Određivanje uloge prehrane u starenju kože

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

Sažetak:Učinak prehrane na starenje kože postao je zanimljiva tema istraživanja. Prethodne studije uglavnom su bile usredotočene na korisne učinke kolagenskih peptida dobivenih iz morskih organizama na kožu koja stari kada se daju oralno, dok su korisni učinci kolagenskih peptida dobivenih iz peradi na kožu koja stari rijetko zabilježeni. U ovoj studiji kolagenski peptidi pripremljeni su iz kokošje kosti enzimatskom hidrolizom, te je ispitan učinak i mehanizam djelovanja oralno primijenjenih kolagenskih peptida na ublažavanje starenja kože izazvanog UV zračenjem u kombinaciji s D-galaktozom. Rezultati su pokazali da kolagen pileće kosti ima tipične karakteristike kolagena, a peptidi kolagena pileće kosti (CPs) uglavnom su bili mali molekularni peptidi s molekularnom težinom od<3000 da.="" in="" vivo="" experiments="" showed="" that="" cps="" had="" a="" significant="" relieving="" effect="" on="" aging="" skin,="" indicated="" by="" the="" changes="" in="" the="" compostion="" and="" structure="" of="" the="" aging="" skin,="" improvement="" of="" skin="" antioxidant="" level,="" and="" inhibition="" of="" inflammation;="" the="" relieving="" effect="" was="" positively="" correlated="" with="" the="" dose="" of="" cps.="" further="" investigation="" showed="" that="" cps="" first="" reduce="" the="" level="" of="" skin="" oxidation,inhibit="" the="" expression="" of="" the="" key="" transcription="" factor="" ap-1(c-jun="" and="" c-fos),="" then="" activate="" the="" tgf-β/smad="" signaling="" pathway="" to="" promote="" collagen="" synthesis,="" inhibit="" the="" expression="" of="" mmp-1/3="" to="" inhibit="" collagen="" degradation,and="" inhibit="" skin="" inflammation="" to="" alleviate="" skin="" aging="" in="" mice.="" moreover,="" the="" skin="" transcriptome="" found="" that="" lysosomes="" activated="" after="" oral="" administration="" of="" cps="" may="" be="" an="" important="" pathway="" for="" cps="" in="" anti-skin="" aging,="" and="" is="" worthy="" of="" further="" research.="" these="" results="" suggested="" that="" cps="" might="" be="" used="" as="" a="" functional="" anti-aging="" nutritional="">

Kliknite ovdje da saznate više

Ključne riječi:peptidi kolagena; protiv starenja; kožni transkriptom;sinteza kolagena;lizosomi

1. Uvod

Zdravstvena era, točno pridržavanje zdrave prehrane, određivanje uloge prehrane u starenju kože i odlučivanje što jesti za održavanje mladenačke i zdrave kože teški su problemi. Koža je najveći organ u tijelu, sastoji se od epidermisa, dermisa i potkožja. Djeluje kao barijera za zaštitu tijela od vanjskih čimbenika, a također igra ulogu u zdravlju i ljepoti[1]. Starenje kože složen je proces koji se dijeli na kronološko starenje i fotostarenje na koji utječu unutarnji i vanjski čimbenici.stabljika cistancheGlavne karakteristike uključuju nakupljanje makromolekularnih oštećenja u stanici, opadanje funkcije matičnih stanica (poticanje obnove tkiva) i postupni gubitak fizičkog integriteta kože [2]. Glavni molekularni mehanizmi koji uzrokuju starenje kože uglavnom uključuju oksidativni stres, skraćivanje telomera, oštećenje DNA, genetsku mutaciju, regulaciju mikro-RNA, uznapredovalo nakupljanje krajnjeg produkta glikacije i starenje upala 3]. Fotostarenje je epidermalna hiperplazija kože, sušenje i degradacija izvanstaničnog matriksa izazvana ultraljubičastim zračenjem. Glavni uzrok foto-starenja su reaktivne kisikove vrste (ROS) koje stvara ultraljubičasto zračenje koje posreduje u ekspresiji matriksnih metaloproteinaza (MMP) i pro-kolagena tipa I kroz signalne putove kao što je signalizacija protein kinaze aktivirane mitogenom (MAPK). putu, što dovodi do degradacije izvanstaničnog matriksa (ECM) u koži i apoptoze fibroblasta [4]. Posljednjih godina održavanje zdravlja kože i odgađanje starenja postalo je popularno, a pronalazak prirodnih sastojaka poput bioaktivnih peptida i polifenola s antioksidativnim funkcijama i funkcijama protiv starenja postalo je žarište istraživanja [5].

Cistanche može spriječiti starenje

Međutim, kolagen ima veliku molekularnu masu i teško se izravno apsorbira i koristi, dok peptidi kolagena male molekule nakon hidrolize kolagena imaju jaču biološku aktivnost i visoku stopu apsorpcije [6]. U međuvremenu, široka primjena kolagena u hrani, medicini, inženjerstvu tkiva, kozmetici i drugim područjima učinila je kolagenske peptide s nižom molekularnom težinom, većom učinkovitošću apsorpcije i jačom biološkom aktivnošću novim favoritom u funkcionalnoj hrani i medicinskim istraživanjima [{{1 }}]. Peptidi kolagena su mali, sadrže 2-20 aminokiselinske ostatke dobivene nakon hidrolize kolagena. Koriste se kao dodatak prehrani za liječenje starenja kože zbog svojih potencijalnih protuupalnih i antioksidativnih funkcija i imunološke regulacije te učinaka antioksidacije i proliferacije na fibroblaste kože [10].

