COVID-19 MRNA cjepivo štiti od SARS-CoV-2 Omicron BA.1 infekcije kod pretilih miševa izazvanih prehranom kroz poticanje urođenih antivirusnih odgovora domaćina

Sažetak

Pozadina

Pretilost je svjetska epidemija i smatra se čimbenikom rizika za ozbiljne manifestacije bolesti Coronavirus 2019 (COVID-19). Patogenost teškog akutnog respiratornog sindroma coronavirus 2 (SARS-CoV-2) i odgovori domaćina na infekciju, ponovnu infekciju i cijepljenje kod osoba s pretilošću ostaju nepotpuno shvaćeni.

Metode

Koristeći mišji model pretilosti izazvane prehranom (DIO), proučavali smo SARS-CoV-2 Alpha- i Omicron BA.1-inducirane manifestacije bolesti i imunološke odgovore domaćina na infekciju, ponovnu infekciju i COVID{ {6}} cijepljenje mRNA.

Nalazi

Za razliku od mršavih miševa, Omicron BA.1 i Alpha replicirali su se na usporedive razine u plućima DIO miševa i rezultirali sličnim stupnjem oštećenja tkiva. Važno je da su adaptivni imunološki odgovori posredovani T stanicama i B stanicama na infekciju SARS-CoV-2 ili cijepljenje mRNA COVID-19 oslabljeni u DIO miševa, što dovodi do veće sklonosti ponovnoj infekciji i manjeg cjepiva efikasnost. Međutim, unatoč odsutnosti neutralizirajućih protutijela, cijepljeni DIO miševi zaštićeni su od oštećenja pluća nakon izlaganja Omikronom, popraćenog značajno većom proizvodnjom IFN-a i IFN-a u plućnom tkivu. Plućni RNAseq i kasniji eksperimenti pokazali su da je cijepljenje mRNA protiv COVID-19 kod DIO miševa potaknulo antivirusni urođeni imunološki odgovor, uključujući ekspresiju IFN-a u usporedbi s necijepljenim kontrolnim skupinama.

biljka cistanche koja jača imunološki sustav

Tumačenje

Naša otkrića upućuju na to da cijepljenje mRNA protiv COVID-19 pojačava urođene antivirusne odgovore domaćina kod pretilosti što štiti DIO miševe do određenog stupnja kada je adaptivni imunitet suboptimalan.

Financiranje

Cjeloviti popis tijela financiranja koja su pridonijela ovoj studiji može se pronaći u odjeljku Zahvale.

Ključne riječi: pretilost; Dijetom izazvan pretili miš; SARS-CoV-2}}; COVID-19; Cijepljenje; Omikron

Uvod

Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) uzrokuje teški akutni respiratorni sindrom coronavirus-2 (SARS CoV-2), koji je rezultirao s više od 630 milijuna infekcija s više od 6,5 milijuna smrti.1 –3 Starija dob i komorbiditeti, uključujući hipertenziju, pretilost, određene vrste raka i kardiovaskularne bolesti, predloženi su kao čimbenici rizika za razvoj teške bolesti COVID-19.4 Među tim stanjima, pretilost se trenutačno smatra svjetskom epidemijom i povezuje se s tipom II dijabetes melitus, kardiovaskularne bolesti, hipertenzija i nealkoholna masna bolest jetre zbog stanja kronične sistemske upale niskog stupnja.5 Prethodne studije su izvijestile da su pretili (DIO) miševi izazvani prehranom izazvali disregulirane urođene imunološke reakcije i razvili ozbiljna oštećenja pluća nakon pandemijska infekcija gripom H1N1.6–8 Od izbijanja pandemije COVID-19, klinička izvješća sugeriraju da su ljudi sa stanjima povezanim s pretilošću izloženi većem riziku od COVID-19 i da su skloniji teškim bolestima. 9,10 Osim toga, nedavna studija pokazala je da je pretilost povezana s odgođenim uklanjanjem SARS-CoV-2 i nepovoljnom prognozom kod pacijenata s COVID-19.11 Međutim, patogenost SARS-CoV-2 i odgovori domaćina na ponovnu infekciju i cijepljenje kod osoba s pretilošću ostaju nepotpuno shvaćeni.12 Od svog pojavljivanja 2019., SARS-CoV-2 nastavlja se razvijati i stvarati nove zabrinjavajuće varijante SARS-CoV-2 ( VOC) uključujući Alpha, Beta, Gamma, Delta i Omicron. Ti HOS-ovi nose ključne mutacije u šiljcima i drugim virusnim proteinima koji kolektivno moduliraju njihovu patogenezu, imunološku izbjegavanje i prenosivost. Krajem studenog 2021. SARS-CoV-2 Omicron BA.1 prvi je put prijavljen u Južnoj Africi, koji se brzo proširio i zamijenio Deltu kao dominantno cirkulirajuću varijantu SARS-CoV-2 početkom 2022. Omicron BA .1 sadrži preko 30 promjena aminokiselina u skoku u usporedbi s predačkim SARS-CoV-2, što rezultira njegovim jedinstvenim virološkim značajkama uključujući smanjenu patogenost, povećanu prenosivost13–17 i izbjegavanje imuniteta izazvanog cjepivom.18– 20 Budući da su Omicron i njegove podlinije sada dominantni sojevi SARS-CoV-2, važno je razumjeti manifestaciju Omicron infekcije u pretiloj populaciji. Što je najvažnije, učinkovitost cijepljenja mRNA protiv COVID-19 u pretilim stanjima ostaje nepotpuno istražena.

U ovoj smo studiji upotrijebili DIO miševe kao životinjski model za simulaciju manifestacije Alpha i Omicron BA.1 u kontekstu SARS-CoV-2 patogeneze, reinfekcije i COVID-19 mRNA posredovane cjepivom zaštitu kod pretilih osoba. Prvo smo otkrili da je SARS-CoV-2 rezultirao težim ishodima bolesti kod DIO miševa nego kod mršavih miševa. U međuvremenu, otkrili smo da su odgovori protutijela koja neutraliziraju serum i odgovori interferona T stanica specifičnih za virus izazvani infekcijom virusom ili cijepljenjem mRNA protiv COVID-19 ozbiljno oslabljeni u DIO miševa, što je rezultiralo većom osjetljivošću na ponovnu infekciju i manja zaštita mRNA cjepiva protiv COVID-19 DIO miševa u usporedbi s mršavim miševima. Drugo, iako je infekcija Omikronom BA.1 uzrokovala oslabljene bolesti kod mršavih miševa, rezultirala je ozbiljnom bolešću kod DIO miševa sličnoj onoj kod Alfe. Treće, pokazali smo da dvije doze mRNA cijepljenja protiv COVID-19 nisu uspjele inducirati antitijela koja neutraliziraju serum protiv Omicron BA.1, ali su mogle ublažiti oštećenje pluća izazvano Omicron BA1-u DIO miševa. Studije transkriptomike plućnog tkiva pokazale su da su urođeni imunološki antivirusni odgovori kod DIO miševa značajno pojačani cijepljenjem, što ukazuje da cijepljenje mRNA protiv COVID-19 nudi zaštitu DIO miševima jačanjem urođenog antivirusnog imuniteta domaćina. Sve u svemu, naša je studija otkrila važno znanje o SARS-CoV-2 Alpha i Omicron BA.1 infekciji, ponovnoj infekciji i cijepljenju mRNA protiv COVID-19 u DIO miševa.

cistanche tubulosa-poboljšava imunološki sustav

Kliknite ovdje za pregled Cistanche proizvoda za jačanje imuniteta

【Tražite više】 E-pošta:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Metode

Etička izjava

Svi eksperimenti koji su uključivali živi SARS-CoV-2 izvedeni su u objektu Biosafety Level-3 na Odsjeku za mikrobiologiju Sveučilišta u Hong Kongu (HKU) u skladu sa standardnim operativnim postupcima. Sve pokusne postupke na životinjama odobrilo je Povjerenstvo za korištenje živih životinja u nastavi i istraživanju HKU pod CULATR 5786-21 i sukladnost sa smjernicama za korištenje životinja.

