Detekcija i karakterizacija mineralno-organskih nanočestica u ljudskim bubrezima

Tsui-Yin Wong^1,2,*, Cheng-Yeu Wu^1,2,3,* et al

Ektopična kalcifikacija povezana je s raznim ljudskim bolestima, uključujući aterosklerozu, rak,kroničnibubregbolest, idijabetesmelitus. Iako su mineralne nanočestice otkrivene u kalcificiranim krvnim žilama, priroda i uloga tih čestica u ljudskom tijelu ostaju nejasne. Ovdje po prvi put pokazujemo da ljudskibubregtkiva dobivena iz krajnjeg stadijakroničnibubregbolestili pacijenti s rakom bubrega sadrže okrugle, višeslojne mineralne čestice od 50 do 1500 nm, dok nema čestica uočenih kod zdravih kontrolnih osoba. Mineralne čestice nalaze se uglavnom u izvanstaničnom matriksu koji okružuje zavojite tubule, sabirne kanale i Henleove petlje, kao i unutar citoplazme stanica koje omeđuju tubule, a sastoje se od polikristalnog kalcijevog fosfata sličnog mineralu koji se nalazi u kostima i ektopičnim kalcifikatima. Thebubregmineralne nanočestice sadrže nekoliko serumskih proteina koji inhibiraju ektopičnu kalcifikaciju u tjelesnim tekućinama, uključujući albumin, fetuin-A i apolipoprotein A1. Budući da se minerali-organske nanočestice nalaze ne samo unutar kalcificiranih naslaga, već iu područjima lišenim mikroskopskih kalcifikacija, naša opažanja pokazuju da nanočestice mogu predstavljati prekursore kalcifikacije i bubrežnih kamenaca kod ljudi.

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Ektopična kalcifikacija povezana je s aterosklerozom, rakom,kroničnibubregbolesti dijabetes melitus 1–3. Nedavna istraživanja pokazuju da ateroskleroza ikroničnibubregbolestpacijenti sa znakovima vaskularne kalcifikacije pokazuju povećane rizike obolijevanja i smrtnosti, što sugerira da je ektopična kalcifikacija štetna za ljudsko zdravlje1,3. Neželjena kalcifikacija također se opaža kod osoba koje stare, a većina ljudi starijih od 60 godina pokazuje znakove vaskularne kalcifikacije4. Iz tih razloga, dešifriranje čimbenika koji induciraju ektopičnu kalcifikaciju i razvoj učinkovitog liječenja predstavljaju važne ciljeve.

Ektopična kalcifikacija može se definirati kao neravnoteža između inhibitora i induktora kalcifikacije u tijelu. Inhibitori kalcifikacije uključuju serumske proteine ​​kao što su albumin, fetuin-A, osteopontin i matrični GLA protein kao i male spojeve poput pirofosfata, dok hiperfosfatemija i upala predstavljaju glavne induktore kalcifikacije5-7. Nedavna istraživanja pokazuju da induktori kalcifikacije aktiviraju stanični proces sličan stvaranju kostiju tijekom vaskularne kalcifikacije7,8. Matrične vezikule slične onima koje induciraju mineralizaciju u kostima u razvoju također su otkrivene u kalcificiranim mekim tkivima7-9. Te matrične vezikule vjerojatno oslobađaju vaskularne glatke mišićne stanice koje se diferenciraju u stanice slične osteoblastima, koje induciraju kalcifikaciju7.

Mineralne nanočestice (NP) otkrivene su u mekim tkivima koja pokazuju znakove ektopične kalcifikacije. Price i sur. otkrili su da serum štakora liječenih ili bisfosfonat etidronatom ili vitaminom D sadrži mineralno-proteinske komplekse koji sadrže inhibitore kalcifikacije fetuin-A i matrični GLA protein10,11. Slično, Jahnen-Dechent et al. primijetili su da se mineralni kompleksi koji sadrže fetuin-A, koji su nazvani kalciproteinskim česticama (CPP), mogu otkriti u ascitičnoj tekućini pacijenata s kalcificirajućim peritonitisom12. Nedavna studija Bertazza i sur. pokazao je prisutnost mineralnih NP u aortnim zaliscima i koronarnim arterijama pacijenata s aterosklerotskom i reumatskom groznicom13. Dok su studije o formiranju mineralnih čestica obično usmjerene na ljudski kardiovaskularni sustav, ostaje nejasno mogu li se čestice naći u drugim tkivima i igraju li ti entiteti ulogu u zdravlju ili bolesti.

Ranije smo uočili da se mineralno-organski NPS spontano stvaraju u ljudskim i životinjskim tjelesnim tekućinama14-28. Ovi mineralni NP su prvotno opisani kao nanobakterije (NB) i vjerovalo se da su ne samo najmanje stanice na zemlji29, već i mogući prenosivi uzročnici brojnih bolesti, uključujući Alzheimerovu bolest, aterosklerozu, rak,bubregkamenformacija, policističnabubregbolesti prostatitis30-32. Međutim, naši su rezultati pokazali da je NB zapravo neživi mineralni NP koji oponaša uobičajene bakterije u smislu njihove morfologije, rasta, proliferacije i subkulture15,18,22. Mogućnost da se mineralne čestice slične takozvanom NB mogu naći u ljudskim tkivima i igraju li te čestice ulogu u bolestima tek treba ispitati.