Nakon oralne primjene kolagenski peptidi se apsorbiraju u obliku malih peptida i brzo transportiraju u krv, a na kraju i do bubrega, kože, zglobova i drugih tkiva gdje se pohranjuju i koriste. Nakon 14 dana, razine radioaktivnosti ostale su visoke u koži miševa kojima je kroz sondu stavljen C14-označen kolagen peptid.cistanche tubulosa koristi i nuspojavePeptide kolagena tijelo može gotovo u potpunosti apsorbirati i iskoristiti, dok je stopa apsorpcije i iskoristivosti kolagena samo 50-60 posto [6,11-13]. Posljednjih godina naširoko se izvješćuje da hidrolizati kolagena iz riblje kože, riblje ljuske, kravlje kosti, kravlje kože i svinjske kože imaju korisne učinke na ublažavanje starenja kože i privukli su značajnu pažnju istraživača. Na primjer, kolagenski peptidi izolirani iz kože tolstolobika potiču sintezu pro-kolagena i inhibiraju ekspresiju proteina AP-1, MMP-1 i MMP-3 aktiviranjem TGF-/Smad puta za sprječavanje degradacije kolagena i popravak fotostarjelih stanica kože [14]. Oralna primjena peptida goveđeg kolagena može poboljšati opuštanje kože, povećati sadržaj kolagena i aktivnost antioksidativnog enzima, popraviti kolagenska vlakna i normalizirati omjer kolagena u koži kod miševa koji stare [15]. Međutim, peptidi kolagena iz različitih izvora imaju različite učinke. Količina i struktura visokoaktivnih peptida u krvi nakon oralne primjene kolagenskih peptida ovisi o izvoru kolagena [10]. Zaštitni učinak kolagenskog peptida ekstrahiranog iz kože kokoši protiv UVA-induciranih ozljeda fibroblasta bio je bolji od onog kolagenskog peptida ekstrahiranog iz svinjske, kravlje ili kože tilapije, a njegov učinak bio je ekvivalentan tripeptidu izvedenom iz kolagena (Gly-Pro -Hyp)[16].

Vjerska uvjerenja i zabrinutost zbog bolesti (kao što je kravlje ludilo) doveli su do toga da ljudi postupno pomaknu smjer razvoja kolagena i njegovih proizvoda s kopnenih sisavaca na perad i morske organizme|17I. Kao glavni nusproizvod prerade peradi, piletina kost je obećavajući izvor kolagenskih proizvoda. Ne samo da smanjuje rasipanje resursa i onečišćenje okoliša, već također omogućuje učinkovito korištenje nusproizvoda. Stoga smo u ovoj studiji koristili kolagenske peptide pileće kosti kao sirovine, s golim miševima tretiranim D-galaktozom i UV zračenjem za induciranje starenja kože, kao model za procjenu učinka oralne primjene kolagenskog peptida na ublažavanje starenja kože u miševa i odrediti relevantni mehanizam.

2. Materijali i metode

2.1.Materijali, kemikalije i životinje

Farme pilića Poljoprivrednog sveučilišta Yunnan (Kunming, Kina) dale su istrošene kokoši, koje su odvojene, osušene i zdrobljene kako bi se dobilo brašno od pilećih kostiju. Kompleti su-peroksid dismutaze (SOD), katalaze (CAT) i glutation peroksidaze (GSH-PX) kupljeni su od Soleibao Biotechnology Co., Ltd. (Peking, Kina). Hidroksiprolin (HYP), interleukin-1 (IL-1x), matrična metaloproteinaza-1/3 (MMP-1/3), pro-kolagen tipa I i hijaluronska kiselina Kompleti (HA)enzimskog imunotestiranja (ELISA) kupljeni su od Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Kina). Zdrave ženke BALB/C miševa bez dlake (18±2g, stare šest tjedana) kupljene su od Nanijing Junke Bioengineering Corporation, Ltd. (Nanjing, Kina) s dozvolom broj: SCXK(SU)2016-0010.ekstrakt cistanche tubulosaPepsin i papain kupljeni su od Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd. (Šangaj, Kina), a ostale kemikalije bile su analitičke kvalitete. Sa svim miševima se postupalo u skladu s propisima za skrb o laboratorijskim životinjama provincije Yunnan i odobrio ih je Odbor za brigu i korištenje životinja Poljoprivrednog sveučilišta Yunnan (ID odobrenja: YAUACUC01).

2.2. Priprava kolagena i sastav aminokiselina

Ekstrakcija i sastav aminokiselina kolagena pileće kosti slijedili su metodu koju su opisali Liuet al. [18] s malim izmjenama. Prašak od pileće kosti je promiješan i natopljen u 0.05 M NaOH, 10 posto n-heksana i 0.25 M otopine EDTA (pH7,5 ) u omjeru 1/10 (m/o). U svakom koraku uzorak je tretiran 36 h, a otopina za namakanje mijenjana je svakih 6 h kako bi koštani prah nabubrio, uklonili nekolagene proteine, mast i minerale iz koštanog praha. Uzorak je nakon svakog koraka ispran čistom vodom do neutralnosti. Prethodno tretirano brašno od pilećih kostiju pomiješano je s 0,5 M ledenom octenom kiselinom koja je sadržavala 0,1 posto (w/v) pepsina u omjeru kruto-tekućina od 1:10 (w/v), te je kontinuirano miješano i ekstrahirano na 4 stupnja tijekom 48 h. Zatim je filtriran, a filtrat centrifugiran na 15,000×g 15 minuta na 4 stupnja. pH supernatanta podešen je na 7.5-7.8 s otopinom NaOH, a NaCl je dodan do konačne koncentracije od 1,5 M. Nakon što je smjesa ostavljena na miru 12 sati na 4 stupnja radi isoljavanja, kolagen precipitat je centrifugiran na 15,000×g 15 minuta na 4 stupnja, zatim otopljen s 0,5 M octene kiseline, dijaliziran u čistoj vodi, osušen smrzavanjem, a gotov proizvod bio je kolagen pileće kosti.

