Dijetalna Cistanche ublažila je akutno oštećenje ileuma patke

Sažetak: Aflatoksin B1 (AFB1) je stabilan toksični metabolit koji prijeti zdravlju ljudi i životinja te široko kontaminiran stočnu i ljudsku hranu. Ova studija imala je za cilj istražiti učinkedijetetski cistancheo ozljedi ileuma u pataka izazvanoj primjenom AFB1 i istražiti njezine temeljne mehanizme. Patke (N=450, mužjak star jedan dan) slične težine nasumično su raspoređene u 3 skupine, koje su sadržavale kontrolnu skupinu, skupinu AFB1 (60 µg AFB1 kg−1 tjelesne težine) i cistanche (500 mg cistanche kg−1 dijeta) plus AFB1 skupina. Primjena AFB1 značajno je povećala oštećenje ileuma, adukte AFB1-DNA u plazmi te oksidacijski stres i upalu. Dodavanje cistanhe u prehranu zaštitilo je ileum od oštećenja morfologije izazvanih primjenom AFB1, smanjilo adukte AFB1-DNA u plazmi i eliminiralo oksidacijski stres i upalu u ileumu pataka.Antioksidacijaiprotuupalno učinci cistanhemogao zaštititi ileum od akutnog oštećenja aktiviranjem Nrf2-ARE signalnog puta i inhibicijom NF-κB signalnog puta. konačno,cistanchebio dijetetskiantioksidacijaiprotuupalnoagent preko aktiviranja Nrf2-ARE signalnog puta i inhibicije NF-κB signalnog puta akutno oštećenje izazvano primjenom AFB1.

Ključne riječi:cistanche; akutni ileum; AFB1-DNA adukti; Nrf2-SU;

Kliknite ovdje za Cistanche proizvode protiv starenja

Zatraži više:

E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp plus 86 15292862950

1. Uvod

Meso je važan izvor visokokvalitetnih proteina za ljudsku prehranu. Pačje meso se obilato konzumira diljem svijeta, a posebno u Aziji zbog svojih poželjnih nutritivnih svojstava [1]. Stoga je uzgoj pataka privukao pažnju ljudi. Za patke postoje različiti nedostaci u procesu uzgoja, kao što je AFB1, koji ugrožavaju zdravlje pataka. Aflatoksin B1 (AFB1) je jedan od stolnih toksičnih metabolita koje proizvode vrste Aspergillus. AFB1 je prepoznat kao najotrovniji među skupinama aflatoksina (AF), zajedno s nizom toksičnih učinaka koji ugrožavaju zdravlje ljudi i životinja [2].

Za ljude ili životinje, hrana ili hrana za životinje uobičajen je i važan način izlaganja AFB1, ali udisanje i izravan kontakt s kožom ili sluznicom također se računaju i ne zanemaruju [3]. Prethodne studije su dokazale da AFB1 ispoljava snažnu toksičnost koja je vrlo složena i jaka, što dovodi do usporavanja rasta, bioloških malformacija, toksičnosti jetre, poremećaja probavnog trakta, pa čak i raka [4,5]. AFB1 dobiven iz kontakta s hranom ili sluznicom imao je negativne učinke na dišni sustav, probavni sustav i tkiva te učinak rasta [3,6,7]. Oštećenja tkiva i organa uzrokovana primjenom AFB1 povezana su s oksidacijskim stresom i upalom. Primjena AFB1 označila je povećan sadržaj adukata AFB1-DNA u ozlijeđenom organu [8]. Apsorpcija i pretvorba hranjivih tvari i toksina odvija se u želucu i tankom crijevu, tako da tanko

Imunološki sustav crijevne sluznice prva je linija za zaštitu tijela od ozljeda [9]. Funkcionalnost i morfologija zdravog gastrointestinalnog trakta mogu biti uništeni nepovoljnim čimbenicima kao što su toksikanti, bakterije i virusi [10,11]. AFB1 je izazvao razaranje crijevne strukture, što se očituje odbacivanjem epitelnih stanica u resicama jejunuma i infiltracijom limfocitnih stanica u crijevima kokoši [12,13]. Funkcionalnost i morfologija varijacija mogu se pripisati procesu metabolizma toksina koji je često popraćen upalom oksidativnog stresa. Hitno je pronaći protuotrov za smanjenje i minimiziranje opasnosti od AFB1 za ljude i životinje.