U ovoj studiji razvili smo nanomaterijalni pristup za otkrivanje i analizu mineralno-organskih NP u oboljelog čovjekabubregtkiva. Pokazali smo da bubrežna tkiva pacijenata s terminalnim stadijem kronične bubrežne bolesti i karcinoma bubrega sadrže multilamelarne mineralne NP slične biomimetičkim mineralnim česticama koje se spontano talože u tjelesnim tekućinama in vitro. Naši rezultati otkrivaju kritične uvide u biokemijski sastav, mehanizam stvaranja i biološku funkciju ovih minerala-organskih čestica te bacaju svjetlo na mehanizme ektopične kalcifikacije i inicijacije bolesti u ljudskom tijelu.

Rezultati

Pregledali smo bubrežno tkivo kirurški uklonjeno iz pacijenata s krajnjim stadijem kronične bubrežne bolesti (n=2) ili s rakom bubrega (n=18; vidi tablicu 1; za uzorke raka bubrega usredotočili smo se na ne -kancerozni dio tkiva). Kao zdrave kontrole, proučavali smo biopsije bubrega dobivene od pacijenata s traumom ili hematomom, ali koji prethodno nisu imali abnormalnu funkciju bubrega (n=2; Tablica 1).

Tkiva bubrega zdravih pojedinaca pokazala su normalne histološke značajke, a nakon bojenja po von Kossi nije primijećena ektopična kalcifikacija (Slika 1A, B). S druge strane, bubrežna tkiva dobivena od oboljelih pojedinaca i obojena hematoksilinom i eozinom (H&E) pokazala su dokaze oštećenja tkiva (Slika 2A–C, označeno strelicama), a 80 posto pregledanih bolesnih tkiva pokazalo je mineralizirane naslage kao što je otkriveno bojanjem po von Kossi (sl. 1C–T, sl. 2E,F, kalcifikacija je vidljiva kao crni materijal označen crnim strelicama; vidi također tablicu 1). Kalcificirane naslage primijećene su u korteksu i meduli, uključujući izvanstanični prostor koji okružuje distalne zavojite tubule, proksimalne zavojite tubule, sabirne kanale i Henleove petlje, kao i citoplazmu stanica koje omeđuju tubule i kanale (Slika 1C–T i Slika 2E, F). U bubrežnom tjelešcu nije otkrivena kalcifikacija (slika 2D).

Kako bismo ispitali prirodu taloga minerala, pripremili smo ultratanke presjeke bubrega za promatranje transmisijskom elektronskom mikroskopijom (TEM). U uzorcima koji sadrže mikroskopske mineralne naslage, mineralne čestice ili granule otkrivene su u citoplazmi bubrežnih epitelnih stanica, u izvanstaničnom matriksu ispod bazalne membrane i unutar lumena proksimalnih i distalnih zavojitih tubula (sl. 3A, B, čestice su uvećane u tablama A1–A4 i B1–B4). Mineralni NP također su uočeni unutar stanica koje oblažu Henleove petlje i sabirne kanale (Slika 3C, D, uvećana na pločama C1, C2 i D1). Neke su čestice pronađene unutar unutarstaničnih vezikula u bubrežnim stanicama (Slika 3A, ploče A1 i A2). Pristup elektronskog mikroskopa koji se ovdje koristi također nam je omogućio vizualizaciju unutrašnjosti mineralnih čestica; neke su čestice sadržavale prstenove guste elektrone koji su se izmjenjivali sa svijetlim, elektron-prozirnim slojevima (Slika 3A, ploče A3 i A4, Slika 3C, ploča C1). Nekoliko krvnih žila, kao što su vasa recta rents (ravne arterije bubrega), okruženi smo velikim brojem mineralnih NP (Slika 3D, ploča D1). Mineralni NP-ovi su stoga pronađeni na različitim mjestima u svim tkivima ljudskih bubrega pokazujući znakove ektopične kalcifikacije, dok u ispitanim zdravim kontrolama nisu pronađene čestice.

Čini se da su mineralne čestice pronađene u bubrežnom tkivu vrlo slične mineralo-organskim NP-ima opisanim kako se spontano stvaraju u tjelesnim tekućinama u našim prethodnim studijama15,17 (i koje smo nazvali bioni24). Kako bismo potvrdili ovu mogućnost, pripremili smo mineralne organske NP (ili bione) koristeći metodu taloženja kao što smo prethodno opisali15. Ova se metoda sastoji od dodavanja taloženih iona poput kalcija i fosfata u medij stanične kulture (Dulbeccov modificirani Eagleov medij ili DMEM) koji sadrži tjelesnu tekućinu poput ljudskog seruma (HS), nakon čega slijedi inkubacija u uvjetima stanične kulture (vidi Metode). Čestice proizvedene na ovaj način (HS-NPS) bile su sferične ili elipsoidne i pokazivale su glatku ili kristalnu mineralnu površinu (Sl. 4A-E), slično česticama opisanim ranije u tjelesnim tekućinama22,23 kao iu ljudskom ascitesu12 i kalcificirane arterije13. Mineralne čestice bile su vrlo slične mineralnim NP ili granulama uočenim u bubrežnom tkivu u smislu njihove ukupne morfologije, višeslojne strukture i površinskih karakteristika (Sl. 4F-J). Veličina čestica izvedenih iz HS i bubrežnih granula također su bile usporedive, varirajući od 50 do 1500 nm u promjeru (sl. 4A-E, F-J). Kao što je gore navedeno, neke granule bubrega bile su okružene lipidnom membranom, vjerojatno predstavljajući intracelularne teretne vezikule ili ekstracelularne membranske vezikule (Sl. 4H,I, membrane su označene strelicama); takve membranske strukture nisu bile prisutne u uzorcima HS-NP pripremljenim in vitro (Sl. 4A-E). Ova zapažanja sugeriraju da su bubrežne granule slične mineralo-organskim NP skupljenim u serumu.

