Određivanje ehinakozida u vodenom ekstraktu Cistanche Herba pomoću HPLC

Sažetak: CiljHPLC metoda uspostavljena je za određivanje ehinakozida u vodenom ekstraktuCistanche herba.MetodeEhinakozid je određen pomoću HPLC. Odvajanje je izvedeno na Inertsil ODS-uSP C18 kolona s mobilnom fazom koja se sastoji od acetonitrila(A)i 0.4% otopina fosforne kiseline(B), po gradijentuelucija. Valna duljina detekcije postavljena je na 333 nm, a temperatura stupca bila je 30 stupnja. Protok je bio 1,0mL·min-1 a volumen injekcije je bio 10μL. RezultatiLinearni odnos odehinakozidunutar koncentracijeraspon od 44.939 7-539.276 4 ug ·mL- 1 bilo dobro(r = 0.999 8). Oporavici su bili 94,59%-105.31%(RSD =2.93%,n = 9). Sadržaj ehinakozida u vodenim ekstraktima Cistanche herba bio je 15,527,7.347,12,267 mg·g-1. 

ZaključakUtvrđena HPLC metoda s dobrom ponovljivošću je točna, jednostavno, a izvedivo. Prikladan jeza određivanje ehinakozida uvodeni ekstrakt Cistanche herba. 

Ključne riječi:HPLC;vodeni ekstrakt Cistanche herba; ehinakozid; određivanje sadržaja

NOVA BILJNA FORMULACIJA ZAHRANITE BUBREGE YANG

Cistanche deserticolaje tonik tradicionalne kineske medicine koji se obično koristi u kliničkoj praksi i poznat je kao "pustinjski ginseng" [1]. TheCistanche deserticolasnimljeno u izdanju 2015Kineska farmakopejaje osušena mesnata stabljika s ljuskastim listovimaCistanche deserticola YC MailiCistanche tubulosa (Schenk) Wight. Topla je, slatka i slana, vraća se u meridijane bubrega i debelog crijeva. Ima učinke njegovanja yanga bubrega, obnavljanja esencije i krvi, vlaženja crijeva i laksativa [2]. "Shen Nongova Materia Medica" kaže da može "tonizirati sredinu, nahraniti pet unutarnjih organa, ojačati yin i nahraniti esenciju". Cistanche deserticola uglavnom sadrži feniletanoidne glikozide, iridoide i njihove glikozide, lignane i njihove glikozide, polisaharide, esterske spojeve i alkaloide [3].

Feniletanoidni glikozidi su glavni aktivni sastojci Cistanche deserticola, među kojima su ehinaceasid i verbaskozid komponente indeksa za identifikaciju i određivanje sadržaja Cistanche deserticola u Kineskoj farmakopeji. Farmakološke studije [4] pokazuju da Cistanche deserticola ima različite farmakološke učinke poput laksativa, zaštite jetre, protiv osteoporoze, antioksidansa, protiv starenja i umora. Vodeni ekstrakt Cistanche deserticola može promovirati gen koštanog morfogenetskog proteina 2 u osteoblastima štakora, kao i kiselu fosfatazu otpornu na tartarat i kalcij u kostima u serumu ovariektomiranih miševa.

Ekspresija gena Smad1, Smad5, transformirajućeg faktora rasta- itd. u koštanoj srži i koštanoj srži ima antiosteoporotski učinak [5-6].

Echinacea može potaknuti proliferaciju osteoblasta i potaknuti diferencijaciju mezenhimalnih matičnih stanica koštane srži uzgojenih in vitro u osteoblaste [7-9]. Posljednjih godina bilo je mnogo izvještaja o istraživanju o određivanju sadržaja ehinakozida i verbaskozida u etanolnom ekstraktu Cistanche deserticola i pripravcima njegovih spojeva [10-12], ali malo je izvješća o određivanju sadržaja komponenti indeksa u Cistanche deserticola vodeni ekstrakt. U ovoj studiji za određivanje je korištena tekućinska kromatografija visoke učinkovitosti (HPLC).sadržaj echinaceasideuvodeni ekstrakt Cistanche deserticola.