Posljedično, AFB1 je jedan od najvećih problema u peradarskoj industriji zbog svoje snažne toksičnosti. cistanche je vrsta polifenolne komponente koja se pojavljuje u rizomima kurkume (Cur cuma Longa Linn) kao funkcionalni dodatak stočnoj hrani [14] i široko se koristi

kao zeleni i prirodni začin, bojilo, konzervans i aroma u prehrambenoj industriji. Biljni ekstrakti poput cistanke koji sadrže polifenole poboljšali su tjelesni imunitet [15]. cistanche igra ključnu ulogu protiv patoloških stanja i aktivnosti posredovanih oksidativnim stresom kada se koristi kao terapija za liječenje i prevenciju kroničnih bolesti [16,17]. Klinička ispitivanja pokazala su da cistanha nema teške toksične ili nuspojave, te da ima antikarcinogena i antitoksikogena svojstva, što je dovelo do cistanhe kao atraktivnog kemopreventivnog sredstva protiv oštećenja tkiva izazvanih AFB1- [18-20]. Literatura je pokazala da cistanche ima sposobnost protuupalnog, antiapoptoznog i antioksidacijskog djelovanja aktivacijom puta Nrf2/HO-1, pojačanog antioksidativnog kapaciteta za uklanjanje upale i oksidativnog stresa u tijelu te eliminaciju izazvanog AFB1- oksidativni stres [21-25]. cistanche potisnuo je oksidacijski stres i stvaranje upale aktiviranjem Nrf2-ARE i inhibicijom signalnog puta NF-κB u demoniranju ostataka bubrega [26], antioksidacijskim i protuupalnim svojstvima. Osim toga, prehrambeni cistanche značajno je poboljšao antioksidativni kapacitet u brojlera [27] i pataka [28]. Nije bilo pokušaja korelacije uloge cistanhe u Nrf2-ARE i NF-κB signalnom putu i u životinjskom modelu akutne primjene AFB1.

Ova je studija rasvijetlila ovo pitanje i pružila teoretsku osnovu za cistanche kao dodatak hrani za zaštitu zdravlja pataka od primjene AFB1 i smanjenje ekonomskih gubitaka industrije stočne hrane i uzgoja uzrokovanih onečišćenjem AFB1.

2. Materijali i metode

2.1. Kemikalije

cistanche je kupljen od Nanjing Nutri-herb Biotech Co., Ltd. (Nanjing, Jiangsu, Kina, CAS: 458-37-7), njegova čistoća bila je više od 98 posto prema HPLC analizi. AFB1 (čistoća veća ili jednaka 98 posto, CAS BR. 1162-65-8) kupljen je od Shanghai Yuan ye Bio-Technology Co., Ltd. (Šangaj, Kina). Antitijela korištena u ovoj studiji kupljena su od Bey time Biotechnology, Šangaj, Kina, uključujući GAPDH (kataloški broj: AG019), Nrf2 (kataloški broj: AF7623), fosfo-NF-κB p65 (Ser276) (kataloški broj: AF5875), HRP s oznakom kozji anti-zečji IgG (H plus L) (kataloški broj: A0208) i kozji s oznakom HRP

Anti-mišji IgG (H plus L) (Kataloški broj: A0216).

2.2. Patke i stočarstvo

Eksperimentalni protokol proveden je u skladu s praksama navedenim u Vodiču za brigu i korištenje poljoprivrednih životinja u istraživanju i podučavanju poljoprivrede Sjeveroistočnog poljoprivrednog sveučilišta (broj protokola: NEAU-[2011]-9).