Koristeći analizu difrakcije elektrona odabranog područja, uočili smo da se mineralna faza HS-NP pripremljenih in vitro sastoji od polikristalnog nanomaterijala (Slika 4E, umetak; primijetite slabašne koncentrične prstenove). Slični rezultati dobiveni su za bubrežne granule (Slika 4J, umetak) i za kosti i ektopične kalcifikacije kao što je opisano u prethodnim studijama33,35.

Proučavali smo kemijski sastav HS-NP i bubrežnih granula koristeći energijsko-disperzijsku spektroskopiju X-zraka (EDX). HS-NP su pokazali glavne vrhove ugljika (C), kalcija (Ca), kisika (O) i fosfora (P) (Slika 4K), u skladu s prisutnošću minerala kalcijevog fosfata. Nizak vršni sadržaj silicija (Si) također je primijećen u HS-NP (slika 4K), što vjerojatno predstavlja manju česticu. Granule bubrega također su pokazale vršne vrijednosti ugljika, kalcija, kisika i fosfora, što je indikativno za mineral kalcijev fosfat, zajedno s dodatnim vršnim vrijednostima silicija i željeza (Fe) (Slika 4L). Vršne vrijednosti urana (U) pripisane su uranil acetatu korištenom kao kontrastnom reagensu tijekom pripreme uzorka (prisutnost urana u nekim uzorcima mineralnih čestica poput granula bubrega i njegova odsutnost u kontrolnom tkivu na slici 4M može se pripisati visokoj afinitet urana za fosfat, kao što je ranije objavljeno35). Kontrolni EDX spektri bubrežnog tkiva koje okružuje čestice pokazali su vrhove ugljika i kisika (Sl. 4M), što sugerira da su kalcij i fosfor pronađeni uglavnom u mineralnim česticama.

Omjeri kalcija i fosfora (Ca:P) HS-NP i bubrežnih granula varirali su od 0.65 do 1.18. Ovi se omjeri razlikuju od teorijske vrijednosti od 1,67 opažene za stehiometrijski hidroksiapatit, ali su još uvijek unutar raspona viđenog ranije za kristale kalcijevog fosfata i apatita promatrane pri različitim stupnjevima kristalizacije15. Zajedno, ovi nalazi potvrđuju da se granule bubrega sastoje od NP kalcijevog fosfata.

Utvrđeno je da različiti proteini inhibiraju ektopičnu kalcifikaciju na sistemski način u tijelu36,37. Osim toga, vjeruje se da proteinska korona koja se nalazi na površini sintetskih NP određuje biodistribuciju i učinke čestica na stanice in vivo38,39. S druge strane, proteinski sastav mineralo-organskih NP-ova pronađenih u tkivima ljudskih bubrega ostaje nepotpuno shvaćen. Prethodno smo otkrili da albumin, fetuin-A i apolipoprotein-A1 (apo-A1) predstavljaju glavne proteine ​​koji stupaju u interakciju s mineralno-organskim NP-ima formiranim u tjelesnim tekućinama17,20. Ovdje smo upotrijebili označavanje imunog zlata kako bismo ispitali prisutnost i ultrastrukturnu lokaciju ovih proteina unutar bubrežnih granula.

Koristili smo poliklonska protutijela protiv humanog serumskog albumina (HSA), ljudskog serumskog fetuina-A (HSF), ljudskog apo-1A i cijelog HS-a kako bismo ispitali prisutnost serumskih proteina u HS-NP-ovima i bubrežnim granulama. Specifičnost poliklonskih protutijela (pripremljenih kako je ranije opisano25) potvrđena je pomoću Western blottinga (slika 5). Svako od poliklonskih protutijela pozitivno je reagiralo s HS-NPs pripremljenim in vitro kao i s mineralnim granulama pronađenim u tkivima ljudskih bubrega (Slika 6A,B, ploče A1–A3 i B1–B3; crne točke). Protutijela su uglavnom reagirala sa slojevima gustim elektronima ili tamnom jezgrom HS-NP-ova i bubrežnih granula (Slika 6A, B), što ukazuje da bi ta tamna područja mogla sadržavati više razine proteina u usporedbi s elektron-prozirnim područjima. Negativne kontrole provedene bez primarnog protutijela nisu proizvele reakciju (Slika 6A, B, ploče A4 i B4, kontrola). Zaključili smo da bubrežne granule predstavljaju mineralo-organske NP-ove slične HS-NP-ovima na temelju njihove morfologije i mineralnog sastava, ali i na temelju njihovog vezanja na glavne inhibitore kalcifikacije prisutne u serumu.