Virusi i biološka sigurnost

Izolirani su SARS-CoV-2 B.1.1.7/Alpha (GISAID: EPI_ISL_1273444) i B.1.1.529.1/Omicron BA.1 (GenBank: OM212469)18 od laboratorijski potvrđenih pacijenata s COVID-19 u Hong Kongu. Alpha i Omicron BA.1 uzgojeni su i titrirani testom plaka u stanicama VeroE6-TMPRSS2 i pohranjeni na -80 ◦C prije upotrebe.

Životinje

C57BL/6N miševi dobiveni su iz Centra za komparativna medicinska istraživanja HKU i držani u BSL- 2 laboratoriju za životinje s 12-h-intervalom dan/noć ciklusom.21 Indukcija pretilosti je izvedena kao što je prethodno opisano. 6 3 tjedana stare tek odbijene ženke miševa nasumično su podijeljene u 2 skupine, jedna skupina je hranjena dijetom s 45 Kcal% s visokim udjelom masti (D12451, Research Diet Inc, New Brunswick, NJ) tijekom 20 tjedana kako bi se inducirala dijeta- inducirane pretilosti (DIO) miševa, a kontrolna skupina hranjena je standardnom peletiranom hranom koja je sadržavala 13,2 Kcal% dijete (PicoLab Rodent Diet 20, LabDiet Code 5053, PMI) kao mršavi miševi. Prosječna tjelesna težina DIO miša korištenog u ovoj studiji bila je 40-50 g, a kontrolna skupina mršavih miševa bila je 25-30 g.

Kultura stanica i stimulacija

Alveolarni makrofagi (AM) izolirani su bronhoalveolarnom lavažom (BAL). Ukratko, nakon što su miševi žrtvovani intraperitonealnom injekcijom pentobarbitala, pluća su isprana s 1 mL hladnog PBS-a tri puta da se dobije 3 mL bronhoalveolarne tekućine za ispiranje (BALF). BALF iz miševa u istoj skupini skupljen je i centrifugiran na 500×g 10 minuta na 4 ◦C kako bi se prikupile istaložene stanice, AM-ovi su nasađeni s gustoćom od 50,000 stanica/jažici u 96- ploče s jažicama uzgajane u RPMI 1640 plus 1% penicilin-streptomicin na 37 ◦C u vlažnoj atmosferi od 5% CO2 tijekom 2 h, zatim su se monoslojevi AM-a mogli prilijepiti na ploče s kulturama, neadherentne stanice isprane su s ploča s PBS-om i AM-i su uzgojeni u RPMI 1640 plus 1% penicilin-streptomicin i 10% fetalni goveđi serum (FBS) sa ili bez stimulacije 1 ug/mL mRNA cjepiva, 100 ug/mL Poly (I:C) ili 100 ng/mL spike proteina tijekom 24 h .22 Supernatanti su prikupljeni za ELISA test. Stanice su temeljito isprane s PBS-om i sakupljene za ekstrakciju RNA.

Alpha i Omicron BA.1 izazov kod miševa

DIO i mršavi miševi pod anestezijom ketaminom (100 mg/kg) i ksilazinom (10 mg/kg)23 bili su intranazalno inokulirani sa 103 PFU Alpha ili Omicron BA.1 razrijeđenih u 20 ul fosfatno puferirane fiziološke otopine (PBS), kontrolni miševi inokulirani su istim volumenom PBS-a. Tjelesna težina i simptomi zaraženih miševa praćeni su 14 dana, simptomi bolesti uključivali su nakostriješeno krzno, pogrbljeno držanje i otežano disanje, a svakom znaku je dodijeljena jedna ocjena. Miševi su žrtvovani intraperitonealnom injekcijom pentobarbitala 2 i 4 dana nakon infekcije (dpi), 3-6 miševa u svakoj skupini je eutanazirano kako bi se uzeli uzorci krvi, tkiva pluća i nosnih školjki za virološku, histopatološku i imunološku procjenu. Za procjenu su prikupljeni uzorci pluća od svakog miša. Svaka podatkovna točka na ploči sa slikama predstavlja rezultat jednog miša.

Postupak cijepljenja

Miševi su nasumično podijeljeni u skupine i dobili su dvije doze cijepljenja mRNA protiv COVID-19 (BNT162b2, serija broj 1B004A, BioNTech, Njemačka) u intervalima od 14- dana. Cjepivo se temelji na mRNA modificiranoj nukleozidima formuliranoj u lipidnim nanočesticama koje kodiraju predački SARS-CoV-2 pune duljine. DIO i mršavim miševima intramuskularno je ubrizgano 50 ul (5 ug) COVID-19 mRNA cjepiva ili fiziološke otopine kao kontrola. 24,25 14. dana nakon prve doze cijepljenja, prikupili smo uzorke krvi i zatim dali drugu dozu mRNA cjepiva. 14 dana nakon druge doze, uzorci krvi su prikupljeni za procjenu odgovora antitijela. Miševi su zatim intranazalno inokulirani s 103 PFU Alpha ili Omicron BA.1. Na 2 dpi, miševi su žrtvovani intraperitonealnom injekcijom pentobarbitala, a uzorci uključujući uzorke krvi, pluća i tkiva nosne školjke sakupljeni su za virološku, histološku i imunološku procjenu. Plućna tkiva su razdvojena u tri dijela, lijevo pluće je sakupljeno za histološku procjenu, kaudalni režanj desnog pluća je sakupljen kao plućni homogenat, a ostatak desnog pluća je za ekstrakciju RNA.

Određivanje kopija gena SARS-CoV-2 i infektivnog virusnog titra u tkivima pluća i nosnih školjki

Ukupna RNA iz tkiva pluća i nosne školjke (NT) miševa s Alpha i Omicron BA.1 infekcijom ekstrahirana je MiniBEST Universal RNA ekstrakcijskim kompletom (9766, Takara Bio Inc. Shiga, Japan). Kopije gena SARS-CoV-2 RNA-ovisne RNA polimeraze (RdRp) kvantificirane su QuantiNova Probe RT-PCR kompletom (208354, Qiagen). qRT-PCR za otkrivanje kopija gena SARS-CoV-2 RdRp i gena housekeeping -actin za normalizaciju provedeni su na sustavu LightCycler 96 (Roche Applied Sciences, Indianapolis, SAD).21 Za titraciju infektivnog virusa, homogenati iz pluća (kaudalni režanj desnog plućnog krila) i NT tkiva zaražena Alpha i Omicron BA.1 provedena su testom infektivne doze kulture tkiva od 50% (TCID50) u stanicama VeroE6-TMPRSS2.26 Homogenati su {{ 19}}strukom serijskom razrjeđenju i inkubirane sa stanicama VeroE6-TMPRSS2 u 96-ploči s jažicama tijekom 1 sata na inkubatoru na 37 ◦C, supernatanti su odbačeni i stanice su dalje inkubirane na 37 ◦C tijekom 72 h. Opažen je citopatski učinak (CPE) i određen je 50% infektivni titar tkiva metodom izračuna krajnje točke Reed & Munch.26