Sastav aminokiselina kolagena pileće kosti određen je automatskim analizatorom aminokiselina Sykam S433D (München, Njemačka). Određena količina uzorka kolagena za testiranje uzeta je u zapečaćenu epruvetu, dodano je 10 mL6 M HCl i hidrolizirano na 110C 24 h. Hidrolizat je koncentriran propuhivanjem dušika i ponovno otopljen u 20 mL pufera limunske kiseline. Nakon mikrofiltracije s mikroporoznom membranom od 0,22 um, uzeto je 20 μL hidrolizata za analizu spektra aminokiselina. Sadržaj aminokiselina u uzorku izražen je u postocima.

2.3. Priprema i distribucija molekularne težine kolagenskih peptida (CP)

Prema rezultatima našeg prethodnog procesa optimizacije, CP-ovi su pripremljeni korištenjem papaina u omjeru enzima i supstrata od 1:40 (omjer mase). Nakon podešavanja pH na 7 i enzimske hidrolize na 63 stupnja tijekom 5 sati, enzim je inaktiviran u kipućoj vodenoj kupelji 15 minuta. Enzimski hidrolizat je odsoljen i liofiliziran, ponovno otopljen u 0,1 postotnoj otopini mravlje kiseline i centrifugiran da se dobije supernatant. AQ Exactive HF Orbitrap Maseni spektrometar visoke rezolucije-QE-HF (Thermo Fisher, Waltham, MA, SAD), opremljen elektrosprej ionizacijom (ESI), korišten je za analizu hidrolizata kolagena u načinu punog skeniranja od 350-1800 m /z, a rezultati su dohvaćeni i analizirani pomoću softvera Proteome Discoverer 2.1.

2.4. Test na životinjama

Ženke BALB/C miševa bez dlake (n{{0}}) držane su u prostoriji pod kontroliranim uvjetima temperature (24±1 stupanj), vlažnosti (60 ±5 posto) i 12 h ciklusa dan-noć tijekom jednog tjedna. Omogućen im je ad libitum pristup hrani i vodi. Nakon tjedan dana prilagodbe, miševi su nasumično podijeljeni u sljedećih pet skupina (n=11 po skupini): (i). Normalna skupina (N): UV neizloženo; oralna primjena 0.4 mL fiziološke otopine dnevno. (ii). Grupa modela (M): izložena UV zračenju plus D-galaktoza (0,2 mL); oralna primjena 0,4 mL fiziološke otopine dnevno.

(i). Grupa kolagenskih peptida s niskom dozom (LCP): izložena UV zračenju plus D-galaktoza (0.2 mL); oralni

primjena 0.4 mL CPs (doza: 200mg:kg-1 tjelesne težine) dnevno.

(iv). Grupa kolagenskih peptida srednje doze (MCP): izložena UV zračenju plus D-galaktoza; oralno

primjena 0.4 mL CP (doza: 500 mg·kg-1 tjelesne težine) dnevno.

(v). Grupa kolagenskih peptida visoke doze (HCP): izložena UV zračenju plus D-galaktoza; oralna primjena

doza od 0.4 mL CPs (doza: 1000 mg kg-1 tjelesne težine) dnevno.

Liječenje D-galaktozom provedeno je supkutanom injekcijom 0.2 mL 10 postotne otopine D-galaktoze na stražnji dio vrata miša (doza: 1.0g/ kg-1tjelesne težine) dnevno. UV zračenje je izvedeno s 40 W UVA-340 LAMIP (O-panel, Cleveland, SAD, vršna valna duljina: 340 nm), udaljenost između lampe i leđa miša bila je 30 cm (230 m J/cm -), a zračenje je trajalo 30 min svaki dan tijekom sedam tjedana (49 dana). Intenzitet zračenja mjeren je UVA{17}}radiometrom (Xinbao Keyi Electronic Technology Co., Ltd., Xi'an, Kina). Jedan sat nakon D-galaktoze i UV tretmana, miševima je davano 0,4 mL CPs oralno svaki dan. Nakon posljednjeg zračenja, miševi su anestezirani, izvagani, a tkiva su uzorkovana za naknadnu analizu.

2.5. Vlažnost kože, visceralni indeks i dobitak tjelesne težine

Vlažnost kože određena je ISO 1442, a visceralni indeks izračunat je pomoću sljedeće jednadžbe: visceralni indeks (g/kg)= visceralna težina/tjelesna težina.

2.6. Oksidacijski stres, sadržaj HA i HYP u koži

Uzorci kože homogenizirani su s deveterostrukom količinom normalne slane otopine (w/w) u ledenoj kupelji s homogenizatorom tkiva (TGrinder OSE-Y30, Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Peking, Kina), a zatim centrifugirani na 2000 ×g i 4 stupnja za 10 min. Aktivnosti superoksid dismutaze (SOD), katalaze (CAT) i glutation peroksidaze (GSH-PX), te sadržaj hijaluronske kiseline (HA) i hidroksiprolina (HYP) u sakupljenom supernatantu određeni su prema metodi opisanoj u upute koje odgovaraju odgovarajućim kompletima.