Imunofluorescentna mikroskopija korištena je zatim za potvrdu prisutnosti mineralnih granula koje sadrže HSA i HSF u oboljelim ljudskim bubrezima. Koristeći ovu tehniku, pokazalo se tkivo ljudskih bubrega

pozitivno bojenje za dva proteina u različitim područjima, uključujući intersticij koji okružuje bubrežne tubule, kao i citoplazmu stanica koje omeđuju tubule (Slika 7A, ploče A1 i A2). Proteinski agregati koji sadrže i albumin i fetuin-A također su primijećeni u tim područjima, iako u manjim količinama u usporedbi s bojanjem pojedinačnih proteina (Slika 7A i ploča A3, spojeno bojenje u žuto). Značajno, primijetili smo da se bojenje proteina otkriveno imunofluorescencijom usko preklapa s uzorkom ektopične kalcifikacije promatrane upotrebom von Kossa bojenja (sl. 7A, B, kalcifikacija je vidljiva kao crni materijal označen strelicama u B). Ovi rezultati dodatno podupiru prisutnost mineralno-organskih čestica u ispitanim tkivima ljudskih bubrega.

Rasprava

Iako je postignut napredak u našem razumijevanju interakcija između sintetičkih NP-ova i ljudskih stanica, znamo znatno manje o učincima mineralo-organskih NP-ova koji se spontano stvaraju u tjelesnim tekućinama. Naše prethodne studije pokazale su da se te čestice stvaraju u biološkim tekućinama kada koncentracije kalcija i fosfata prijeđu zasićenje15,16. Također smo uočili da ove čestice internaliziraju imunološke stanice, ali da samo velike čestice induciraju proupalne imunološke reakcije23. Međutim, distribucija ovih čestica u ljudskim tkivima i igraju li fiziološku ili patološku ulogu u tijelu do sada nije ispitana.

U ovoj smo studiji po prvi put otkrili mineralo-organske NP-ove u bubrezima pacijenata koji boluju od završne faze bubrežne bolesti ili raka bubrega. Otkriveni mineralo-organski NP-ovi sadrže slabo kristalizirani kalcijev fosfat sličan koštanom mineralu, kao i albumin, fetuin-A i apo-A1 koji djeluju kao sistemski inhibitori kalcifikacije u tjelesnim tekućinama. Naši rezultati su u skladu s prethodnim izvješćima koja su opisala prisutnost mineralno-proteinskih kompleksa u vaskularnim tkivima i tjelesnim tekućinama12,13,34,40. Budući da su čestice koje smo promatrali pronađene u područjima bez mikroskopskih kalcifikacija, naša opažanja sugeriraju da bi čestice mogle predstavljati prekursore ektopične kalcifikacije u ljudskim tkivima. S obzirom na mogućnost da mineralo-organski NP mogu postupno rasti u veličini i podvrgnuti se pretvorbi čestica u film pod povoljnim uvjetima kao što je opisano u našim prethodnim studijama15,18, ovdje predstavljena opažanja sugeriraju da mineralni prekursori mogu dovesti do stvaranja većih naslage minerala in vivo, kao što su Randallov plak i bubrežni kamenci.

Naša zapažanja da se mineralne ektopične kalcifikacije i mineralo-organske NP nalaze u različitim anatomskim strukturama bubrega u skladu su s prethodnim nalazima ektopičnih kalcifikacija u ovom organu41. Promatranja Evana i suradnika pokazala su da mineralizacija u bubrezima pacijenata s nefrolitijazom može započeti i dogoditi se pretežno u intersticijskom tkivu Henleovih petlji40,42. Ovi su autori primijetili da mineralne naslage koje se stvaraju u ovom području mogu stršiti s bazalne strane urotela i dovesti do stvaranja bubrežnih kamenaca. Naša opažanja sugeriraju da, uz Henleove petlje, druga područja bubrega mogu sadržavati mineralne NP-ove koji bi se na kraju mogli razviti u velike mineralne naslage u ljudskim bubrezima. Također istražujemo mogućnost da se mineralni NP koji nastaju u krvotoku mogu translocirati u bubrežna tkiva i izazvati ektopičnu kalcifikaciju i stvaranje kamenca u bubrezima.

Nekoliko bubrežnih granula otkrivenih u ovoj studiji pronađeno je unutar unutarstaničnih ili izvanstaničnih vezikula (Slika 4H, I) i one su slične matriksnim vezikulama za koje je pokazano da induciraju kalcifikaciju u kostima i zubima7,8. Nedavno smo primijetili da vezikule izolirane iz ljudskog i životinjskog seruma induciraju stvaranje mineralnih NP i mikroskopskih precipitata in vitro25. Schlieper i sur.34 također su primijetili da su mineralne čestice pronađene u arterijama povezane s membranskim strukturama i predložili da matrične vezikule ili apoptotička tijela mogu predstavljati nukleatore mineralnih čestica u tim tkivima. Slično, Khan et al. objavio je da su naslage kalcijevog fosfata pronađene u bubrezima pacijenata s idiopatskim bubrežnim kamencem povezane s kolagenskim vlaknima i matričnim vezikulama9. Ovi rezultati sugeriraju da se mineralo-organski NP otkriveni u bubrežnom tkivu mogu formirati putem mehanizma koji uključuje membranske vezikule, što je situacija analogna onome što se vidi u aterosklerotskim arterijama7,8. S druge strane, nedavna studija pokazala je da ektopična kalcifikacija pronađena u arterijama dojke žena nije bila povezana s osteogenim ili apoptotskim staničnim markerima43, što sugerira da bi mehanizam kalcifikacije mogao biti specifičan za uključeni organ ili biološki kontekst. Osim toga, mineralo-organski NP kao što su ovdje opisani u tkivima ljudskih bubrega također se mogu formirati zbog neuspjeha u održavanju fizioloških koncentracija iona (npr. kalcija i fosfata) i inhibitora kalcifikacije (npr. albumin, fetuin-A i apo -A1) u tekućinama ljudskog tijela.