Histopatologija, imunohistokemija i imunofluorescentno bojenje dijelova tkiva pluća i nosne školjke

Bojanje hematoksilinom i eozinom (H&E) isječaka tkiva fiksiranih formalinom i parafinom (svaki po 4 μm) promatrano je za histopatološke promjene. Ozbiljnost histopatologije u plućima ocijenjena je pod potpunim maskiranjem27 procjenom plućne kongestije, intersticijske infiltracije, alveolarne infiltracije i krvarenja i ocijenjena 0–4 kao što je prethodno opisano.26 Za bodovanje su korišteni sljedeći kriteriji: 0, normalni presjek pluća; 1, kongestija krvnih žila, perivaskularna ili peribronhiolarna infiltracija; 2, uz 1 s difuznom kongestijom alveolarne stijenke i infiltracijom; 3, infiltracija zračnog prostora, eksudacija, krvarenje lokaliziranog alveolitisa; 4, uočen je difuzni alveolitis. Imunohistokemijsko bojenje provedeno je DAB (3,3'-diaminobenzidin) supstrat kitom (Vector Laboratories) kao što smo prethodno opisali.28 Ukratko, za detekciju ACE2 antigena, ACE2 rekombinantna zečja monoklonska antitijela (MA5-32307, Invitrogen) su koristi se i prati razvijanje boje pomoću kompleta DAB supstrata. Protein ACE2 detektiran je hematoksilinom, a zatim isječcima tkiva s trajnim medijem za postavljanje VectaMount (Vector Laboratories). Za ekspresiju antigena SARS-CoV-2, stakalca plućnog i NT tkiva obojena su internim antitijelom zečjeg anti-SARS-CoV-2 nukleokapsidnog proteina (NP), a zatim sekundarnim antitijelom FITC –konjugirani kozji anti-zečji IgG (65-6111, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD). Za bodovanje NP korišteni su sljedeći kriteriji. Pluća: "Ocjena 0" - nema signala fluorescentnog bojenja; "Ocjena 1"- samo u 1-3 bronhiolarnom epitelu s N antigen-pozitivnim stanicama; "Ocjena 2" - više od 3 bronhiolarna epitela s N antigen-pozitivnih stanica; "Ocjena 3" - Bronhiolarni epitel s nekoliko pozitivnih stanica u obližnjoj alveoli; "score 4"- multipla žarišta ili velika površina alveola s N antigen pozitivnih stanica. NT: "Ocjena 0" - nema signala fluorescentnog bojenja; "Ocjena 1" - nekoliko N antigen-pozitivnih stanica razbacanih u epitelu; "Ocjena 2" - epitel pokazuje kontinuirano pozitivno žarište N antigena u susjednim stanicama; "Ocjena 3" - više N antigen pozitivnih epitelnih žarišta raspoređenih u drugom području. Slike su snimljene pomoću polumotoriziranog fluorescentnog mikroskopa Olympus BX53 ili svijetlog polja sa standardnim softverom OLYMPUS CellSense.

cistanche tubulosa-poboljšava imunološki sustav

Izolacija RNA i lančana reakcija polimeraze obrnute transkripcije u stvarnom vremenu

Ukupna RNA ekstrahirana je iz homogenata tkiva (kranijalni, srednji i pomoćni režnjevi sakupljeni su za pluća), a reverzna transkripcija za cDNA izvedena je pomoću MiniBEST Universal RNA Extraction Kit i RT Reagent Kit (RR036A Takara Bio Inc.) prema uputama proizvođača . Razine ekspresije citokina, kemokina i interferona detektirane su qRT-PCR-om sa specifičnim primerima (dodatna tablica S1) korištenjem SYBR Premix Ex Taq II kompleta (RR820A, Takara Bio Inc.). Vrijednosti svakog gena su normalizirane s genom za održavanje kuće -aktinom i predstavljene kao 2−ΔCt kao što smo prethodno opisali.28,29

Enzimski imunološki test (ELISA)

SARS-CoV-2 nukleoprotein (N), spike protein receptor binding domain (RBD) i inaktivirani SARS-CoV-2 obloženi su u 96-jažičastim imunoblastima (Nunc-Immuno Modules; Nunc A /S, Roskilde, Danska) u 0.05 M NaHCO3 i inkubirano na 4 ◦C, preko noći. Uzorci seruma su 2-struko serijski razrijeđeni i dodani na obloženu ploču, inkubirani na 4 ◦C 1 h nakon čega su dodana sekundarna protutijela konjugirana peroksidazom hrena (HRP) (zečji anti-mišji IgG, kozji anti-mišji IgG1, IgG2a, IgG2b, ab6728, ab98693, M32307, M32507, Abcam i Invitrogen) na 37 ◦C 1 h. Razvijanje boje izvedeno je s otopinom 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina (#N301, Thermo Fisher Scientific) na 37 ◦C tijekom 15 minuta i zaustavljeno s H2SO4. Vrijednosti optičke gustoće (OD) očitane su na 450 nm. Titri protutijela određeni su pomoću granične vrijednosti OD koja je postavljena na srednju OD neinficiranog seruma u svim razrjeđenjima plus 3 standardne devijacije, a najveće razrjeđenje koje daje vrijednost OD iznad granične vrijednosti određeno je kao titar protutijela serumu.30 Koncentracije IFN-, IFN-, albumina i hemoglobina određivane su korištenjem mišjeg IFN- (Invitrogen, SAD), IFN- (R&D Systems, SAD), albumina i hemoglobina (Abcam, Cambridge, UK) ELISA kompleta nakon upute proizvođača.

Mikroneutralizacijski (MNT) test

Uzorci seruma serijski su razrijeđeni 2-puta počevši od 1:10 u PBS-u i miješani sa 100 TCID 50 SARS-CoV-2 1 h na 37 ◦C, smjesa je dodana u prethodno zasijani VeroE 6-TMPRSS2 stanice u 96-ploči s jažicama na 37 ◦C 72 h. Opažen je CPE i određeni su titri neutralizirajućih protutijela kao najveće razrjeđenje seruma koje je potpuno inhibiralo citopatski učinak.

Slika 1: SARS-CoV-2 Alpha i Omicron BA.1 uzrokuju teže bolesti kod DIO miševa nego kod mršavih miševa.

Enzyme-linked immuno spot (ELISpot) analiza

Stanice koje proizvode IgG specifične za virus otkrivene su nasađivanjem suspenzije pojedinačnih stanica (2,5 × 105 stanica/po jažici) tkiva pluća i slezene u ELISpot ploču s inaktiviranim SARS-CoV-2 (5 ug/mL) na 37 ◦C 48 h. Stanice koje proizvode IgG određene su s alkalnom fosfatazom (AP) konjugiranim kozjim anti-mišjim IgG protutijelom (62-6522, Invitrogen).31 Za detekciju stanica koje proizvode IFN specifične za virus, 2,5 × 105 stanica/po jažici pojedinačnoj stanici suspenzija tkiva pluća i slezene inkubirana je u IFN-ELISpot ploči stimuliranom SARS-CoV-2 RBD peptidnim pulom i N proteinom na 37 ◦C tijekom 48 h, stanice koje proizvode IFN određene su korištenjem mišjeg IFN-ELISpot BASIC kit (3321-2A, Mabtech, Inc., Stockholm, Švedska) prema uputama proizvođača.32