2.7.Histološki pregled kože

Uzorci mišje kože fiksirani su u 4 postotnoj otopini paraformaldehida 24 sata, dehidrirani, uklopljeni u parafin i narezani. Presjeci kože obojeni su hematoksilinom i eozinom (HE) i promatrani prednjim fluorescentnim mikroskopom ECLIPSE CI-E (Nikon, Japan). Debljina epidermisa i dermisa kože procijenjena je pomoću softvera Halcon 13.0.1.1 (MVTec, München, Njemačka).

2.8. Sekvenciranje transkriptoma kože

2.8.1. Ekstrakcija RNA, konstrukcija knjižnice i sekvenciranje transkriptoma

Ukupna RNA ekstrahirana je iz kože miševa korištenjem RNeasy Mini Kit (Tiangen Bio-chemical Technology Co., Ltd., Peking, Kina) prema uputama proizvođača. Čistoća i koncentracija RNA provjerene su pomoću kaiaoK5500Spectrophotometra (Kaiao, Peking, Kina); Integritet RNA procijenjen je korištenjem RNA Nano 6000 Assay Kit i sustava Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, SAD). Analizu transkripcijskog sekvenciranja svakog uzorka provela je Biolinker Technology Company Limited (Kunming, Kina). Ukratko, klasteriranje indeksno kodiranih uzoraka izvedeno je na cBot sustavu za generiranje klastera pomoću HiSeq PE Cluster Kit v4-cBot-HS(llu-mina) prema uputama proizvođača. Nakon generiranja klastera, biblioteke su sekvencionirane na platformi Ilumina, te su generirana očitavanja uparenog kraja od 150 bp.

2.8.2. Bioinformatičke analize podataka RNA-sekvenciranja

Gene Ontology (GO) i Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) obogaćena analiza različito eksprimiranih gena (DEG) provedena je korištenjem R jezičnog paketa analizatora klastera. Kada je p-vrijednost bila manja od 0.05, stavke i putovi obogaćeni GO i KEGG smatrani su značajnima.

2.8.3. Lančana reakcija reverzne transkriptaze-polimeraze (qRT-PCR)

QRT-PCR je izveden kao što je prethodno opisano [19].

2.9. Wester Blot

Prema metodi koju su opisali Park i sur. [20], Western blot (WB) analiza je provedena kako bi se kvantificirala ekspresija proteina povezanih sa starenjem kože u miševa. Koncentracija proteina kožnog lizata u svakoj tretiranoj skupini kvantificirana je korištenjem BCA kompleta, odvojena pomoću SDS-PAGE (10 posto akrilamidnog gela), prenesena na PVDF membranu, blokirana s 5 posto obranog mlijeka i inkubirana s odgovarajućom količinom primarne antitijela (TGF-b1, c-Fos, c-Jun, Samd2/3 i -aktin) na 4 stupnja preko noći. Nakon ispiranja s TBST, uzorci su pomiješani sa sekundarnim protutijelima i inkubirani na sobnoj temperaturi 1 h.cistanche tubulosa recenzijeChemiDoc XRS plus kemiluminiscencijski gel imager (BioRAD, Hercules, CA, SAD) korišten je za otkrivanje specifičnih proteina. Image] softver je korišten za kvantificiranje ekspresije ciljanog proteina u svakoj tretiranoj skupini, a rezultati su predstavljeni vrijednostima gustoće normaliziranim na protein -aktin.

2.10.ELISA

Razine ekspresije MMP-1, MMP-3, pro-kolagena tipa I i IL-1& u tekućini za lizu kože određene su enzimskim imunološkim testom. Ispitivanje je provedeno prema uputama priloženim uz kit.

2.11. Statističke analize

Svi rezultati analizirani su pomoću softvera SPSS 21 (IBM Inc., Armonk, NY, SAD) putem jednosmjerne analize varijance (ANOVA) i Duncanovog višestrukog raspona testa, s razinom značajnosti postavljenom na p<0.05. originpro="" 2017(originlab,="" northampton,="" ma,="" usa)was="" used="" to="" plot="" the="" data.="" all="" data="" were="" expressed="" as="" the="" mean="" ±="" standard="" deviation="">

3. Rezultati i rasprava

3.1.Aminokiselinski sastav kolagena

Sastav aminokiselina kolagena pileće kosti prikazan je u tablici 1. Gly je bila glavna aminokiselina u uzorcima, koja je činila gotovo jednu trećinu (27.86 posto) ukupnih aminokiselina, a Hyp je bila posebna aminokiselina u kolagenu, koja čini 9,83 posto. Glavne karakteristike molekula kolagena bile su ponovljene sekvence Gly-XY i jedinstvena trostruka spiralna struktura sastavljena od tri lanca. Gly je činio oko jednu trećinu ukupnih aminokiselina, X i Y su često bili prolin i hidroksiprolin, ili su mogli biti bilo koji ostatak [21]. Sastav aminokiselina u uzorku bio je sličan onom kolagena od pileće kosti objavljenog u prethodnim studijama i imao je tipične karakteristike kolagena [22].

3.2. Distribucija molekularne mase CP

Molecular weight distribution reflects the degree of collagen hydrolysis. The molecular weight of the CPs was mainly below 3000 Da (Figure 1), accounting for about 87.61%of all collagen hydrolysates, indicating that almost all of the CPs were small peptides. Many studies claim that collagen peptides with a lower molecular weight have better biological activity [23]. For example, Song et al. [24]. reported that lower molecular weight (200-1000 Da, 65%)silver carp skin collagen peptides repaired UV-induced aging skin in mice more effectively than similar peptides with a higher molecular weight(>1000 Da, 72 posto). Međutim, njemačka tvrtka Gelita pokazala je kroz nekoliko kliničkih studija da je učinak kolagenskih peptida uglavnom određen njegovim stupnjem podudaranja sa svojstvima kolagenskih peptida nakon razgradnje ljudskog kolagena, a ne molekularnom težinom kolagenskih peptida. Utvrdili su da proizvod VERISOL③ prosječne molekulske mase 2000 Da ima najstimulativniji učinak na fibroblaste kože, dok proizvod FortigelTM prosječne molekularne mase 3000 Da posebno djeluje na obnavljanje hrskavice [25-27].

3.3. Učinak oralnih CP-a na ublažavanje starenja kože

3.3.1.Tjelesna težina i indeks organa

Indeks tjelesne težine i indeks organa važni su i odražavaju zdravstveno stanje miševa. Težina miševa u svakoj skupini normalno se povećavala tijekom razdoblja ispitivanja (Tablica 2). Prosječno povećanje tjelesne težine M skupine bilo je niže od onog u N skupini, a ono u skupinama koje su primale CP bilo je veće od onog u M skupini, što sugerira da CP nisu imali nuspojave na miševe. U prethodnim izvješćima, doza miševa tretiranih kolagenskim peptidom bila je uglavnom između 100-1000 mg/kg.tw·d, a sigurna doza kolagenskih peptida tilapije dosegla je 4,07 g/kg.tw·d [{{6} }]. Slično tome, rast miševa starije kože nakon gavaže s kolagenskim peptidima tilapije (doze: 500 i 1000 mg/kg·tw·d) također je bio sličan našim rezultatima [29]. Slezena igra važnu ulogu u humoralnom i staničnom imunitetu, stoga se indeks slezene često koristi za procjenu funkcije imunološkog sustava.cistanche UKThe liver index was used to evaluate the toxicity of the tested sample. In these tests, the liver and spleen indices in the M group were lower than those in the N group, and both recovered after treatment with CPs, but there was no significant difference across the treatment groups (p >0.05). Rezultati su bili slični onima iz prethodnih studija [30], što ukazuje da su CP-ovi sigurni i da bi mogli malo poboljšati imunitet miševa.

3.3.2. Sastav kože

Tretman UV i D-galaktozom (M skupina) značajno je smanjio sadržaj vlage, HA i Hyp u koži, u usporedbi s onima iz N skupine, za 13,36 posto, 24,08 posto, odnosno 15,83 posto (p<0.05)(table 2).="" the="" contents="" of="" moisture,="" ha,="" and="" hyp="" in="" the="" skin="" were="" significantly="" higher="" in="" mice="" after="" the="" oral="" administration="" of="" cps="" compared="" to="" the="" contents="" of="" those="" in="" the="" mice="" of="" the="" m="" group=""><0.05). among="" the="" dose="" groups,="" the="" contents="" of="" the="" three="" skin="" components="" were="" significantly="" different="" between="" the="" lcp="" and="" hcp="" groups="" and="" were="" dependent="" on="" the="" dose="" of="" intake="" of="" cps.="" the="" hcp="" group="" had="" even="" higher="" contents="" than="" the="" n="" group,="" and="" ha="" and="" hyp="" were="" significantly="" different="" between="" the="" two="" groups="" (p=""><>

Promjene u sadržaju vlage u koži uzrokuju bore i opuštenu kožu, a na njih utječu komponente matriksa kao što su kolagen kože i HA[31]. Hidroksiprolin je stabilna, bogata i posebna aminokiselina u kolagenu, a njen sadržaj može neizravno odražavati sadržaj kolagena u koži, kao i starenje kože. Dodatno, HA, koja je visoko izražena u ECM kože, igra važnu ulogu u kontroli ravnoteže vode u koži, osmotskog tlaka, zadržavanja vlage i elastičnosti kao sustava za pohranu vode i strukturne komponente kože [32]. U ovoj studiji sadržaj vlage, HYP i HA u koži značajno se povećao nakon uzimanja CP, što bi moglo biti povezano s poticanjem sinteze kolagena i HA putem CP. Štoviše, povećanje HYP i HA povećalo je sadržaj vlage.

3.3.3. Histološke promjene na koži

Histološke promjene leđne kože miševa nakon sedam tjedana kontinuiranog tretmana prikazane su na slici 2. Stareća koža M skupine pokazala je karakteristike grube površine, zadebljale epiderme, istanjenog dermisa i rijetkih stanica, u usporedbi s kožom miševa. grupa N. Međutim, stanje starenja kože kod miševa poboljšalo se nakon oralne primjene CP-a, održavajući glatku, urednu i cjelovitu strukturu sličnu onoj u miševa N skupine. Tako je dermis kože bio značajno tanji, a epidermis značajno deblji u M skupini nego u N skupini (p<0.05). the="" change="" in="" skin="" dermis="" and="" epidermal="" thickness="" was="" significantly="" better="" after="" treatment="" with=""><0.05), and="" the="" effect="" was="" more="" obvious="" with="" the="" increase="" in="" the="" dose="" of="" cps="" (figure="" 2).the="" effect="" of="" oral="" cps="" on="" the="" histological="" structure="" of="" aging="" skin="" was="" similar="" to="" that="" reported="" previously="" [4,28,31].="" the="" increase="" in="" the="" thickness="" of="" the="" epidermis="" might="" be="" an="" adaptive="" change="" to="" protect="" the="" skin="" from="" external="" stimuli,loss="" of="" skin="" moisture,="" and="" uv="" damage,="" possibly="" due="" to="" the="" increase="" in="" uv-activated="" epidermal="" growth="" factor="" receptor="" (egfr)="" that="" induces="" keratinocyte="" proliferation="" and="" epidermal="" hyperplasia[4].="" however,="" the="" mechanism="" by="" which="" oral="" cps="" alleviate="" the="" increase="" in="" epidermal="" thickness="" remains="" unclear.="" the="" dermis="" imparts="" elasticity="" and="" strength="" to="" the="" skin,="" and="" the="" degradation="" of="" ecm="" and="" the="" reduction="" in="" the="" ability="" to="" repair="" fibroblasts="" are="" the="" main="" causes="" of="" dermal="" thinning="" in="" aging="" skin.="" dermal="" thickness="" increased="" after="" the="" treatment="" with="" cps,="" which="" might="" be="" due="" to="" the="" removal="" of="" ros="" from="" the="" skin="" and="" inhibition="" of="" the="" increase="" of="" mmps="" by="" cps.="" this,="" in="" turn,="" inhibited="" the="" degradation="" of="" skin="" collagen="" and="" elastin="" (figure="" 3),="" the="" entry="" of="" cps="" in="" the="" skin,="" and="" their="" participation="" in="" the="" synthesis="" of="" collagen="" and="" ha="" [6],="" which="" was="" confirmed="" by="" the="" increase="" in="" the="" content="" of="" hyp="" and="" ha="" in="" the="" skin="" (table="">

3.3.4. Antioksidativne i upalne razine kože

Određivanje aktivnosti antioksidativnih enzima je najčešće korištena metoda za procjenu razine antioksidansa u tijelu [28]. Kao što je prikazano na slici 3, aktivnosti sadržaja CAT, SOD, GSH-Px i MDA u M skupini bile su značajno niže od onih u N skupini (p<0.05). administering="" cps="" effectively="" inhibited="" the="" decrease="" of="" cat,="" sod,="" gsh-pxactivities,and="" the="" mda="" content="" in="" the="" skin="" of="" mice,="" compared="" to="" those="" in="" the="" mice="" skin="" of="" the="" m="" group,="" and="" was="" positively="" correlated="" with="" the="" dose="" of="" cps;="" there="" were="" significant="" differences="" among="" the="" different="" dose="" groups=""><0.05). when="" ros,="" accumulated="" by="" skin="" oxidative="" stress,="" exceed="" the="" antioxidant="" defense="" ability="" of="" the="" body,="" they="" destroy="" the="" ecm,="" which="" is="" the="" key="" cause="" of="" skin="" aging.="" ros="" can="" cause="" the="" oxidation="" of="" lipids="" and="" proteins="" in="" the="" skin,="" resulting="" in="" fibroblast="" degeneration="" and="" changes="" in="" the="" skin.="" ros="" activate="" the="" mapk="" signaling="" pathway="" and="" the="" ap-1="" protein="" to="" upregulate="" the="" expression="" of="" mmps="" and="" promote="" the="" degradation="" of="" matrixcollagen="" [21].="" although="" the="" antioxidant="" enzymes="" and="" antioxidants="" in="" the="" body="" can="" remove="" ros="" to="" protect="" the="" skin="" from="" damage,="" when="" the="" content="" of="" rosexceeds="" the="" defense="" (antioxidant)="" ability="" of="" the="" body="" or="" the="" body's="" defense="" ability="" declines,="" it="" causes="" oxidative="" stress="" and="" skin="">

Uz to, stanični upalni odgovor uzrokovan ROS-om također doprinosi starenju kože. Nakon tretmana UV i D-galaktozom (Mskupina), sadržaj IL-lo u koži miševa značajno se povećao u usporedbi s onom u N skupini (Slika 3D). ), što ukazuje da je koža pokazala značajan upalni odgovor (str<0.05). the="" cps="" significantly="" reduced="" the="" content="" of="" il-1α="" in="" the="" skin="" in="" a="" dose-dependent="" manner,="" compared="" to="" that="" in="" the="" skin="" of="" mice="" in="" the="" m="" group.="" there="" was="" a="" significant="" difference="" between="" hcps="" and="" lcps=""><0.05),indicating that="" cps="" alleviated="" skin="" inflammation.="" the'o,="" produced="" by="" ultraviolet="" irradiation="" stimulated="" the="" expression="" of="" mmp-1="" in="" dermal="" fibroblasts="" through="" the="" secretion="" of="" il-1α="" and="" il-6,="" thereby="" disrupting="" the="" ecm="" [33].="" therefore,="" this="" study="" suggested="" that="" cps="" significantly="" increased="" the="" activity="" of="" skin="" antioxidant="" enzymes="" and="" inhibited="" inflammatory="" responses,="" which="" might="" be="" important="" in="" delaying="" skin="" aging="" in="">

3.4. Mehanizam djelovanja prehrambenih CP u ublažavanju starenja kože

3.4.1. Analiza i validacija RNA-Seq podataka

Analysis techniques, such as PCA, HCA, gene GOenrichment, and KEGG pathway enrichment were used to analyze the transcriptome data. Based on the PCA analysis (Figure 4A) and hierarchical clustering analysis (heat map)of 4303 differential genes with average channel strength greater than 100, the relative expression levels of total DEGs between the two treatment groups are shown to provide an overview of the changes in gene expression(Figure 4B). The M group and the HCP group were significantly separated, and the expression patterns of most DEGs in the M and HCP groups were opposite, indicating that there were significant differences between the mouse skin after HCP treatment and the M group (Figure 4A,B). Pairwise comparisons showed that after feeding HCPs,4303 genes were significantly expressed in the mice skin, including 1790 upregulated genes and 2513 downregulated genes(Foldchange>2,p<0.05)(figure 4c).among="" the="" sixgenes="" associated="" with="" skin="" aging="" quantified="" by="" qrt-pcr,="" five="" genes="" (including="" fos,="" jun,="" cxcll,and="" egr1)were="" downregulated,="" and="" one="" gene="" was="" upregulated="" (figure="" 4d),="" which="" was="" consistent="" with="" the="" overall="" trend="" of="" transcriptomic="" data.="" the="" rna="" expression="" levels="" of="" fos,="" jun,="" and="" cxcll="" were="" significantly="" upregulated="" in="" damaged="" skin="" compared="" to="" that="" in="" intact="" skin="" [34],="" and="" inhibition="" of="" egr1="" expression="" alleviated="" skin="" inflammation="" [35].="" these="" results="" reflected="" the="" reliability="" of="" transcriptome="" sequencing="" data,="" and="" oral="" cps="" effectively="" alleviated="" skin="">

Analiza obogaćivanja GO i analiza obogaćivanja baze podataka KEGG pružile su podršku za daljnje istraživanje bioloških funkcija DEG-a. GO analiza je pokazala da su DEG značajno obogaćeni u biološkim procesima kao što su replikacija DNA, regulacija hemopoeze, regulacija aktivnosti hidrolaze i proizvodnja citokina; u staničnim komponentama, koje su uključivale litičku vakuolu i lizosom, geni koji sadrže kolagen i drugi srodni geni značajno su obogaćeni; u smislu molekularne funkcije, aktivnost receptor-ligand, aktivnost citokina i drugi srodni geni bili su značajno obogaćeni (Slika 5). Analiza obogaćivanja KEGG-om prvih 20 signalnih putova značajno promijenjenih DEG-ima prikazana je na slici 5. Interakcija citokin-receptor, lizosom, interakcija neuroaktivni ligand-receptor, stanični ciklus, sistemski eritematozni lupus i TGF-put (p<05) were="" closely="" related="" to="" aging,="" especially="" cytokine-receptor="" interactions,="" lysosomes,="" and="" tgf-βsignaling.="" an="" important="" feature="" of="" cellular="" senescence="" is="" the="" accumulation="" of="" damaged="" or-ganelles="" and="" protein="" aggregates.="" lysosomes="" play="" an="" important="" role="" in="" degrading="" damaged="" organelles="" and="" protein="" aggregates="" in="" senescent="" cells="" [36].="" cytokine-receptor="" interaction="" is="" the="" main="" pathway="" of="" enrichment="" in="" the="" skin="" after="" being="" affected="" by="" various="" factors="" such="" as="" inflammation="" [37],="" sulfur="" mustard="" exposure="" [38],="" and="" terahertz="" pulse="" [39].="" cytokines,="" as="" small="" molecular="" proteins="" synthesized="" and="" secreted="" by="" various="" tissue="" cells,="" maintain="" skin="" homeostasis="" by="" controlling="" the="" balance="" between="" keratinocyte="" proliferation,="" diferentiation,="" and="" apoptosis="" through="" complex="" interactions="" with="" growth="" factors[40].="" the="" tgf-β="" signaling="" pathway="" is="" also="" important="" for="" regulating="" skin="" aging[14].="" gene="" functional="" enrichment="" anal-ysis="" showed="" that="" tgf-β="" was="" highly="" expressed="" during="" cytokine-receptor="" interaction="" and="" in="" the="" tgf-β="" signaling="" pathway.="" tgf-β="" is="" a="" major="" pro-fibrotic="" cytokine="" that="" regulates="" cell="" differentiation="" and="" proliferation="" while="" inducing="" extracellular="" matrix="" protein="" synthesis="" [41].="" therefore,="" we="" verified="" the="" tgf-β="" signaling="" pathway="" and="" some="">

3.4.2. Provjera mehanizma djelovanja CP-a u ublažavanju starenja kože

Kako bi se potvrdila uloga TGF-signalnog puta i interakcije citokin-receptor u ublažavanju starenja kože oralnim CP-ovima, provedena je WB analiza kako bi se potvrdio TGF- i transkripcijski faktor Smad2/3 u TGF-signalnom putu, kao i ključ transkripcijski faktor AP-1 (c-Fos i c-Jun) koji regulira citokine. Sadržaj MMP-1, MMP-3, pro-kolagena tipa I i IL-1 određen je ELISA testom. Rezultati WB analize pokazali su da je ekspresija TGF-, Smad2 i Smad3 u skupini M bila značajno niža nego u skupini N(p<0.05). the="" expression="" levels="" of="" tgf-β="" and="" smad3="" were="" significantly="" higher="" in="" mice="" after="" the="" oral="" administration="" of="" cps="" compared="" to="" their="" levels="" in="" group="" m="" mice;="" additionally,="" smad2="" also="" increased=""><0.05), except="" for="" in="" the="" lcps="" in="" a="" dose-dependent="" manner(figure="" 6).="" on="" the="" contrary,="" the="" expression="" of="" c-fos="" and="" c-jun="" in="" the="" mgroup="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" n="" group.="" the="" expression="" of="" c-fos="" and="" c-jun="" in="" the="" cp="" group="" was="" significantly="" lower="" than="" that="" in="" the="" m="" group,="" except="" for="" the="" expression="" of="" c-jun="" in="" the="" lcp="" group=""><0.05), and="" the="" change="" was="" dose-dependent.="" these="" results="" indicated="" that="" the="" tgf-β="" signaling="" pathway="" was="" activated="" and="" ap-1="" was="" inhibited="" after="" feeding="">

Protein AP-1 dimerni je kompleks proteina obitelji Jun i Fos i važan je regulator upale kože i ekspresije citokina. Općenito, kompleks sastavljen od c-Jun i c-Fos pokazuje najveću transkripcijsku aktivnost u koži [41,A42]. ROS proizveden u stanicama kože koje stare prvo aktiviraju AP-1 protein, a zatim reguliraju nizvodne citokine (kao što je IL-1), MMP i TGF-signalni put putem transkripcije i translacije, čime se olakšava starenje kože[43]. ,44]. Signalna reakcija TGF-/Smad klasični je put sinteze kolagena, a transkripcijski faktor Smad je u središtu ovog puta prijenosa signala. TGF- pokreće fosforilaciju i aktivaciju nizvodno Smad2 i Smad3 vezanjem na receptor, čime se povećava sinteza COLI [14].

Dodatno, rezultati ELISA testa pokazali su da je sadržaj MP-1, MMP-3 i IL-1a u koži M skupine bio značajno viši nego u N skupini, a sadržaj Typel pro-kolagena bio je znatno niži (str<0.05). however,="" the="" contents="" of="" mmp-1,mmp-3,and="" il-1α(figure="" 3d)in="" the="" skin="" after="" oral="" administration="" of="" cps="" were="" significantly="" lower="" than="" those="" in="" the="" m="" group=""><0.05); type="" i="" pro-collagen="" increased="" significantly,="" and="" all="" the="" changes="" were="" dose-dependent="" with="" cps="" (figure="" 7).="" mps="" are="" involved="" in="" the="" decomposition="" of="" skin="" collagen,="" il-1o="" shows="" the="" level="" of="" inflammation="" of="" the="" skin,="" and="" type="" i="" pro-collagen="" reflects="" the="" synthesis="" of="" skin="" collagen.="" accumulating="" evidence="" suggests="" that="" the="" role="" of="" the="" jun/ap-1="" protein="" pathway="" has="" also="" been="" proposed="" to="" regulate="" skin="" inflammation="" [40].="" the="" elisa="" results="" showed="" that="" the="" combined="" treatment="" of="" uv="" and="" d-galactose="" caused="" skin="" collagen="" degradation,="" decreased="" collagen="" synthesis,="" and="" caused="" skin="" inflammation,="" leading="" to="" skin="" aging.="" however,="" these="" changes="" were="" reversed="" after="" the="" oral="" administration="" of="">

Uz gore navedene putove, u ovoj studiji, geni s pojačanom regulacijom nakon tretmana CP-om značajno su obogaćeni lizosomskim putem, što ukazuje da je tretman CP-om aktivirao lizosome u koži (Slika 5). Prethodne studije pokazuju da aktivirani lizosomi čiste nakupine i pospješuju aktivaciju starijih neuralnih matičnih stanica tijekom starenja [45]. Osim toga, povećanje funkcije lizosoma može smanjiti koncentraciju unutarstaničnih ROS kako bi se spriječilo mirovanje stanica. Slično tome, svako smanjenje funkcije lizosoma može povećati unutarstaničnu koncentraciju ROS-a koja u konačnici potiče staničnu dormantnost [46] Iako to nismo sustavno potvrdili u ovom radu, ovi rezultati i prethodna izvješća upućuju na to da bi aktivacija lizosomske funkcije mogla biti glavni način za CP-ovi za ublažavanje starenja kože, a mi ćemo nastaviti nastojati to provjeriti.

Stoga je ova studija pokazala da prehrambeni CP mogu ublažiti starenje kože izazvano UV i D-galaktozom na način ovisan o dozi. CP-ovi ublažavaju starenje kože snižavanjem razine oksidacije kože, inhibirajući ekspresiju ključnih transkripcijskih faktora AP-1(c-Jun i c-Fos), aktivirajući TGF-/Smad signalni put za promicanje sinteze kolagena, inhibirajući ekspresiju MMP-1 i MMP-3 (koji inhibiraju razgradnju kolagena) i inhibiraju upalu kože kako bi se ublažilo starenje kože (Slika 8). Štoviše, naši nalazi u trenutnoj studiji također sugeriraju da bi aktivirani lizosom mogao biti važan put kojim CP reguliraju starenje kože, što zaslužuje posebnu pozornost.

4. Zaključci

Ukratko, ova je studija potvrdila da dodatak prehrani peptida kolagena pileće kosti može značajno ublažiti starenje kože izazvano ultraljubičastim zračenjem i D-galaktozom kroz više putova, koji uključuju promicanje sinteze pro-kolagena, inhibiranje razgradnje kolagena, poboljšanje razine antioksidansa u koži, i inhibiranje upale; ublažavanje je bilo ovisno o dozi s CP. Detaljno istraživanje pokazalo je da CP prvo smanjuju razinu oksidacije kože, inhibiraju ekspresiju ključnog faktora transkripcije AP-1(c-Jun i c-Fos), a zatim aktiviraju signalni put TGF-/Smad za promicanje sintezu kolagena, inhibiraju ekspresiju MMP-1 i MMP-3 da inhibiraju razgradnju kolagena i inhibiraju upalu kože kako bi ublažili starenje kože kod miševa. Osim toga, aktivacija lizosoma također može biti glavni put za CP za ublažavanje starenja kože, što je vrijedno daljnjeg istraživanja i provjere. Ovi rezultati daju teoretsku osnovu za primjenu kolagenskih peptida za ublažavanje starenja kože i širenje opsega za sveobuhvatnu upotrebu nusproizvoda životinjskog podrijetla u funkcionalnoj hrani.

Ovaj je članak izvađen iz Nutrients 2022, 14, 1622. https://doi.org/10.3390/nu14081622 https://www.mdpi.com/journal/nutrients