Naši rezultati sugeriraju da elektronski sloj i jezgra mineralno-organskih NP-ova mogu sadržavati više razine proteina i organskih molekula u usporedbi s elektron-prozirnim područjima čestica (Sl. 6A, B). Čini se da su ovi slojevi gusti elektroni mineralizirani kao što se vidi po kristalnoj prirodi ovog materijala pod TEM (vidi sl. 4A–J). Drugi autori, uključujući Ryalla41 i Evana i sur.44, predložili su da bi elektron-proziran sloj mogao predstavljati minerale dok bi elektron-gusti slojevi mogli odgovarati organskim molekulama. Ta tumačenja mogu biti barem djelomično posljedica načina na koji su uzorci obrađeni i ispitani u svakoj studiji, kao i prirode korištenih početnih tkiva.

Osim što igraju ulogu u ektopičnoj kalcifikaciji, minerali-organske čestice mogu izazvati upalu u bubrežnom tkivu. Nedavno smo pokazali da dok mineralo-organski NP ne uspijevaju inducirati izlučivanje proupalnog interleukina -1 od strane ljudskih makrofaga, mineralni agregati veći od 1 μm to mogu učiniti23. Pokazalo se da se oslobađanje interleukina-1 kao odgovor na kristalne materijale oslanja na aktivaciju unutarstaničnih molekularnih kompleksa nazvanih inflamasomi45-47. Osim toga, mineralne čestice otkrivene su u bubrezima u kojima se nalaze tumori, a povezanost između raka i upale sada je dobro poznata48. Mogućnost da agregirane mineralne čestice mogu aktivirati upalu i pridonijeti razvoju upale i raka u bubrezima ili drugim tkivima tek treba istražiti.

Osim ektopične kalcifikacije, mineralne granule opisane ovdje mogu sudjelovati u drugim procesima bolesti. Na primjer, ranije smo predložili da se mineralni NP mogu vezati na različite proteine ​​u tjelesnim tekućinama i iscrpiti te organske molekule iz tjelesnih tekućina20,26. S druge strane, ljudsko tijelo može spriječiti stvaranje i nakupljanje mineralnih NP u normalnim okolnostima oslanjajući se na prisutnost inhibitora kalcifikacije i retikuloendotelnog sustava (tj. makrofaga). Mineralni NP-ovi se stoga mogu akumulirati samo kada je sistemska ili lokalna homeostaza kalcija poremećena i kada zaštitni mehanizmi zakažu u ljudskom tijelu.

Predlažemo da se nanomaterijalni pristup razvijen ovdje može koristiti za proučavanje formiranja mineralo-organskih NP u životinjskim i ljudskim tkivima. Na primjer, antitijela podignuta protiv proteina inhibitora kalcifikacije kao što su albumin, fetuin-A i apo-A1 mogu se koristiti u kombinaciji s analizom minerala za otkrivanje i karakteriziranje formiranja mineralo-organskih NP-ova u tkivima životinjskih modela. Rezultati dobiveni ovim pristupom mogu se primijeniti na klinička mjerenja na ljudskim tjelesnim tekućinama kako bi se identificirali biološki parametri koji odražavaju stanje formiranja mineralnih čestica i ektopične kalcifikacije u tijelu. Očekujemo da bi ovo znanje moglo dovesti do razvoja novih terapijskih strategija za prevenciju i liječenje ljudskih bolesti i stanja povezanih s ektopičnom kalcifikacijom.

metode

Bubrežna tkiva.Korištenje ljudskih tkiva i pokuse izvedene u ovoj studiji odobrio je Institucionalni revizijski odbor Memorijalne bolnice Chang Gung; metode i pokusi provedeni su u skladu s odobrenim smjernicama. Od pacijenata je dobiven pismeni informirani pristanak. Kontrolna zdrava bubrežna tkiva dobivena su iz biopsija pacijenata s traumom i hematomom bez povijesti bolesti bubrega (n=2); bubrežna tkiva također su dobivena od bolesnika s rakom bubrega (n=20) i od pacijenata s krajnjim stadijem bubrežne bolesti (n=2) čiji su bubrezi uklonjeni ili biopsirani tijekom operacije transplantacije (Tablica 1). Za tkiva raka bubrega, nekancerogeni dio tkiva seciran je i analiziran u ovoj studiji.