Sekvenciranje RNA i analiza podataka

Ukupna RNA iz stanica plućnog tkiva DIO i mršavih miševa (n veće od ili jednako 3 po skupini) izolirana je pomoću NucleoSpin RNA kompleta (740955.250, MACHEREY-NAGEL, Duren, Njemačka) . DNA-osiromašena i pročišćena RNA korištena je za konstrukciju dvolančane (ds) cDNA biblioteke korištenjem seta reagensa za pripremu MGIEasy RNA Library (MGI, Shenzhen, Kina) prema standardnom protokolu. Podaci o sekvenciranju filtrirani su s brzim v0.20.1 kako bi se uklonili adapter i čitanja niske kvalitete.33 Očitavanja ribosomske RNA (rRNA) filtrirana su s URMAP v1.0. 1480 (Edgar, 2020), a 34 HISAT2 v2.2.0 korišten je za mapiranje očitanja prema referentnom genomu miša (GRCm38/ ENSEMBL 84).35 Datoteka za poravnanje korištena je za sastavljanje transkripata, procjenu njihove zastupljenosti i otkrivanje diferencijalne ekspresije gena, razine ekspresije gena kvantificirane su pomoću StringTie v2.1.5.36 Analiza glavnih komponenti (PCA) provedena je s R v4.0. Diferencijalno izraženi geni (DEG) i određeni na temelju brojanja gena s DESeq2 v3.15.37 DEG između različitih skupina za liječenje identificirani su pomoću clusterProfile s pragom od |log2FC| > 1 i FDR vrijednost < 0,05, i korišten za analizu obogaćivanja koja uključuje gensku ontologiju (GO), Enciklopediju gena i genoma Kyoto (KEGG).38 Svi geni u mišjem genomu korišteni su kao pozadina obogaćivanja. ImmuCellAI_Miš je korišten za određivanje obilja imunoloških stanica na temelju podataka RNAseq.39

Statistička analiza

Podaci predstavljaju srednje vrijednosti i standardne devijacije. Statističke razlike između dviju skupina procijenjene su Studentovim t-testom korištenjem GraphPad Prism 8. Statističke razlike između tri ili više skupina procijenjene su jednosmjernom ili dvosmjernom ANOVA korištenjem GraphPad Prism 9. Razlike su smatrane statistički značajnim kada je p < { {5}}.05. Slike i grafikoni u rukopisu pripremljeni su pomoću programa GraphPad Prism 8, Adobe Illustrator ili BioRender.com.

Validacija reagensa

Protutijela korištena u studiji potvrdio je komercijalni izvor od kojeg su kupljena. Detaljne informacije o reagensima korištenim u studiji mogu se pronaći u datoteci Validacije reagensa Dodatnih podataka (Dodatna tablica S2).

Uloga financijera

Izvori financiranja nisu imali nikakvu ulogu u dizajnu studije, prikupljanju podataka, analizi ili interpretaciji ili pisanju izvješća.

koristi cistanche za muškarce-jača imunološki sustav

Rezultati

SARS-CoV-2 Alpha i Omicron BA.1 uzrokuju teže bolesti kod DIO miševa nego kod mršavih miševa

Kako bi se razumjela patogenost SARS-CoV-2 u kontekstu pretilosti, DIO i mršavi miševi cijepljeni su s 103 PFU Omicron BA.1 (B.1.1.529.1) ili Alpha (B .1.1.7) intranazalnim putem. Omicron BA.1 i Alpha nose N501Y supstituciju u skoku koji im omogućuje da zaraze miševe divljeg tipa.40,41 U 14-dnevnom tijeku bolesti, primijetili smo spor, ali konstantan pad tjelesne težine kod Alpha-inficiranih mršavih miševa sa srednjim gubitkom tjelesne težine od 5% pri 14 dpi (Sl. 1a). Nasuprot tome, primijetili smo prosječno povećanje tjelesne težine od 1,5% kod mršavih miševa zaraženih Omikronom BA1-, što ukazuje da je patogenost Omikrona BA.1 kod mršavih miševa značajno oslabljena (slika 1a), što je u u skladu s nedavnim studijama koje smo proveli mi i drugi.14,42 Međutim, infekcija Alpha i Omicron BA.1 rezultirala je ozbiljnijim gubitkom tjelesne težine kod pretilih (DIO) miševa izazvanih prehranom, što je bilo približno 12% pri 9 dpi u usporedbi s njihovom izvornom tjelesnom težinom (100%) na 0 dpi (slika 1a). Zanimljivo, dok je postojala jasna razlika u srednjoj promjeni tjelesne težine između Alpha- i Omicron BA.1-mršavih miševa (14 dpi: -5,0% naspram +1,5%), tjelesna težina gubitak Alpha- i Omicron BA1-zaraženih DIO miševa bio je uglavnom isti (14 dpi: −11,1% naspram −11,4%) (Slika 1a). U skladu s mjerenjima tjelesne težine, Alpha i Omicron BA.1 infekcija rezultirala je usporedivim kliničkim simptomima u DIO miševa, uključujući nabrano krzno, pogrbljena leđa i otežano disanje koje je doseglo vrhunac pri 4 dpi (Slika 1b), dok nismo primijetili nikakve znak bolesti u mršavih miševa nakon Alpha ili Omicron BA.1 infekcije. Zatim smo procijenili histološke promjene u tkivima gornjeg i donjeg dišnog sustava. Lažno zaražena mišja nosna školjka (NT) i tkivo pluća prikazani su kao kontrola (dodatna slika S1). Promatrali smo blagu destrukciju epitela izazvanu virusom i upalnu infiltraciju u NT Alpha i Omicron BA1-mršavih miševa pri 2 dpi. Deskvamacija epitela i imunološka infiltracija bili su dramatičniji u NT dijelovima DIO miševa zaraženih Alpha ili Omicron BA.1 pri 2 dpi u usporedbi s mršavim miševima (Slika 1c). Pri 4 dpi, blago uništenje NT epitela s nekoliko krhotina luminalnih stanica otkriveno je u mršavih miševa zaraženih Alfa, dok su mršavi miševi zaraženi NT s Omicron BA1- izgledali relativno netaknuti. Međutim, nastavili smo otkrivati ​​ozbiljnu destrukciju epitela, luminalne ostatke i submukoznu infiltraciju imunoloških stanica u NT dijelovima DIO miševa 4. dana nakon Alpha ili Omicron BA.1 infekcije (Slika 1c). U plućnom tkivu mršavih miševa, Alpha infekcija rezultirala je lokaliziranom intersticijskom upalom i blagom alveolarnom kapilarnom kongestijom na 2 i 4 dpi, dok je infekcija Omikronom BA.1 rezultirala intersticijskom upalom pluća na 2 dpi, ali je uvelike nestala na 4 dpi (Sl. 1d). U oštrom kontrastu, teža histološka oštećenja alveola uočena su u plućnom tkivu DIO miševa nakon Alpha ili Omicron BA.1 infekcije, što se očitovalo kao ozbiljna kongestija plućnih krvnih žila na 2 dpi. Povećana peribronhiolarna i perivaskularna infiltracija imunoloških stanica, kao i imunološke stanice i tekući eksudati, primijećeni su u alveolarnim vrećicama na 4 dpi (Slika 1d). Koncentracija albumina u bronhoalveolarnoj lavažnoj tekućini bila je značajno viša u DIO miševa nego u mršavih miševa 4. dana nakon Alpha infekcije, što ukazuje na povećanu propusnost alveolarnih kapilara u SARS CoV-2-inficiranih DIO miševa (dodatna slika S2). U skladu s ovim nalazima, polukvantitativna histološka procjena plućnog tkiva pokazala je da je infekcija i Omicron BA.1 i Alpha rezultirala ozbiljnijom histopatologijom pluća kod DIO miševa nego kod mršavih miševa (Slika 1e). Sve u svemu, ovi rezultati pokazuju da infekcija SARS-CoV-2 dovodi do ozbiljnijih manifestacija bolesti kod DIO miševa nego kod mršavih miševa. Važno je da dok je Omicron BA.1 manje patogen od Alpha kod mršavih miševa, dvije varijante SARS CoV-2 su patogenije i uzrokuju slične bolesti kod DIO miševa.