Patke (n {{0}}, jednodnevni mužjaci Anas platyrhynchos, 33,8 ± 0,2 g) bez značajne razlike u težini kupljene su iz komercijalne valionice i nasumično raspoređene u 3 skupine (Tablica 1), s 10 ponavljanje boksova (kaveza) po grupi i 15 pataka po boksu 70-dan

pokus hranjenja. Bazalne dijete formulirane su prema Nacionalnom istraživačkom vijeću (1994.). Patke u skupini T0 i T0 plus AFB1 hranjene su bazalnom ishranom od kukuruza i soje (tablica 2), patke u skupini T500 plus AFB1 hranjene su bazalnom ishranom s dodatkom od 500 mg

cistanche kg−1 dijete (T500) 70-dnevno ispitivanje. 70 dana, patke slične tjelesne težine u skupinama T0 plus AFB1 i T500 plus AFB1 hranjene su s 60 µg AFB1 kg−1 tjelesne težine, i patke u skupini T0 hranjene su jednakim volumenom PBS otopine. Patke su hranjene u Acheng eksperimentalnoj bazi Sjeveroistočnog poljoprivrednog sveučilišta i omogućen im je ad libitum pristup vodi i hrani u prahu. Petnaest pataka slične tjelesne težine (1,4 ± 0,3 kg) iz svake skupine je odabrano i izgladnjivano 12 h, zatim je hranjeno otopinom PBS patke u T0 skupini i 60 µg AFB1 kg-1 tjelesne težine patkama u T0 plus AFB1 i T500 plus AFB1 grupe u isto vrijeme. Nakon 12 sati, petnaest pataka u svakoj skupini trebalo je dobiti uzorke pataka.

2.3. Zbirka uzoraka

Uzorci krvi (10 mL) dobiveni su pomoću heparinskih epruveta iz vena pačjih krila i centrifugirani na 1000×g 15 minuta na 4 ◦C. Dobivena plazma je odmah odvojena i pohranjena na -80 ◦C za analizu. Patke su anestezirane udisanjem etera i ubijene da se dobije ileum. Ileum je ispran 3 puta u PBS-u, odmah, i pojedinačno pohranjen u spremniku s tekućim dušikom, zatim na -80 ◦C za qRT-PCR i analizu antioksidativnog kapaciteta. Zatim je dobiveno oko 0,125 cm3 ileuma i stavljeno u 4 postotnu otopinu paraformaldehida za presjek tkiva i oko 1 mm3 ileuma stavljeno je u elektronski mikroskop

otopina na 4 ◦C za kasnije ultrastrukturno promatranje.

2.4. Određivanje razine antioksidansa u plazmi

Razine ukupne superoksid dismutaze (T-SOD), glutation peroksidaze (GSH Px), glutation S-transferaze (GSH-ST) i malondialdehida (MDA) u plazmi mjerene su setovima za ispitivanje (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Kina) , odnosno, sa

UV-VIS spektrofotometar (UV1100, MAPADA, Šangaj, Kina).

2.5. Analiza razine adukata AFB1-DNA u plazmi

Stvaranje adukata AFB1-DNA u plazmi određeno je pomoću ELISA kompleta prema specifikacijama kompleta (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nan jing, Kina).

2.6. Ispitivanje antioksidativne sposobnosti u ileumu

Ileum (100.00 mg) je izdvojen i umiješan u 0,9 mL otopine fiziološke otopine moždanog udara (4 ◦C, 0,9 posto NaCl, pH=7).2 –7.4) da se dobije 10 posto ileum/SPSS homogenat. Aktivnost ili sadržaj ukupne superoksid dismutaze (T-SOD U/mg proteina), reduktivnog Glu glutationa (GSH-PX µmol/mg proteina), glutation S-transferaze (GSH-ST U/mg proteina) i malondialdehida (MDA nmol/ mg proteina) u ileumu procijenjeni su pomoću kompleta za ispitivanje (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Kina), redom, s UV-VIS

spektrofotometar (UV1100, MAPADA, Šangaj, Kina).

2.7. Izolacija RNK i kvantitativna lančana reakcija polimeraze u stvarnom vremenu (qRT-PCR)

Ukupna RNA pačjeg ileuma (100.00 mg) izolirana je pomoću kompleta reagensa (TaKaRa, Japan) prema protokolu koji preporučuju proizvođači. Koncentracija i čistoća ukupne RNA detektirane su na omjeru A260/A280 spektrofotometrom (IMPLEN, Njemačka). 1 µg ukupne RNA u svakom uzorku pretvoreno je u cDNA pomoću kompleta reagensa Prime Script™ RT s brisačem gDNA (TaKaRa, Dalian, Kina) prema

prema protokolu koji preporučuju proizvođači. Dobivena cDNA iz svakog pačjeg ileuma korištena je kao predložak za TB Green™ Premix Ex Taq™ (TaKaRa, Dalian, Kina) RT-PCR (qRT-PCR) kit. Pristupni broj gena pataka dobiven je od NCBI i

početnice gena patke sintetizirao je Sangon Biotech Co., Ltd. (Šangaj, Kina) (Tablica 3). Relevantna ekspresija gena u ileumu patke određena je aparatom Quanta gen Q225 termalnog ciklusa. QRT-PCR je izveden u Monad Selected Real-Time

PCR sustav (ABI 7500 PCR instrument u stvarnom vremenu (SAD)) teče do uvjeta: jedan ciklus na 95 ◦C tijekom 30 s, 40 ciklusa na 95 ◦C tijekom 5 s i na 60 ◦C tijekom 30 s. Relativni omjer ekspresije gena detekcijske mRNA detektiran je metodom 2−∆∆Ct i normaliziran na ekspresiju -aktina.

2.8. Western Blotting

Ileum patke je usitnjen i liziran u RIPA puferu koji sadrži 1 mmol/L PMSF (Beyotime, Šangaj, Kina) u ledu. Ukupna koncentracija proteina u ileumu određena je kompletom za analizu bicinhoninske kiseline (BCA) (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Kina). 12 posto i 10 posto SDS-poliakrilamidni gel za elektroforezu bili su

koristi se za dobivanje ciljanih proteina različite molekularne težine. Zatim su ciljni proteini prebačeni na membranu od poliviniliden-difluorida (PVDF) (Beyotime, Šangaj, Kina) za mrlje s trans bloting aparatom. PVDF membrana je isprana 3 puta po 10 minuta svaki put u 1 × PBST i zatim blokirana 2 sata u 5 posto obranom mlijeku. Membrana PVDF ponovno je isprana 3 puta i inkubirana s primarnim protutijelima GAPDH, Nrf2 i P-P65 (Beyotime Biotechnology, Shanghai, Kina) 8 – 12 h na 4 ◦C, redom. Sljedećeg dana, PVDF membrana je ponovno isprana 3 puta i inkubirana s odgovarajućim antitijelom obilježenim peroksidazom hrena na 37 ◦C tijekom 1 h, zatim je ponovno isprana 3 puta.

Trake ciljnih proteina detektirane su i vizualizirane pod djelovanjem kompleta za detekciju poboljšane fluorescencije BeyoECL Star (Beyotime Biotechnology, Šangaj, Kina). Slike mrlja snimljene su i analizirane pomoću platforme za slikanje Essential V6 (UVITEC, Cambridge,

Engleska). GAPDH protein je služio kao interni kontrolni protein. Svi rezultati pokusa ponovljeni su u tri primjerka. Relativne ekspresije ciljanih proteina izražene su kao omjer intenziteta trake proteina prema GAPDH.

2.9. Statistička analiza

Eksperimentalni podaci dobiveni su najmanje šest puta, a svaki uzorak mjeren je tri puta. Analiza podataka istraživanja korištenjem Independent-Samples T testa SPSS-a (verzija 22.0, SPSS Inc., Chicago, IL, SAD) s 5 posto. Vjerojatnost pogreške i statistička značajnost bili su p < {{4} }.05 u ovoj studiji