Histološka analiza.Bubrežna tkiva su postavljena na parafinske blokove. Blokovi su razrezani, a kriške tkiva zagrijavane su na vrućoj ploči na 70 stupnjeva 30 minuta kako bi se uklonio parafin. Sekcije su uronjene u svježu otopinu ksilena tri puta po 15 minuta kako bi se u potpunosti uklonio preostali parafin. Sekcije su rehidrirane s 95 posto, 80 posto i 70 posto etanola svaki put 5 minuta. Rehidrirani uzorci su isprani dvostruko destiliranom vodom (ddH2O) 5 minuta. Stanične jezgre su bojene hematoksilinom 8 minuta. Boja je uklonjena s uzoraka toplom vodom 10 minuta. Uzorci bubrega su isprani u ddH2O i umočeni 10 puta u 95 postotni etanol. Uzorci tretirani etanolom obojeni su eozinom Y 1 minutu. Uzorci su dehidrirani s 95-postotnim i 100-postotnim etanolom svaki put 10 minuta, nakon čega je uslijedio korak dehidracije u ksilenu tijekom 10 minuta. Konačni dehidrirani uzorci bubrega postavljeni su na stakalce s 50 posto glicerola i promatrani pod svjetlosnim mikroskopom opremljenim digitalnom kamerom.

Deparafinizirani i rehidrirani uzorci pripremljeni su kako je opisano za H&E bojenje. Rehidrirani rezovi su obojeni srebrnim nitratom (5 posto), nakon čega je uslijedilo izlaganje UV svjetlu 20 minuta. Otopina je isprana s ddH20 15 minuta. Sekcije su obojene natrijevim tiosulfatom (5 posto) tijekom 5 minuta, nakon čega je slijedilo ispiranje s ddH2O tijekom 15 minuta. Sekcije su obojene nuklearno brzim crvenilom (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI) 5 minuta. Obojeni uzorci dehidrirani su sukcesivno s 95 postotnim i 100 postotnim etanolom tijekom 10 minuta svaki, prije dehidracije u ksilenu tijekom 10 minuta. Uzorci bubrega postavljeni su na stakalce i ispitani kako je gore opisano.

Elektronska mikroskopija i EDX analiza.Uzorci bubrega izrezani su na male komadiće debljine manje od 1 mm pomoću LGPS disekcijskog mikroskopa (Olympus, Tokyo, Japan). Tkiva su fiksirana s 2,5 posto glutaraldehida i 1 posto paraformaldehida u 0.1 M kakodilatnom puferu na 4 stupnja preko noći. Fiksirani uzorci su isprani tri puta s 0.1 M kakodilatnim puferom u 8 posto saharoze (pH 7,2) na ledu 10 minuta. Isprana tkiva su inkubirana u fosfatno puferiranoj slanoj otopini (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4) koja je sadržavala 1 posto osmij tetroksida i 1,5 posto kalij ferocijanida tijekom 2 sata na ledu. Tkiva su isprana s ddH2O na ledu 10 minuta tri puta. Isprana tkiva su obojena na ledu s 1 posto uranil acetata u ddH2O tijekom 1 sata, prije ispiranja tri puta s ddH2O na ledu. Bubrežna tkiva su dehidrirana s 30, 50, 70, 80 i 90 postotnim etanolom svaki put 10 minuta, osim kada je etanol dosegao 70 posto, u kojem slučaju su uzorci pohranjeni na 4 stupnja preko noći. Tkiva su obojena 1-postotnom fosfovolframovom kiselinom u 95-postotnom etanolu 15 minuta, prije dehidracije 95-postotnim etanolom 5 minuta. Uzorci su svaki put potopljeni u propilen oksid na 40, 57, 67 i 100 posto u etanolu na 10 minuta, nakon čega je uslijedilo još jedno uranjanje u 100 posto propilen oksid na 5 minuta. Tkiva bubrega su infiltrirana s 50, 70 i 100 posto Eponate 812 (Ted Pella, Redding, CA) svaki put 1 sat. Uzorci bubrega ugrađeni u Eponate 812- pripremljeni su inkubiranjem dva puta u 100 posto Eponate. Ugrađeni uzorci su inkubirani u pećnici na 60 stupnjeva preko noći kako bi se omogućila polimerizacija smole.

Isprane HS-NP pelete dobivene na gore navedeni način fiksirane su glutaraldehidom (2,5 posto) i paraformaldehidom (1 posto) u ddH2O tijekom 4 sata na 4 stupnja. Fiksirane pelete su isprane s ddH2O tri puta po 10 minuta svaki put. Peleti su dehidrirani uzastopnim inkubacijama u 30, 50, 70, 80, 90, 95 i 100 postotnom etanolu, svaki put po 10 minuta, osim kada je etanol dosegao 70 posto, u kojem su peleti pohranjeni na 4 stupnja preko noći. Ostale otopine etanola stavljene su u kontakt s peletima samo 10 minuta. Dehidrirane pelete infiltrirane su LR bijelim medijem za ugradnju (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) korištenjem različitih omjera etanola i LR medija (3:1, 1:1 i 1:3) tijekom 30 minuta svaki. Peleti su infiltrirani svježim LR medijem (100 posto) preko noći prije polimerizacije. Kuglice infiltrirane LR medijem su inkubirane u pećnici na 60 stupnjeva 2 dana kako bi se omogućila polimerizacija smole. Blokovi bubrega i HS-NP izrezani su kako bi se proizvele kriške debljine 70-100 nm pomoću mikrotoma Reichert Ultracut S (Leica, Wetzlar, Njemačka). Sekcije tkiva su obojene s 4 posto uranil acetata prije vizualizacije pod JEM 1230 prijenosnim elektronskim mikroskopom (JEOL, Tokyo, Japan) koji radi na 100 kV. Uzorci elektronske difrakcije dobiveni su pomoću istog sustava. Kao nosač korištene su rešetke od nikla.

Za EDX analizu, tanki presjeci tkiva bubrega obojeni su uranil acetatom i isprani s ddH2O kao gore, nakon čega je uslijedilo sušenje u elektronskom eksikatoru. Uzorci su promatrani pod JEM 2100 prijenosnim elektronskim mikroskopom visoke rezolucije (JEOL) koji je radio na 120 kV. EDX spektri dobiveni su u triplikatu korištenjem INCA Energy EDS sustava (Oxford Instruments, Abingdon, UK). Tanki presjeci HS-NP su promatrani bez bojenja.

Priprema mineralo-organskih NP.Sve početne otopine su podešene na pH 7,4 i sterilizirane filtracijom kroz 0.2 μm membrane prije upotrebe. HS je dobiven od zdravih dobrovoljaca korištenjem konvencionalne tehnike venepunkcije. Korištenje ljudskih bioloških tekućina u ovoj studiji odobrio je Institucionalni revizijski odbor Memorijalne bolnice Linko Chang Gung, a od volontera je dobiven pismeni informirani pristanak. HS-NP su pripremljeni dodavanjem 3 mM CaCl2 i Na2HPO4 svakog u DMEM (Gibco, Carlsbad, CA) koji je sadržavao 10 posto HS, nakon čega je uslijedila inkubacija tjedan dana u uvjetima stanične kulture (37 stupnjeva, 5 posto CO2, ovlaženi zrak). Čestice su peletirane centrifugiranjem na 16,000 ×g 15 minuta na 4 stupnja i isprane dva puta s HEPES puferom (20 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl) istim postupkom centrifugiranja.

SDS-PAGE i Western blotting.SDS-PAGE i Western blot analiza izvedeni su uglavnom kao prije15. Ukratko, 0.2 ug (Slika 5A,D) ili 1,2 ug (Slika 5B,C) HS proteina, 47 ug (Slika 5A,B,D) ili 590ug HS-NP proteina (Slika 5C), 0.1ug HSA (Slika 5A–D) i 0.6ug (Slika 5A, C, D) ili {{23} }.15 ug HSF-a (Slika 5B) otopljeno je u 5× "puferu za punjenje" (0.313 M Tris-HCl pH 6,8, 10 posto SDS, 0,05 posto bromofenol plavo, 50 posto glicerol, 12,5 posto - merkaptoetanol) do konačne koncentracije od 1x, prije zagrijavanja na 95 stupnjeva tijekom 5 minuta i odvajanja pod uvjetima denaturacije i redukcije na 10 postotnoj SDS-PAGE pomoću mini-gel sustava (Hoefer, Holliston, MA). Kontrola NP (korištena u stazi 1 na slici 5A–D) sastojala se od mineralnih NP-ova pripremljenih dodavanjem 3 mM CaCl2 i Na2HPO4 svakog u DMEM (konačni volumen od 1 ml), nakon čega je uslijedila inkubacija jedan dan u uvjetima kulture stanica; čestice su peletirane centrifugiranjem na 16,000 × g tijekom 15 minuta, dvaput isprane HEPES puferom i resuspendirane u 50 ul HEPES pufera. Alikvot od 20 ul resuspendiranih čestica obrađen je za SDS-PAGE kao gore. PVDF membrane su blokirane 1 sat u 5 postotnom (w/v) odmašćenom mlijeku na sobnoj temperaturi. Primarna protutijela proizvedena u kući kao što je prije opisano25 korištena su u razrjeđenju od 1:1,000 (-apo-A1 i -HS-NP), 1:3,000 (-HSF) , ili 1:6,000 (-HSA). Kozja anti-zečja sekundarna antitijela hrena konjugirana s peroksidazom korištena su na temelju uputa proizvođača (Millipore, Billerica, MA). Mrlje su otkrivene pomoću pojačane kemiluminiscencije (Amersham Biosciences, Amersham, UK) i autoradiografskih filmova.

Označavanje imunog zlata.Uzorci su pripremljeni za TEM promatranje. HS-NP blokovi su izrezani na kriške debljine manje od 70 nm. Sekcije uzorka na rešetkama blokirane su s 1 posto riblje želatine (Sigma) u 0.1 M HEPES puferu (pH 8,0) tijekom 25 minuta. Rešetke su inkubirane sa sljedećim primarnim antitijelima: -HSA, 1:30; -HSF, 1:50; -apo-A1, 1:30; -HS-NP, 1:60. Negativna kontrola nije sadržavala primarna antitijela (1 posto riblje želatine u HEPES puferu). Inkubirane sekcije su isprane HEPES puferom 15 minuta. Isprani dijelovi su blokirani s 1 posto riblje želatine u HEPES puferu tijekom 20 minuta. Uzorci su tretirani sekundarnim 5-nm-zlatnim konjugatom kozjeg anti-zečjeg IgG tijekom 1 sata. Uzorci su isprani HEPES puferom 10 minuta, prije ispiranja ddH2O 10 minuta. TEM promatranja su izvedena kao gore.

Fluorescentna mikroskopija.Histološka stakalca bubrežnog tkiva pripremljena na gore navedeni način blokirana su 1 postotnim goveđim serumskim albuminom 1 sat na sobnoj temperaturi. Stakalca su inkubirana s primarnim poliklonalnim protutijelima u razrjeđenju 1:4, 000. Nakon koraka ispiranja, uzorci su inkubirani sa sekundarnim protutijelima kozja anti-zečja-FITC (492/520 nm) i kozja anti-zečja-TRITC (550/570 nm) (Jackson Immuno Research, West Grove, PA) pri 1:100 za 1h. Kompleksi su isprani s PBST 15 minuta. Fluorescentna boja 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) korištena je pri 10 ug/ml tijekom 15 minuta. Uzorci obojeni DAPI dehidrirani su s 95 i 100 postotnim etanolom 10 minuta svaki, nakon čega je uslijedila dehidracija u ksilenu još 10 minuta. Uzorci dehidriranih bubrega montirani su s Vectashield fluorescence H-1000 medijem za montiranje (Vector Laboratories, Burlingame, CA) i promatrani su pod konfokalnim mikroskopom (LSM510 Meta; Zeiss, Oberkochen, Njemačka) opremljenim Spot Flex kamerom.

Cistanche tubulosa sprječava bolesti bubrega, kliknite ovdje za uzorak

Reference

1. Giachelli, CM Ektopična kalcifikacija: prikupljanje čvrstih činjenica o mineralizaciji mekog tkiva. Am J Pathol 154, 671-675 (1999).

2. Abedin, M., Tintut, Y. & Demer, LL Vaskularna kalcifikacija: mehanizmi i kliničke posljedice. Arterioscler Thromb Vasc Biol 24, 1161-1170 (2004).

3. Alexopoulos, N. & Raggi, P. Kalcifikacija u aterosklerozi. Nat Rev Cardiol 6, 681-688 (2009).

4. Allison, MA, Criqui, MH & Wright, CM Obrasci i čimbenici rizika za sistemsku kalcificiranu aterosklerozu. Arterioscler Thromb Vasc Biol 24, 331–336 (2004).

5. Ketteler, M. i sur. Nedostaci proteina koji reguliraju kalcij u bolesnika na dijalizi: novi koncept kardiovaskularne kalcifikacije u uremiji. Kidney Int Suppl 84, S84-87 (2003).

6. Kapustin, A. & Shanahan, CM Ciljanje vaskularne kalcifikacije: omekšavanje tvrde mete. Curr Opin Pharmacol 9, 84-89 (2009).

7. Kapustin, AN & Shanahan, CM Regulacija kalcija u matriksnim vezikulama koje potječu od vaskularnih glatkih mišićnih stanica. Trends Cardiovasc Med 22, 133–137 (2012).

8. Doherty, TM i sur. Kalcifikacija u aterosklerozi: biologija kostiju i kronična upala na arterijskom križanju. Proc Natl Acad Sci USA 100, 11201-11206 (2003).

9. Khan, SR, Rodriguez, DE, Gower, LB & Monga, M. Povezanost Randallovih plakova s ​​kolagenim vlaknima i membranskim vezikulama. J Urol 187, 1094-1100 (2012).

10. Price, PA, Nguyen, TM & Williamson, MK Biokemijska karakterizacija serumskog fetuin-mineralnog kompleksa. J Biol Chem 278, 22153-22160 (2003).

11. Price, PA, Williamson, MK, Nguyen, TM & Than, TN Serumske razine kompleksa fetuin-mineral koreliraju s kalcifikacijom arterija u štakora. J Biol Chem 279, 1594-1600 (2004).

12. Heiss, A. i sur. Hijerarhijska uloga fetuina-A i kiselih serumskih proteina u stvaranju i stabilizaciji čestica kalcijevog fosfata. J Biol Chem 283, 14815-14825 (2008).

13. Bertazzo, S. i sur. Nanoanalitička elektronska mikroskopija otkriva temeljne uvide u kalcifikaciju ljudskog kardiovaskularnog tkiva. Nat Mater 12, 576–583 (2013).

14. Martel, J. & Young, JD Navodne nanobakterije u ljudskoj krvi kao nanočestice kalcijevog karbonata. Proc Natl Acad Sci USA 105, 5549-5554 (2008).

15. Young, JD i sur. Navodne nanobakterije predstavljaju fiziološke ostatke i nusprodukte kulture normalne homeostaze kalcija. Plos One 4, e4417 (2009).

16. Young, JD i sur. Karakterizacija granulacija kalcija i apatita u serumu kao pleomorfnih mineralo-proteinskih kompleksa i kao prekursora pretpostavljenih nanobakterija. Plos One 4, e5421 (2009).

17. Wu, CY, Martel, J., Young, D. & Young, JD Fetuin-A/albumin-mineralni kompleksi koji podsjećaju na granule kalcija u serumu i navodne nanobakterije: demonstracija koncepta dvojne inhibicije-zasijavanja. Plos One 4, e8058 (2009).

18. Young, JD & Martel, J. Uspon i pad nanobakterija. Sci Am 302, 52-59 (2010).

19. Martel, J., Wu, CY & Young, JD Kritična procjena seruma ozračenog gama zračenjem koji se koristi kao hranilica u kulturi i demonstracija navodnih nanobakterija i kalcificirajućih nanočestica. Plos One 5, e10343 (2010).

20. Martel, J. i sur. Sveobuhvatna proteomska analiza mineralnih nanočestica izvedenih iz tekućina ljudskog tijela i analiziranih tekućinskom kromatografijom-tandem spektrometrijom masa. Analna biokemija 418, 111-125 (2011).