Slika 2: SARS-CoV-2 replicira se učinkovitije u DIO miševa nego u mršavih miševa.

SARS-CoV-2 replicira se učinkovitije u DIO miševima nego u mršavim miševima 

Zatim smo pitali repliciraju li se Omicron BA.1 i Alpha učinkovitije u respiratornim tkivima DIO miševa u usporedbi s mršavim miševima. Otkrili smo da su se i Alpha i Omicron BA.1 replicirali na višim razinama u plućnom tkivu DIO miševa nego u mršavih miševa na 2 i 4 dpi (Slika 2a i b). U skladu s prethodnim izvješćima, Omicron BA.1 replicirao se na niže razine od Alpha u plućnom tkivu mršavih miševa. Konkretno, infektivni titar Omicron BA.1 bio je 26.1- i 3.8-puta niži od titra Alpha na 2, odnosno 4 dpi. Nasuprot tome, Omicron BA.1 i Alpha replicirali su se na slične razine u plućnom tkivu DIO miševa mjerenjem kopija gena RdRp i infektivnih titara (Slika 2a i b). Osim toga, također smo otkrili sličan obrazac virusnog RdRp gena i infektivnog titra u NT tkivima, gdje su se Omicron BA.1 i Alpha replicirali na usporedive razine u DIO miševa, ali ne i u mršavih miševa (Slika 2c i d). Imunofluorescentnim bojanjem otkrili smo izraženiju ekspresiju virusnog nukleokapsida (N) u plućnom i NT tkivu DIO miševa zaraženih s Omicron BA.1 ili Alpha u usporedbi s mršavim miševima na 2 i 4 dpi (sl. 2e i f i dopunski Slika S3). Paralelno smo kvantificirali ekspresiju ključnih interferona (IFN) i proupalnih citokina u plućnom tkivu. Naši su rezultati pokazali da su Omicron BA.1 i Alpha pokrenuli značajno niže razine IFN-a u DIO miševa u usporedbi s njihovim mršavim miševima (Slika 2g i Dodatna slika S4). Nasuprot tome, proupalni citokini uključujući IL-6 i IP-10 potaknuti su na višim razinama u DIO miševa infekcijom Omicron BA.1 i Alpha u usporedbi s mršavim miševima (Slika 2h). Osim toga, procijenili smo osnovnu ekspresiju ACE2 i TMPRSS2 u neinficiranih mršavih i DIO miševa i otkrili da su ACE2 i TMPRSS2 u mršavih i DIO miševa eksprimirani na usporedivim razinama. Međutim, imunohistokemijsko bojenje provedeno na ekspresiji antigena ACE2 otkrilo je veći intenzitet ACE2 u bronhiolarnom i alveolarnom epitelu neinficiranih DIO miševa u usporedbi s mršavim miševima (dodatna slika S5). Zajedno, ovi nalazi sugeriraju da oslabljena ekspresija IFN-a i veća ekspresija ACE2 kod DIO miševa mogu pridonijeti većoj replikaciji virusa i povećanom pro-upalnom odgovoru, što dovodi do ozbiljnijeg oštećenja tkiva kod DIO miševa.

Slika 3: Adaptivni imunitet stečen prethodnom infekcijom SARS-CoV-2 neučinkovito štiti DIO miševe. a

Adaptivni imunitet stečen prethodnom infekcijom SARS-CoV-2 neučinkovito štiti DIO miševe

Dalje, kako bi se razumjela zaštitna učinkovitost adaptivnog imuniteta protiv ponovne infekcije u pretilom stanju, rekonvalescentni DIO miševi i mršavi miševi ponovno su izazvani s 103 PFU Alpha 28. dana nakon primarne infekcije, a uzorci su prikupljeni 2 dana nakon ponovne infekcije ( dpr) (slika 3a). Analizirali smo IgG antitijela protiv SARS-CoV-2 antigena u uzorcima seruma uzetih 14. dana nakon primarne Alfa infekcije i otkrili da titar IgG protiv SARS CoV-2 N i šiljasta domena vezanja receptora ( RBD) bili su značajno niži kod DIO miševa nego kod mršavih miševa za 1.9- (p=0.0128) i 3.4-puta (p=0.0362) , odnosno (slika 3b). Osim toga, titar ukupnog IgG koji se veže za virus i podtip IgG1, IgG2a i IgG2b bili su značajno niži u DIO miševa u usporedbi s mršavim miševima (Slika 3b). Serumski neutralizacijski titar od 1:10–1:20 otkriven je kod 5 od 6 mršavih miševa, ali nije otkriven ni kod jednog od 6 DIO miševa (Slika 3b), što ukazuje na oslabljen adaptivni imunološki odgovor u DIO miševa nakon SARS-a. CoV-2 infekcija. Kod 2dpr, virusna kopija gena RdRp lako je detektirana iz svih NT tkiva i 3/6 (50%) plućnog tkiva ponovno izazvanih DIO miševa (Slika 3c), dok kopija virusnog RdRp gena nije pronađena iz NT i pluća tkiva ponovno izazvanih mršavih miševa. Dosljedno, često smo otkrivali virusni N protein u epitelu NT i plućnom tkivu u DIO miševa, ali ne i mršavih miševa (Slika 3d). Histološka ispitivanja otkrila su destrukciju epitela u NT tkivima kao i kongestiju alveolarne stijenke, peribronhiolarnu infiltraciju i lokalizirano alveolarno krvarenje u plućnom tkivu DIO miševa, ali ne i mršavih miševa (Slika 3e). Zatim smo procijenili prisjećanje odgovora imunološkog pamćenja nakon ponovne infekcije u mršavih i DIO miševa, otkrili smo da su stanice koje proizvode virus specifične IFN- i IgG u tkivima pluća i slezene DIO miševa bile značajno niže nego kod mršavih miševa na 2dpr (sl. 3f i g). Važno je da nismo bili u mogućnosti detektirati nikakav titar neutralizirajućih antitijela protiv Alpha u serumu DIO miševa 2. dana nakon ponovne infekcije Alpha, dok je 4/6 (66,7%) ponovno zaraženih mršavih miševa imalo neutralizirajući titar od 1 :10 (slika 3h). Prema tome, naša otkrića sugeriraju da su DIO miševi osjetljiviji na ponovne infekcije zbog nedovoljno postavljenog adaptivnog imunološkog odgovora B stanica i T stanica na infekciju SARS-CoV-2.

Slika 4: Cijepljenje mRNA protiv COVID-19 nudi manju zaštitu od Alpha infekcije kod DIO miševa zbog oslabljenog adaptivnog imunološkog odgovora. a

Cijepljenje mRNA protiv COVID{0}} nudi manju zaštitu od Alpha infekcije kod DIO miševa zbog oslabljenog adaptivnog imunološkog odgovora

Kako bismo istražili učinkovitost zaštite za DIO miševe nakon imunizacije s mRNA cjepivima, intramuskularno smo ubrizgali DIO i mršavim miševima režim cijepljenja s dvije doze COVID-19 mRNA nakon čega je uslijedio Alpha izazov 14 dana nakon pojačanja, kao što je prikazano na slici. 4a. Za NT tkiva otkrili smo virusni RdRp gen u 3/6 (50%) i infektivni titar u 2/6 (33,3%) cijepljenih mršavih miševa, dok smo virusni RdRp gen i infektivni titar otkrili kod svih cijepljenih DIO miševi (Slika 4b), što sugerira da je do proboja infekcije nakon cijepljenja došlo znatno lakše kod DIO miševa u usporedbi s mršavim miševima. U skladu s prethodnim izvješćima da sugerirana cijepljenja nude bolju zaštitu donjeg dišnog trakta u usporedbi s gornjim dišnim putovima u ljudskim i životinjskim modelima,43,44 nismo otkrili kopiju virusnog gena ili infektivni virus iz bilo kojeg plućnog tkiva cijepljenih mršavi miševi (slika 4c). Nasuprot tome, otkrili smo virusni RdRp gen u 3/6 (50%) i infektivni titar u 4/6 (66,7%) plućnog tkiva DIO miševa. Histološki smo uočili opsežno razaranje epitela u NT tkivima cijepljenih DIO miševa nakon izlaganja alfa virusom, dok je manji stupanj oštećenja NT tkiva primijećen u cijepljenih mršavih miševa (Sl. 4d). U plućnom tkivu cijepljenih DIO miševa otkrili smo kongestiju i infiltraciju u alveolarnom prostoru popraćenu žarištima alveolarnog krvarenja nakon Alfa infekcije, dok su ta histopatološka oštećenja uglavnom izostala u plućnom tkivu cijepljenih mršavih miševa (Slika 4e). U skladu s ovim nalazima, cijepljenje mRNA protiv COVID-19 smanjilo je ekspresiju SARS-CoV- 2 N i kod mršavih i kod DIO miševa u NT tkivima (Slika 4f). U plućnom tkivu, virusni N signali otkriveni su samo u cijepljenim DIO miševima, ali ne i u cijepljenim mršavim miševima (Slika 4g). Zatim smo otkrili da su stanice koje proizvode virus specifične IFN- i IgG u tkivima slezene cijepljenih DIO miševa bile značajno niže u usporedbi s onima u cijepljenih mršavih miševa 2. dana nakon Alpha infekcije (Slika 4h). Važno je da je mikroneutralizacijski test otkrio samo neutralizirajuća protutijela protiv Alpha u serumu DIO miševa 14 dana nakon druge doze cijepljenja i 2 dana nakon izazivanja virusa, ali razina je bila 2.8-puta (p < 0,0001) i 21 .8- nabora (p=0.0053) niže nego kod mršavih miševa (Sl. 4i). Zajedno, ovi rezultati pokazuju da su adaptivni odgovori protutijela na cijepljenje mRNA protiv COVID-19 oslabljeni kod DIO miševa.

Cijepljenje mRNA protiv COVID-19 ublažava oštećenje pluća uzrokovano izazovom Omicron BA.1 kod DIO miševa u nedostatku detektabilnih neutralizirajućih protutijela

Zatim smo pitali u kojoj mjeri mRNA cijepljenje protiv COVID{{0}} štiti DIO miševe od SARS-CoV-2 Omicron BA.1. U tu smo svrhu prvo testirali titar neutralizirajućih antitijela u serumu protiv Omicron BA.1 i otkrili nizak titar u mršavih miševa 14 dana nakon pojačanja, dok titar neutralizirajućih antitijela nije otkriven u DIO miševima čak ni nakon dvije doze cijepljenja protiv COVID-a{{ 6}} pojačanje mRNA ili 2 dana nakon infekcije Omikronom BA.1 (sl. 5a i b), što sugerira da je cijepljenje u DIO miševa induciralo malo križnih protutijela protiv Omikrona BA.1. Zatim su DIO i mršavi miševi izazvani sa 103 PFU Omikrona BA.1 intranazalnim putem 14 dana nakon pojačanog cijepljenja (Slika 5a). U NT tkivima, cijepljenje mRNA protiv COVID-19 umjereno je smanjilo replikaciju Omicron BA.1 i infektivni titar u mršavih miševa, ali je imalo mali učinak u DIO miševa u usporedbi s necijepljenim kontrolama (Slika 5c). Zanimljivo je da je cijepljenje mRNA protiv COVID-19 značajno smanjilo replikaciju Omikrona BA.1 u plućnom tkivu DIO miševa u usporedbi s njihovim necijepljenim kontrolama, iako nije tako učinkovito kao potpuna inhibicija Omikrona BA.1 u plućnom tkivu cijepljenih mršavih miševi (slika 5d). Konkretno, kopija gena Omicron BA.1 RdRp smanjena je za 867-puta (p=0.0087), a infektivni titar za 7979.9-puta (p < 0,0001) kod cijepljenih DIO miševa . U skladu s gornjim virološkim nalazima, cijepljenje mRNA protiv COVID-19 bilo je manje učinkovito u smanjenju ekspresije antigena Omicron BA.1 u NT tkivima mršavih i DIO miševa, ali je smanjilo ekspresiju antigena Omicron BA.1 u tkivima pluća mršavih i DIO miševa (Slika 5e). Kod 2 dpi, infekcija Omicron BA.1 rezultirala je određenim stupnjem kongestije i infiltracije u alveolarnom prostoru praćenom plućnim krvarenjem i oštećenjem epitela u necijepljenih DIO miševa, koji su smanjeni cijepljenjem mRNA protiv COVID-19 (Slika 5f). Važno je napomenuti da smo otkrili da su koncentracije IFN-a i IFN-a u plućnom tkivu cijepljenih DIO miševa značajno povećane u usporedbi s necijepljenim miševima na 2 dpi nakon izlaganja Omikronom BA.1, dok su serumska neutralizirajuća protutijela ostala nemjerljiva kod cijepljenih. DIO miševi (slika 5g). Ukupna ozbiljnost bolesti prema promjenama tjelesne težine pokazala je da je cijepljenje mRNA protiv COVID-19 smanjilo maksimalni gubitak tjelesne težine kod DIO miševa na 9% u usporedbi s 13% kod necijepljenih DIO miševa (dodatna slika S6). Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju da, unatoč pokretanju nemjerljive razine odgovora protutijela, cijepljenje mRNA protiv COVID-19 može poboljšati urođene antivirusne odgovore kako bi se ublažilo oštećenje plućnog tkiva izazvano Omicronom BA1-u DIO miševa.

Slika 5: COVID-19 mRNA cjepivo ublažava oštećenje pluća u odsutnosti odgovora neutralizirajućih protutijela kod Omicron BA.1-DIO miševa. a

Cijepljenje mRNA protiv COVID-19 pojačava antivirusne odgovore u plućima DIO miševa

Kako bismo bolje razumjeli imunološke odgovore u plućnom tkivu DIO miševa s COVID-19 mRNA cijepljenjem, prikupili smo uzorke mišjih pluća i istražili njihove profile transkriptoma 2. dana nakon infekcije Omicronom BA.1 (Slika 6a i Dodatna slika. S7). Intrigantno je da smo uočili značajno obogaćivanje gena uključenih u puteve povezane s urođenim antivirusnim odgovorima, uključujući "stanični odgovor na IFN- i IFN-" i "pozitivnu regulaciju proizvodnje IFN-a i IFN-a" u plućnom tkivu cijepljenih DIO miševa ( Slika 6b). Analiza kompleta imunoloških gena dalje je otkrila da su cijepljeni DIO miševi imali najveći broj M1 makrofaga među svim procijenjenim skupinama (slika 6c). Kako bismo procijenili je li mRNA cjepivo protiv COVID-19 potaknulo antivirusne interferonske odgovore u alveolarnim makrofagima, izolirali smo alveolarne makrofage iz mršavih miševa i DIO miševa i stimulirali ih mRNA cjepivom (Slika 7a). Otkrili smo da je in vitro stimulacija mišjih alveolarnih makrofaga mRNA cjepivom izazvala značajnu regulaciju RIG-I, MDA5, STAT1, STAT2, ISG15, IFIT3 i OAS3, dok su samo alveolarni makrofagi iz DIO miševa pokazali značajno povećanje proizvodnje IFN-a na mRNA i razine proteina (sl. 7b i c). Ovi nalazi ukazuju na različiti profil odgovora alveolarnih makrofaga iz DIO miševa i mršavih miševa. Zatim smo izolirali mišje alveolarne makrofage iz cijepljenih ili necijepljenih mršavih i DIO miševa, nakon čega smo stimulirali stanice poli (I: C) ili SARS-CoV-2 šiljastim proteinom (Slika 7d). In vitro stimulacija s poli (I:C) dodatno je povećala ekspresiju gena povezanih s urođenim imunološkim odgovorom u alveolarnim makrofagima cijepljenih mršavih i DIO miševa. Zanimljivo je da su geni stimulirani interferonom, uključujući ISG15, IFIT3 i OAS3, bili jače regulirani u alveolarnim makrofagima s cjepivom iz DIO miševa u usporedbi s onima iz mršavih miševa (Slika 7e). Paralelno, rekombinantna stimulacija SARS-CoV-2 šiljkom proteina povećala je ekspresiju RIG-I, TLR3, IL-6, TNF-, IFN-, IFN-, IRF7 i STAT2 mRNA ekspresiju u cjepivu- pripremljeni alveolarni makrofagi DIO miševa, ali ne i mršavih miševa (slika 7g). Važno je da je proizvodnja IFN-a dramatično povećana u alveolarnim makrofagima cijepljenih DIO miševa kao odgovor na stimulaciju poli (I:C) ili S proteina (Slika 7f i h). Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju da cijepljenje mRNA protiv COVID-19 može obnoviti urođeni antivirusni odgovor u plućima DIO miševa modulacijom ekspresije gena povezanih s interferonom tipa I u alveolarnim makrofagima.

Slika 6: Cijepljenje mRNA protiv COVID-19 pojačava antivirusne odgovore u plućima DIO miševa. a

Rasprava

Pretilost je povezana s pogoršanim upalnim reakcijama i poremećajem imunološkog sustava što posljedično dovodi do visokog rizika od ozbiljnosti i prijema u bolnicu za pacijente s COVID-19.45 Ostaje nejasno kako te kronične upale niskog stupnja i disfunkcija imunoloških odgovora modulirati tijek infekcije SARS-CoV-2. Kako bi se istražila patogeneza SARS-CoV-2 i procijenila učinkovitost cijepljenja mRNA protiv COVID-19 kod pretilih pojedinaca, hitno su potrebni odgovarajući modeli malih životinja za oponašanje kliničkih obilježja pacijenata s COVID-19 . Međutim, predački SARS-CoV-2 ne inficira laboratorijske miševe divljeg tipa jer se RBD predačkog šiljka ne veže učinkovito na mišji ACE2.21,40,41 Zanimljivo, nedavno su se pojavile varijante SARS-CoV-2 , uključujući Alpha (B.1.1.7), Beta (B.1.351), Gamma (P.1) i Omicron BA.1 (B.1.1.529.1), stekli su mutaciju N501Y u spikeu, što omogućuje križanje vrsta prijenosa SARS-CoV-2 na mišjeg divljeg tipa.41,46-50 U ovoj studiji koristimo model pretilog divljeg tipa miša uzrokovan prehranom kako bismo istražili SARS-CoV-2 Alpha i Omicron BA.1 patogeneza, ponovna infekcija i cijepljenje.

cistanche tubulosa-poboljšava imunološki sustav

Naši su rezultati pokazali da je infekcija Omicronom BA.1 manje ozbiljna od one Alpha u mršavih miševa prema promjeni tjelesne težine, virusnom opterećenju, titru virusa, plućnim proupalnim markerima i histopatološkim nalazima. Ovi su rezultati u skladu s nedavnim izvješćima u kojima je uočena niža razina infekcije Omicronom BA.1 u usporedbi s prethodnim varijantama SARS-CoV-2 na životinjskim modelima.14,42 Povećana ozbiljnost SARS-CoV{{7} } infekcija u DIO miševa nego u mršavih miševa u skladu je s rezultatima nedavnih studija provedenih na pretilim miševima i hrčcima izazvanim dijetom.51–53 Zanimljivo je da smo otkrili da se Omicron BA.1 replicirao na sličnu razinu u usporedbi s Alpha u DIO miševa, što je rezultiralo usporedivom patogenošću Omicron BA.1 i Alpha u DIO miševa. Konkretno, reprezentativni proupalni citokini, uključujući IP-10 i IL-6 bili su snažno potaknuti infekcijom Omicron BA.1 u DIO miševa, što ukazuje na povećano upalno oštećenje i morbiditet.54 U međuvremenu, proizvodnja antivirusnog IFN-a u plućnom tkivu DIO miševa bio je značajno niži nego kod mršavih miševa nakon Alpha i Omicron BA.1 infekcije. Ovi rezultati sugeriraju da Omicron BA.1 infekcija kod DIO miševa može uzrokovati tešku bolest sličnu onoj Alpha. Trenutačno nije u potpunosti shvaćeno kako pretilost doprinosi teškim bolestima kod COVID-a-19. Povećana razina leptina obilježje je pretilosti koja regulira metabolizam, Jak/STAT i Akt signalne putove i modulira funkcije T stanica, što može pridonijeti ozbiljnom ishodu.55,56 Humoralni imunitet posredovan protutijelima bitan je za obranu domaćina, 57–59, dok optimalno uklanjanje virusa kod SARS-CoV-2-inficiranih miševa također zahtijeva CD4+ i CD8+ T-stanične odgovore.60 U ovoj smo studiji otkrili značajno niže razine B stanica i odgovor T stanica kod DIO miševa u usporedbi s mršavim miševima, što može pridonijeti povećanoj osjetljivosti na ponovnu infekciju kod DIO miševa. Temeljni mehanizam smanjenog odgovora B stanica i T stanica u DIO miševa ostaje nepotpuno istražen, ali može biti povezan s oštećenjem funkcionalnosti dendritičnih stanica kao što je otkriveno u prethodnim studijama virusa influence.61-63

Unatoč uspjehu cijepljenja mRNA protiv COVID{0}} s visokom učinkovitošću u zaštiti od teških bolesti SARS-CoV-2, pojava izbjegavanja imunološkog sustava u varijantama SARS-CoV-2 može ugroziti učinkovitost cjepiva.43 U našem DIO mišjem modelu s režimom imunizacije s dvije doze, neutralizirajuće antitijelo u mršavih miševa bilo je lako otkriveno i snažno pojačano drugom dozom cijepljenja protiv Alpha i Omicron BA.1. Suprotno tome, režim imunizacije s dvije doze cijepljenja mRNA protiv COVID-19 rezultirao je nemjerljivim serumskim neutralizirajućim antitijelima i protiv Alpha i protiv Omikrona BA.1 u DIO miševa, a nijedno neutralizirajuće antitijelo nije otkriveno protiv Omikrona BA.1 čak ni drugog dana nakon izazova Omicron BA.1. Ovi nalazi pokazuju da su adaptivni odgovori B stanica na mRNA cjepivo ozbiljno oslabljeni u DIO miševa, što može biti posljedica poremećaja u razvoju, aktivaciji i funkcijama B stanica.64-66 Zanimljivo je da je cijepljenje ponudilo određeni stupanj zaštite za Omicron BA. .1-izazvali su DIO miševe u donjem dišnom sustavu, ali ne i u nosnim školjkama zaraženih životinja. Nedovoljna zaštita u tkivima nosne školjke može biti posljedica nedovoljnog imunološkog odgovora sluznice nakon intramuskularnog cijepljenja koje nije uspjelo izazvati dovoljan zaštitni imunitet na mjestima sluznice.67,68

Slika 7: Alveolarni makrofagi (AM) DIO miševa doprinose pojačanim antivirusnim odgovorima. a

Transkriptomskom analizom otkrili smo da je cijepljenje mRNA protiv COVID{0}} pojačalo antivirusne odgovore u plućima DIO miševa. Naknadni eksperimenti otkrili su da je proizvodnja IFN-a u odgovoru na poli (I:C) ili SARS-CoV-2 proteinsku stimulaciju povećana u alveolarnim makrofagima cijepljenih DIO miševa. Zajedno sa smanjenim virusnim opterećenjem i histopatološkim promjenama te povećanom koncentracijom IFN- / u plućima Omicron BA.1- izazvanih cijepljenih DIO miševa, naša otkrića sugeriraju da mRNA cijepljenje jača urođeni imunitet domaćina kod pretilih životinja koje doprinosi promatranoj zaštiti. Općenito, naša studija otkriva važno znanje o SARS-CoV-2 Alpha i Omicron BA.1 infekciji, ponovnoj infekciji i cijepljenju kod pretilih miševa izazvanih dijetom, što pruža uvid u upravljanje, liječenje i strategije cijepljenja za pretile populacije. Naša studija ima nekoliko ograničenja. Prvo smo izvršili ponovno izazivanje 28 dana nakon primarne infekcije. U scenarijima iz stvarnog života, dugovječnost pamćenja i zaštitu od ponovne infekcije kod pacijenata treba pratiti tijekom duljeg vremenskog okvira. Drugo, ženke miševa korištene su u ovoj studiji budući da je poznato da ženke razvijaju jače urođene i adaptivne imunološke odgovore od mužjaka.69 Diferencijalni imunološki odgovori protiv SARS-CoV-2 između spolova i njihove uloge u razvoju bolesti COVID-a{{ 19}} treba dodatno istražiti. Treće, koristili smo samo model miševa divljeg tipa za ovu studiju, dodatna procjena na ljudima trebala bi se provesti u budućim kliničkim studijama kako bismo potvrdili i dodatno istražili naše nalaze o tome poboljšava li cijepljenje mRNA protiv COVID-19 urođene imunološke reakcije SARS-CoV-2 infekcija u cijepljenih pretilih pacijenata. Unatoč tome, naša studija pruža važne uvide koji sugeriraju da pretili pacijenti mogu razviti teže kliničke bolesti nakon infekcije SARS-CoV-2 i da su osjetljiviji na ponovne infekcije ili infekcije uzrokovane cjepivom. Važno je da naši podaci sugeriraju da mRNA cjepiva protiv COVID-19 mogu ostati učinkovita kod pretilih osoba unatoč slabom ili odsutnom odgovoru protutijela, dodatno naglašavajući važnost cijepljenja u tim populacijama.

Reference

1 Zhou P, Yang XL, Wang XG, et al. Izbijanje upale pluća povezano s novim koronavirusom vjerojatnog porijekla od šišmiša. Priroda. 2020;579(7798):270–273.

2 Chu H, Chan JF, Yuen TT, et al. Usporedni tropizam, kinetika replikacije i profiliranje oštećenja stanica SARS-CoV-2 i SARS-CoV s implikacijama na kliničke manifestacije, prenosivost i laboratorijske studije COVID-a-19: opservacijska studija. Lancetni mikrob. 2020;1(1):e14–e23.

3 Chan JF, Kok KH, Zhu Z, et al. Genomska karakterizacija novog humano-patogenog koronavirusa iz 2019. izoliranog od pacijenta s atipičnom upalom pluća nakon posjeta Wuhanu. Emerg Microbes Infect. 2020;9(1):221–236.

4 Williamson EJ, Walker AJ, Bhaskaran K, et al. Čimbenici povezani sa smrću-19-povezanom s COVID-om koristeći OpenSAFELY. Priroda. 2020;584(7821):430–436.

5 Guh DP, Zhang W, Bansback N, Amarsi Z, Birmingham CL, Anis AH. Učestalost komorbiditeta povezanih s pretilošću i prekomjernom tjelesnom težinom: sustavni pregled i meta-analiza. BMC javno zdravstvo. 2009;9:88.

6 Zhang AJX, Zhu H, Chen Y, et al. Prostaglandinom E2-posredovano oštećenje urođenog imunološkog odgovora na infekciju A(H1N1)pdm09 kod pretilih miševa izazvanih prehranom može se obnoviti paracetamolom. J Infect Dis. 2019;219(5):795–807.

7 Smith AG, Sheridan PA, Harp JB, Beck MA. Pretili miševi izazvani dijetom imaju povećanu smrtnost i izmijenjeni imunološki odgovor kada su zaraženi virusom influence. J Nutr. 2007;137(5):1236-1243.

8 Hulme KD, Noye EC, Short KR, Labzin LI. Disregulirana upala tijekom pretilosti: poticanje ozbiljnosti bolesti kod infekcija virusom influence i SARS-CoV-2. Front Immunol. 2021;12:770066.

9 Sanchis-Gomar F, Lavie CJ, Mehra MR, Henry BM, Lippi G. Pretilost i ishodi kod COVID-a-19: kada se sudare epidemija i pandemija. Mayo Clin Proc. 2020;95(7):1445–1453.

10 Kruglikov IL, Shah M, Scherer PE. Pretilost i dijabetes kao komorbiditeti za COVID-19: temeljni mehanizmi i uloga virusno-bakterijskih interakcija. Elife. 2020;9:e61330.

11 Chen X, Hu W, Ling J, et al. Hipertenzija i dijabetes odgađaju uklanjanje virusa kod pacijenata s COVID{1}}. medRxiv. 2020. https://doi. org/10.1101/2020.03.22.20040774.

12 Nasr MC, Geerling E, Pinto AK. Utjecaj pretilosti na cijepljenje protiv SARS-CoV-2. Front Endocrinol (Lausanne). 2022;13:898810.

13 Viana R, Moyo S, Amoako DG, et al. Brzo širenje epidemije SARS-CoV-2 Omicron varijante u južnoj Africi. Priroda. 2022;603(7902):679-686.

14 Shuai H, Chan JF, Hu B, et al. Oslabljena replikacija i patogenost SARS-CoV-2 B.1.1.529 Omicron. Priroda. 2022;603(7902): 693–699.

15 Hu B, Chan JF, Liu H, et al. Šiljaste mutacije koje doprinose promijenjenoj sklonosti ulaska SARS-CoV-2 Omicron BA.1 i BA.2. Emerg Microbes Infect. 2022; 11: 1–31.

16 Chan JF, Hu B, Chai Y, et al. Virološke značajke i patogenost SARS-CoV-2 Omicron BA.2. Cell Rep Med. 2022;3(9):100743.

17 Yuan S, Ye ZW, Liang R, et al. Patogenost, prenosivost i prikladnost SARS-CoV-2 Omicron u sirijskih hrčaka. Znanost. 2022;377(6604):428-433.

18 Lu L, