mase-1). d-1 u CF,p=0.33 i oksidacija masnih kiselina: 2,3± 1,0 kcal·d-Iin kontrola u odnosu na 2,6±0,87 kcal. nemasna tjelesna masa-1.d{{ 50}}u CF,p=0.608). Analiza PRCF-a RER-a otkrila je porast vrijednosti EC50 u CF skupini (p=0,009; Slika 2D) što znači da CF uzrokuje pomak prema većoj upotrebi ugljikohidrata. Smanjenje nagiba Hilla primijećeno je u CF skupini (H vrijednosti: 25,16±4,44 u kontrolama u odnosu na 12,79±3,96 u CF skupini, p<0.001). moreover,="" the="" rer="" amplitude="" over="" 24h="" was="" increased="" by="" 31±="" 31%="" in="" the="" cf="" group="" (p="0.035)." cf="" supplementation="" improved="" glucose="" tolerance="" following="" oral="" glucose="" administration="" from="" unchanged="" baseline="" blood="" glucose="" levels="" after="" an="" overnight="" fast="" (figure="" 2e,p="0.003)." the="" area="" under="" the="" capillary="" blood="" glucose="" curve="" was="" lower="" in="" the="" cf="" group(1018±135="" vs.="" 1181±="" 170="" mm·120="" min,="" p="0.005;" figure="">
3.2. Mitohondrijska bioenergetika
Testirali smo učinak suplementacije CF na energiju mitohondrija u bijelom gastrocnemius i soleus mišiću u WT miševa. Uočeno je veće mitohondrijsko disanje korištenjem kompleksnih IV supstrata u bijelim mišićima gastrocnemius i soleus (p=0.004 odnosno p=0.028; Slika 3A, B). Nisu primijećene modifikacije omjera respiracije CII/CI i CIV/CI (p =0.899 i p =0.701 za bijeli gastroknemius i p=0.693 i p{{ 11}}.912 za mišiće soleusa, podaci nisu prikazani). Štoviše, aktivnosti kompleksa I, IV i citrat sintaze značajno su povećane u bijelom gastrocnemius mišiću (odnosno: plus 31 ± 27 posto, p=0.004; plus 28 ± 38 posto, p=0 .027; plus 35±38 posto,p= 0.009; plus 14±13 posto,p=0.040;Slika 3C).Sposobnost mitohondrija da oksidiraju palmitoil-karnitin ima tendenciju povećanja u bijeli gastrocnemius (plus 24±12 posto, p =0.096; slika 3D), dok nije primijećena razlika u soleusu (p =0.363). Relativne stope respiracije stimulirane palmitoil-karnitinom bile su nepromijenjene kada su izražene u funkciji disanja kompleksa I (62±11 u kontrolnoj skupini naspram 64±20 u CF skupini u bijelom gastrocnemiusu i 70±18 naspram 72±16 u soleusu). Zatim smo istražili osjetljivost na Ca plus-inducirano PTP otvaranje u bijelom gastrocnemiusu. Kao što je prikazano na slici 3E, ni vrijeme do otvaranja PTP-a ni kapacitet retencije Ca² nisu promijenjeni nakon CF suplementacije (p=0.608 odnosno p=0.943).
Procjena mRNA gena uključenih u biogenezu mitohondrija pokazala je 70-postotnu regulaciju mRNA NRF1, dok nije zabilježena razlika za PGCl, Tfam, CS, ND1, ND2, SDHa i Cox2 (Tablica 3). Istražili smo, na nekoliko uzoraka, učinak dodatka CF na mitohondrijske superkomplekse (Slika S1, Dodatni materijali). Denzitometrijska analiza sugerira da je CF suplementacija povećala ukupni sadržaj superkompleksa bez kvalitativne prilagodbe ili preraspodjele. Doista, respiratorna gustoća poboljšana je za 58 posto korištenjem kompleksa I i kompleksaⅡ sondi i za 93 posto korištenjem kompleksa I sonde. Slično tome, sadržaj kompleksa I i kompleksa III ugrađen u superkomplekse bio je veći u CF skupini.
Suplementacija CF-om smanjuje emisiju mitohondrijskih ROS-a. Dok je emisija H2O2 ostala nepromijenjena u bijelom gastrocnemiusu i soleusu kada je izražena po suhoj težini (Slika 4A, B, respektivno), stope su smanjene kada su izražene po sadržaju mitohondrija (Slika 4C). Glavni pozitivni učinak suplementacije CF primijećen je u različitim stanjima u bijelom gastrocnemiusu (str<0.048; figure="" 4c).="" the="" mitochondrial="" h2o2="" emission="" was="" also="" significantly="" reduced="" when="" expressed="" peroxidative="" phosphorylation="" capacity="" assessed="" by="" state="" 4="" respiration="" using="" complex="" i+ii="" substrates="" by="" 26±13%="" in="" the="" white="" gastrocnemius="" (p="0.044)and" by="" 29±12%="" in="" the="" soleus(p="0.024;" figure="">
3.3. Markeri oksidativnog stresa u skeletnim mišićima
Dodatak CF-u nije utjecao na razinu oksidativnog stresa staničnih proteina kod WT miševa jer je stanični sadržaj SOD2 bio sličan u eksperimentalnim i kontrolnim skupinama u bijelim gastrocnemiusima i soleusima (Slika 4E). Štoviše, nije uočena razlika u karbonilaciji proteina u bijelom gastrocnemiusu i soleusu (Slika 4F). Osim toga, nije primijećena razlika u ekspresiji mRNA katalaze i MnSod nakon dodavanja CF (Tablica 3).
3.4. Metabolizam NAD
Ukupni skup piridinskih nukleotida povećao se nakon CF suplementacije za 36±33 posto (p=0.012). Konkretno, sadržaj NAD i NADH porastao je u bijelom gastrocnemiusu (odnosno za 69±60 posto, p{{6 }}.026 i 29± 42 posto ,p=0.017; Slika 5A,B) i omjer NAD plus /NADH imao je tendenciju povećanja u CF skupini (p =0.084). Ne značajan učinak primijećen je za Sirt3 mRNA (p=0.096), NMNAT mRNA (p=0.094) i Sirt1 mRNA (p =0.869; Tablica 3 ).
3.5. Odgovor cijelog tijela i stanični metabolizam nakon CF suplementacije u Sirt3-/ miševa
Ispitali smo učinak suplementacije CF kod Sirt{{0}}miševa. Tjelesni sastav kao težina, nemasna masa i masna masa nisu se razlikovali između CF i kontrolnih skupina (p= 0.52, p=0.66, p=0.45, respektivno; Slika 6A). Slično tome, suplementacija CF nije utjecala na dnevnu potrošnju energije ({{10}}.38±0.{{40}}1 Kcal. mršavo tijelo masa-1.dan-1 u kontrolama u odnosu na 0.39 ± 0.01 Kcal·mršava tjelesna masa-1.dan-1 u CF, p=0.502; slika 6B). RER je bio sličan između obje skupine u ciklusima svjetlosti i tame (p=0.301; slika 6C), a dodatak CF nije utjecao na oksidaciju supstrata (44 ± 17 posto potrošnje energije ovisilo je o oksidaciji CHO u kontrolna skupina naspram 50 ± 11 posto u CF skupini tijekom svijetle faze, p=0.209 i 65 ± 19 posto u kontrolnoj skupini naspram 77 ± 21 posto u CF skupini tijekom tamne faze, p=0.395; slika 6D). Metabolička fleksibilnost procijenjena amplitudom RER-a tijekom 24 sata ostala je slična između dviju skupina (0,19±0,05 u kontrolnoj naspram 0,20±0,03 u CF,p=0.604), dok je nagib PRCF-a bio smanjen u CF skupini (H vrijednosti: 17,77±4,38 u kontroli naspram 12,79±3,93 u CF, p=0.039).
Zatim smo usporedili učinak suplementacije CF na aktivnosti mitohondrijskih enzima. Suplementacija CF-om nije uspjela povećati aktivnost enzima kompleksa I, I, IV i CS u Sirt3-/miševima kao što je ranije primijećeno u WT (odnosno: p=0.623,p=0 .629,p=0.283 i p=0.791, Slika 6E). Veća enzimska aktivnost kompleksa i IV primijećena je kod WT miševa u usporedbi sa Sirt3-7miševima nakon CF suplementacije ( odnosno: p=0.027 i P=0.045)
4. Rasprava
U ovoj studiji pružamo integrativnu analizu učinka uzimanja CF. Uočili smo da je kronično uzimanje CF-a poboljšalo mitohondrijsko disanje i smanjilo proizvodnju H2O2, procijenjeno u njihovom okruženju miofilibera, dok je osjetljivost na otvaranje PTP-a bila nepromijenjena. Gutanje CF-a pojačalo je NADmetabolizam, podupirući uključenost puteva sirtuina u promatranim mitohondrijskim prilagodbama. Također smo primijetili modifikacije metabolizma cijelog tijela prema većoj sposobnosti korištenja ugljikohidrata kao glavnog supstrata što sugerira da su prilagodbe mitohondrija vjerojatno doprinijele promatranoj prilagodbi metabolizma cijelog tijela.
4.1.Metabolizam
Dijetetska primjena kakaovih flavanola identificirana je kao učinkovita strategija za ublažavanje intolerancije na glukozu, dopuštajući prilike za ublažavanje metaboličkih bolesti [34]. Naši rezultati su u skladu s prethodnim studijama koje su prijavile povećanu toleranciju glukoze nakon uzimanja flavanola [35,36]. Predloženi mehanizmi za ovaj učinak uključuju povećanje translokacije GLUT4 prema staničnoj membrani, povećanje fosforilacije AMPK i pojačanu regulaciju ekspresije UCP-2 gena u skeletnim mišićima [8,37] . Štoviše, uzimanje CF-a povezano je s poboljšanjem osjetljivosti na inzulin kod ljudi [8]. Nakon 15 dana konzumacije tamne čokolade, kod zdravih ispitanika uočeno je smanjenje homeostazne procjene indeksa inzulinske rezistencije uz istodobno povećanje kvantitativnog indeksa provjere osjetljivosti na inzulin i indeksa inzulinske osjetljivosti [8]. Također smo primijetili istodobno povećanje tolerancije glukoze i metaboličke fleksibilnosti kod WT miševa, što se odnosi na sposobnost organizma da prilagodi oksidaciju goriva dostupnosti goriva [38]. Zanimljivo, dok su oslabljeni oksidacijski kapacitet mitohondrija i povezana oksidacija supstrata bili povezani s inzulinskom rezistencijom 39, trening izdržljivosti povećao je sadržaj mitohondrija, osjetljivost na inzulin i metaboličku fleksibilnost [38]. Stoga su sadašnji rezultati specifični za suplementaciju CF-om i na njih ne utječe spontana aktivnost.
Pozitivan učinak CF-a na metaboličku fleksibilnost, kao i povećanje aktivnosti mitohondrijskih kompleksa, bili su prigušeni kod Sirt3-7miševa, što ukazuje da se pozitivni učinci CF-a javljaju barem djelomično kroz Sirt3. Ovi rezultati podupiru prethodne nalaze i središnju ulogu Sirt3 u regulaciji metaboličke fleksibilnosti [24]. Naši rezultati pokazuju da povećanje mitohondrijske funkcije može poboljšati metaboličku fleksibilnost. Međutim, osim mitohondrijske funkcije, bazalni respiratorni kvocijent, brzina odlaganja glukoze, kapacitet skladištenja lipida u masnom tkivu i koncentracija slobodnih masnih kiselina u plazmi također su identificirani kao odlučujući faktori metaboličke fleksibilnosti i treba ih uzeti u obzir [40]. Buduće studije trebale bi dublje procijeniti stanične determinante metaboličke fleksibilnosti kako bi produbile naše razumijevanje temeljnih uzroka poboljšanja metaboličke fleksibilnosti nakon suplementacije CF-om.
Procjena metabolizma cijelog tijela otkrila je povećanje relativne oksidacije CHO nakon suplementacije CF. Ovaj rezultat je u suprotnosti s prethodnom studijom koja je izvijestila o povećanju lipolize nakon akutnog gutanja flavanola ili dvotjedne suplementacije flavan-3-olima kod miševa [36]. Osim razlika u sastavu ekstrakta, ovi kontradiktorni nalazi mogu biti rezultat pleiotropnih učinaka NO. Dobro je prihvaćeno da uzimanje CF stimulira proizvodnju ili bioraspoloživost metabolizma NO [7]. S jedne strane, NO stimulira transport i unos glukoze u skeletnim mišićima. Stimulacija proizvodnje NO u miotubusima izvedenim iz stanične linije inzulinom ili vodikovim peroksidom rezultirala je povećanjem translokacije GLUT4, koja je smanjena inhibicijom nNOS [41]. Štoviše, NO može povećati transport glukoze u putu neovisnom o inzulinu, što dovodi do povećanja razine cikličkog GMP-a i AMPK [42], što potiče oksidaciju glukoze u skeletnim mišićima štakora neovisno o dostupnosti i oksidaciji masnih kiselina [43]. S druge strane, NO potiče oksidaciju masnih kiselina smanjenjem razine malonil-CoA putem inhibicije acetil-CoA karboksilaze i aktivacije malonil-CoA dekarboksilaze u skeletnim mišićima[44]. Iako smo uočili pomak prema nižem relativnom udjelu korištenja masne kiseline kao supstrata s CF-om, nije bilo razlike u pogledu apsolutnih vrijednosti izraženih u kJ. Ovo sugerira da se povećanje utroška energije uočenog uz dodatak CF-a oslanja na povećanje oksidacije glukoze. Stoga ovi rezultati podržavaju ideju da konzumacija CF povećava osjetljivost na inzulin i potiče oksidaciju glukoze bez popratnog učinka na kapacitet oksidacije masnih kiselina. Ovi rezultati pokreću pitanje relevantnosti korištenja kakaovih flavanola u kontekstu prehrane bogate mastima. Buduće studije trebale bi procijeniti moguće štetne učinke povezanosti CF suplementacije i prehrane s visokim udjelom masti.
4.2. Funkcija mitohondrija
Pokazalo se da unos flavanola iz kakaa u ishrani poboljšava funkciju mitohondrija, uključujući (i) mitohondrijsko disanje i enzimske aktivnosti lanca transporta elektrona; (i) mitohondrijsko oslobađanje H2O2, što odražava proizvodnju mitohondrijskih reaktivnih vrsta kisika (ROS); i (i) kapacitet zadržavanja mitohondrijskog kalcija koji odražava osjetljivost na otvaranje mitohondrijske propusnosti prijelaznih pora (mPTP) (za pregled pogledajte [11]. Naši su rezultati u skladu s prethodnim studijama; usprkos tome, naša je studija bila prva koja je procijenila učinak Suplementacija CF-a na mitohondrijskoj funkciji procijenjenoj in situ u permeabiliziranim vlaknima i u različitim tipovima mišića. Za razliku od prethodnih studija na izoliranim mitohondrijima, procjena mitohondrijske funkcije u permeabiliziranim vlaknima čuva morfologiju mitohondrija, funkcionalne interakcije s drugim unutarstaničnim komponentama [1] i izbjegava strukturu mitohondrija poremećaj tijekom procesa izolacije mitohondrija [32] Stoga je važno proučavati funkciju mitohondrija u tkivnim preparatima gdje je struktura mitohondrija očuvana, a cijeli mitohondrijski pul je zastupljen kako bi se bolje procijenio odgovor na liječenje.
Prethodne studije provedene u staničnoj kulturi ili in vivo na miševima pokazale su da suplementacija EPI-jem, koji se smatra glavnom bioaktivnom molekulom u CF-u, povećava maksimalno disanje stimulirano ADP-om (npr. disanje u stanju 3) kada se mitohondriji energiziraju kombinacijom energije supstrati koji hrane različita mjesta duž dišnog lanca [45-49]. U skladu s ovim rezultatima, uočili smo glavni učinak dodatka CF na mitohondrijsko disanje u oksidativnim i glikolitičkim mišićima. Kako bismo utvrdili je li ovo povećanje povezano s povećanjem mitohondrijske mase ili preoblikovanjem mitohondrijskih respiratornih kompleksa, procijenili smo mitohondrijske superkomplekse iz mišića kvadricepsa. Smatra se da te supramolekularne strukture smanjuju proizvodnju ROS-a, stabiliziraju ili pomažu u sastavljanju pojedinačnih kompleksa, reguliraju aktivnost respiratornog lanca i sprječavaju agregaciju proteina u unutarnjoj mitohondrijskoj membrani bogatoj proteinima [50-52]. Unatoč ograničenom broju mjera, vizualna analiza rezultata (Dodatni materijali) sugerira da suplementacija CF-om izaziva povećanje mitohondrijske mase, što se odražava povećanjem svih superkompleksnih vrsta, a ne specifičnim reorganizacijama kompleksa respiratornog lanca. Zajedno, ovi rezultati sugeriraju da CF promiče povećanje mitohondrijske mase bez kvalitativne prilagodbe sklopa dišnog lanca.
Tijekom disanja mitohondrija stvaraju se različite količine superoksida koji se mogu metabolizirati u druge vrste ROS [53]. Iako je prekomjerna proizvodnja ROS-a iz mitohondrija uključena u široki spektar patologija, niske fiziološke koncentracije ROS-a mogu imati korisne učinke, poput zaštite od infektivnih agenasa i sudjelovanja u staničnoj signalizaciji [2,54]. Prethodne studije provedene in vivo na glodavcima i ljudima te na modelima staničnih kultura izvijestile su o korisnim učincima dodatka CF na proizvodnju ROS-a i različite antioksidativne sustave [11]. Na primjer, oralna gavaža s EPI tijekom 15 dana povećava aktivnost SOD2 i katalaze u mišićima kvadricepsa [17]. Dok mitohondrijska proizvodnja ROS-a nije naširoko procijenjena, primijetili smo da su razine proizvodnje ROS-a bile slične kada su vrijednosti izražene po težini mišića, dok je proizvodnja bila smanjena kada je izražena po mitohondrijskoj masi, što sugerira da dolazi do kvalitativnih prilagodbi kako bi se održale fiziološke koncentracije ROS-a. Štoviše, nismo primijetili nikakav učinak CF-a na SOD2 niti ROS-inducirana oštećenja procijenjena karbonilacijom proteina. Dok CF povećava skupove antioksidativnih proteina, uključujući široko prijavljene razine SOD2 i katalaze [16,17,55], ova prilagodba nije uvijek bila povezana sa smanjenjem oštećenja izazvanih ROS-om [56-59]. Ovi podaci podržavaju teoriju da su niske razine proizvodnje ROS potrebne za normalnu staničnu homeostazu [2]. Zajedno, ovi rezultati sugeriraju da, istodobno s povećanjem mitohondrijske mase, CF potiče kvalitativne prilagodbe mitohondrija kako bi se poboljšao njegov antioksidativni kapacitet i održala niska razina proizvodnje ROS-a.
4.3.Mitohondrijska biogeneza
Mitohondrijska masa je rezultat međuigre između mitohondrijske biogeneze i mitofagije. Naše se istraživanje usredotočilo na biogenezu mitohondrija aktiviranu konzumacijom polifenola [60]. Mitohondrijska biogeneza je stanični proces koji poboljšava masu mitohondrija. Ovaj složeni i visoko regulirani proces uključuje nekoliko transkripcijskih faktora, nuklearnih hormonskih receptora i transkripcijskih koaktivatora koji djeluju kolektivno kako bi koordinirali promjene u ekspresiji nuklearnih i mitohondrijskih DNA kodiranih gena [61]. Prethodne studije pokušale su utvrditi koji put(evi) mogu biti u osnovi mitohondrijske biogeneze izazvane dodatkom CF. Stimulacija signalizacije ovisne o NO pojavila se kao središnji put uključen u biogenezu mitohondrija. Suplementacija CF-om pojačava stvaranje NO inhibiranjem enzima arginaze koji razgrađuje arginin, što povećava dostupnost L-arginina za biosintezu NO [62,63]. Štoviše, upotrebom inhibitora eNOS djelomično je prigušen stimulirajući učinak epikatehina na biogenezu mitohondrija [17]. Ovi rezultati sugeriraju uključenost drugih signalnih putova za stimulaciju mitohondrijske biogeneze.
Nedavno su Aragones i sur. (2016.) izvijestili su da prehrambeni proantocijanidini, članovi obitelji polifenola, potiču jetreni NAD plus metabolizam poboljšavajući put biosinteze de sada NAD plus i aktivnost Sirte na način ovisan o dozi kod štakora[12]. Nadalje, jetra izvozi prekursore NADt u druge organe, poput skeletnih mišića, koji imaju manji kapacitet za sintezu NAD, povećavajući mogućnost proširenja učinaka opaženih u jetri na cijeli organizam [64]. Dok su neke studije izvijestile o učinku CF suplementacije na sadržaj Sirt1 proteina, aktivnost ili mRNA [12,15-17,65,66], uključenost metabolizma NAD u mitohondrijsku biogenezu nakon CF suplementacije korištenjem gubitka ili dobitka funkcija nikada nije testirana. Iako bi nokaut specifičan za mišiće bio poželjniji od Sirt3 KO miševa cijelog tijela korištenih u našoj studiji, naši rezultati sugeriraju da CF poboljšava metabolizam NAD-a, a Sirt3 je uključen u ovo poboljšanje aktivnosti mitohondrijskog transportnog lanca elektrona izazvano suplementacijom. Pozitivni učinci primijećeni na aktivnost mitohondrijskih kompleksa nakon suplementacije CF-om nisu primijećeni korištenjem Sirt3-7miševa, a veća aktivnost aktivnosti kompleksa I i IV primijećena je nakon suplementacije CF-om samo u WT. Ova opažanja proširuju prethodne radove pokazujući da Sirt3 igra ključnu ulogu u mitohondrijskom funkcioniranju ]67. Zajedno, ovi nalazi sugeriraju da su sirtuini, kroz modulaciju metabolizma NAD, uključeni u poboljšanje mitohondrijske mase uočeno nakon suplementacije CF. 4.4.Ograničenja
Zrna kakaovca sastoje se od mješavine monomernih, oligomernih i polimernih flavanola. Među flavanolima, čini se da je EPI najzastupljeniji polifenolni monomer pronađen u proizvodima od kakaovca, koji predstavlja do 35 posto sadržaja polifenola [68]. EPI je utvrđen kao glavna bioaktivna molekula u osnovi dobrobiti povezanih s dodacima kakaa i čokolade [47,69]. Međutim, EPI metaboliti (EPIm) mogu biti uključeni u EPI-inducirane biološke učinke promatrane in vivo studijama. EPIm može doseći veće koncentracije u plazmi nego EPI[70]. Štoviše, uočene su velike razlike u EPIm među vrstama. Doista, 80 posto EPIm-a prisutnog u ljudi nije otkriveno u štakora, dok je sličnost između miševa i ljudi bila nešto povoljnija jer su otkrivena dva glavna ljudska metabolita [70]. Koristili smo obogaćeni CF ekstrakt koji sadrži do pet puta više EPI od nefermentiranih zrna kakaovca[71]. Štoviše, sadržaj EPI smanjen je za 10-20 posto fermentacijom i smanjen na način ovisan o temperaturi tijekom prženja [71,72]. Zajedno, ovi podaci upućuju na to da pozornost treba obratiti samo na sadržaj EPI-ja kada se procjenjuju dobrobiti suplementacije EPI-ja na zdravlje ljudi, a trenutne rezultate treba uzeti u obzir s oprezom prije ekstrapolacije uočenih temeljnih mehanizama kod ljudi.
5. Zaključci
Svakodnevna suplementacija CF-om tijekom 15 dana dovodi do poboljšanja mitohondrijske funkcije u oksidativnim i glikolitičkim mišićima. Sadašnji rezultati sugeriraju da povećano mitohondrijsko disanje rezultira povećanjem mitohondrijske mase dok je stanična razina proizvodnje ROS-a održana, što ukazuje na kvalitativne prilagodbe unutar mitohondrija. Popratno prethodno opisanom staničnom učinku na metabolizam NO [73], CF modulira metabolizam NAD, koji stimulira aktivnost sirtuina. Sirt3 igra središnju ulogu u prilagodbama mitohondrija i metaboličkoj fleksibilnosti nakon CF suplementacije. Kako su sirtuini novije mete u patogenezi raznih bolesti, poput dijabetesa ili astme [74,75l, daljnja istraživanja će istražiti potencijalni interes korištenja CF-a kao prirodnog aktivatora sirtuina.
Reference
1. Kuznjecov, AV; Veksler, V.; Gellerich, FN; Saks, V.; Margreiter, R.; Kunz, WS Analiza mitohondrijske funkcije in situ u permeabiliziranim mišićnim vlaknima, tkivima i stanicama. Nat. Protoc. 2008, 3, 965–976. [CrossRef]
2. Sena, LA; Chandel, NS Fiziološke uloge mitohondrijskih reaktivnih vrsta kisika. Mol. Ćelija 2012, 48, 158–167. [CrossRef]
3. Wacquier, B.; Combettes, L.; Van Nhieu, GT; Dupont, G. Interplay Between intracelular Ca2 plus oscilations and Ca2 plus-stimulated mitochondrial Metabolism. Sci. Rep. 2016, 6, srep19316. [CrossRef]
4. Suomalainen-Wartiovaara, A.; Battersby, BJ Mitohondrijske bolesti: Doprinos odgovora na stres organela patologiji. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2018, 19, 77–92. [CrossRef]
5. Heyman, E.; Daussin, F.; Wieczorek, V.; Caiazzo, R.; Matran, R.; Berthon, P.; Aucouturier, J.; Berthoin, S.; Descatoire, A.; LeClair, E.; et al. Opskrba i korištenje kisika u mišićima kod dijabetesa tipa 1, od okolnog zraka do dišnog lanca mitohondrija: postoji li ograničavajući korak? Skrb za dijabetes 2020, 43, 209–218. [CrossRef]
6. Daussin, FN; Boulanger, E.; Lancel, S. Od mitohondrija do sarkopenije: Uloga upale i implikacija RAGE-ligand osovine. Exp. Gerontol. 2021, 146, 111247. [CrossRef] [PubMed]
7. Katz, DL; Doughty, K.; Ali, A. Kakao i čokolada u ljudskom zdravlju i bolesti. Antioksid. Redox signal. 2011, 15, 2779–2811. [CrossRef] 8. Grassi, D.; Lippi, C.; Necozione, S.; Desideri, G.; Ferri, C. Kratkotrajna primjena tamne čokolade praćena je značajnim povećanjem osjetljivosti na inzulin i smanjenjem krvnog tlaka u zdravih osoba. Am. J. Clin. Nutr. 2005., 81, 611–614. [CrossRef] [PubMed]
9. Grassi, D.; Desideri, G.; Necozione, S.; Lippi, C.; Casale, R.; Properzi, G.; Blumberg, JB; Ferri, C. Krvni tlak je smanjen, a osjetljivost na inzulin povećana kod hipertenzivnih subjekata koji ne podnose glukozu nakon 15 dana konzumiranja tamne čokolade s visokim udjelom polifenola. J. Nutr. 2008., 138, 1671–1676. [CrossRef]
10. Ottaviani, JI; Mama, TY; Heiss, C.; Kwik-Uribe, C.; Schroeter, H.; Keen, CL Stereokemijska konfiguracija flavanola utječe na razinu i metabolizam flavanola kod ljudi i njihovu biološku aktivnost in vivo. Slobodan Radić. Biol. Med. 2011, 50, 237–244. [CrossRef] [PubMed]