1 Materijal

1.1 Instrumenti

LC-20AT tekućinski kromatograf visoke učinkovitosti, SPD-20A detektor, SIL-20A autouzorkivač, CTO-10ASvp pećnica na stupcu, LC otopinska radna stanica za tekućinsku kromatografiju, Shimadzu Corporation, Japan; MES125P-OCE-DU elektronička analitička vaga, Sartorius, Njemačka; SHZ-D (III) cirkulirajuća vodena višenamjenska vakuumska pumpa, Henan Yuhua Instrument Co., Ltd.; RC2B SO25 rashladni cirkulacijski sustav rotacijskog isparivača, RV 10 D S96 rotacijski isparivač, IKA, Njemačka; DK-S26 električna vodena kupelj konstantne temperature, Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.; Stroj za ultračistu vodu serije UPR, Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd.

1.2 Medicinski materijali i reagensi

Ljekoviti materijali Cistanche deserticola kupljeni su od Guangzhou Lingnan Chinese Medicine Pieces Co., Ltd., serijski brojevi: 1801001, 1806001 i 181001. Identificiran je kao osušena mesnata stabljika s ljuskastim listovima Cistanche deserticola YCMa iz obitelji Orobanchaceae od strane Chief Chinese Farmaceut Tu Xingming iz Treće pridružene bolnice Sveučilišta kineske medicine Guangzhou. Uzorak je pohranjen u sobi za testiranje lijekova Treće pridružene bolnice Sveučilišta kineske medicine Guangzhou; referentna tvar echinacoside, sadržaj je 89,7%, broj serije je: 111670-201706 Kineskog instituta za inspekciju hrane i lijekova; acetonitril je kromatografski čist (Merck, Njemačka); metanol i fosforna kiselina su analitički čisti (Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.); voda je ultra čista.

2 Metode i rezultati

2.1 Priprema vodenog ekstrakta Cistanche deserticola

Uzmite sirovi prah Cistanche deserticola, dodajte 10 puta više od količine destilirane vode, zagrijte i refluksirajte da ekstrahirate dva puta, svaki put po 1 h, filtrirajte, spojite filtrat i koncentrirajte filtrat do 0,100 g·mL -1 sirove droge pomoću rotacijskog isparivača i pohranite na 4 stupnja za kasniju upotrebu.

2.2 Kromatografski uvjeti i prikladnost sustava

Kromatografska kolona: Inertsil ODS SP C18 kolona (150 mm × 4,6 mm, 5 μm); mobilna faza: acetonitril (A)-0.4% otopina fosforne kiseline (B), gradijent eluacije: 0 ~ 5 min, 17%A; 5 ~ 25 min, 20% A; 25 ~ 30 min, 17% A; valna duljina detekcije: 333 nm; temperatura stupca: 30 stupnjeva; brzina protoka: 1,0 mL·min-1; volumen injekcije: 10 μL. Pod ovim kromatografskim uvjetima, razmak između vršnih vrijednosti ehinakozida i susjednih komponenata veći je od 1,5, a teoretski broj ploča na temelju vršne vrijednosti ehinakozida ne smije biti manji od 4,000. Kromatogram je prikazan na slici 1.

Slika 1. HPLC kromatogrami ehinakozida (A) i vodenog ekstrakta Cistanche herba (B)

2.3 Priprema otopine

2.3.1 Referentna otopina

Izvažite odgovarajuću količinu referentnog ehinakozida, točno ga izvažite, stavite u odmjernu tikvicu od 10 mL, dodajte metanol da ga otopite i pripremite referentnu otopinu koja sadrži 898,794 ug ehinakozida po mL i pohranite je na 4 stupnja za kasniju upotrebu.

2.3.2 Otopina ispitivanja

Točno odmjerite 2.0 mL vodenog ekstrakta Cistanche deserticola, isparite do suhog u vodenoj kupelji, dodajte metanol da se otopi, dopunite do volumena u odmjernoj tikvici od 10 mL, dobro protresite, i filtrirati kroz mikroporoznu filtarsku membranu od 0,22 μm kako bi se dobila otopina.

2.4 Istraživanje linearnog odnosa

Točno izmjerite {{0}}.25, 0,50, 1.00, 2.00, 2,50, 3.00 mL referentne otopine pod 2.3.1 i stavite u odmjernu tikvicu od 5 mL, dodajte metanol da nadoknadite volumen, dobro protresite i dobijete referentnu otopinu s koncentracijom gradijenta od 44.939 7, 89.879 4, 179.{ {21}}, 359.517 6, 449.397 0, 539.276 4 ug·mL-1,i filtrirajte kroz 0.22 μm mikroporoznu membranu. Mjerite u skladu s kromatografskim uvjetima pod 2.2. i zabilježite površinu vrha.

Provedite linearnu regresiju s referentnom masenom koncentracijom kao vodoravnom osi (X, ug·mL{{0}}) i površinom vrha kao okomitom osi (Y) i dobijete regresijsku jednadžbu: Y{{1 }}.0X-32 273.0, r=0.999 8. Rezultati su pokazali da ehinakozid ima dobar linearni odnos u rasponu koncentracija od 44.939 7 ~ 539.276 4 ug·mL-1.

2.5 Ispitivanje preciznosti

Uzmite 539.276 4 ug ·mL- 1 referentne otopine, kontinuirano ubrizgavajte i mjerite 6 puta u skladu s kromatografskim uvjetima pod 2.2, te zabilježite površinu vrha. RSD površine vrha ehinakozida bio je 1,81%, što ukazuje da je instrument imao dobru preciznost.

2.6 Ispitivanje stabilnosti

Točno izmjerite 2.0 mL vodenog ekstrakta Cistanche deserticola, isparite do suhog u vodenoj kupelji, otopite u metanolu, razrijedite do 10 mL volumetrijske tikvice, dobro protresite, filtrirajte s 0 .22 μm mikroporoznu filtarsku membranu, ubrizgajte i izmjerite na 0, 2, 4, 8, 12 i 24 sata u skladu s kromatografskim uvjetima pod 2.2, te zabilježite površinu vrha. Rezultati RSD površine vrha ehinakozida bio je 1,16%, što pokazuje da je ispitivana otopina imala dobru stabilnost unutar 24 sata.

2.7 Ispitivanje ponovljivosti

Točno izmjerite 6 obroka od 2.0 mL vodenog ekstrakta Cistanche deserticola, paralelno pripremite 6 obroka ispitne otopine prema metodi u 2.3.2, te ih ubrizgajte i izmjerite u skladu s kromatografskim uvjetima u 2.2, i zabilježite površinu vrha. Rezultati RSD masene koncentracije ehinakozida bio je 1,28%, što ukazuje na dobru ponovljivost metode.

2.8 Ispitivanje iskorištenja uzorka

Točno izmjerite 9 obroka od 1.0 mL vodenog ekstrakta Cistanche deserticola, dodajte 0.8, 1.0 i 1,2 mL referentne otopine (1,552 mg·mL{{11) }}) ispariti do suhog u vodenoj kupelji, otopiti u metanolu i razrijediti u odmjernu tikvicu od 10 mL; dobro promućkati, filtrirati mikroporoznom filtarskom membranom od 0,22 μm kako bi se dobile visoke, srednje i niske koncentracije ispitne otopine, paralelno pripremiti 3 obroka svake koncentracije i mjeriti prema kromatografskim uvjetima pod 2.2, zabilježiti površinu pika i izračunati oporavak uzorka. Rezultati su prikazani u tablici 1.

2.9 Određivanje sadržaja uzorka

Točno izmjerite 2.0 mL vodenog ekstrakta Cistanche deserticola u 3 obroka, isparite do suhog u vodenoj kupelji, otopite u metanolu, razrijedite do 10 mL u odmjernoj tikvici, dobro protresite, filtrirajte s mikroporoznu filtarsku membranu od 0,22 μm i odredite prema kromatografskim uvjetima pod 2.2, zabilježite površinu vrha i izračunajte sadržaj ehinakozida. Rezultati su prikazani u tablici 2.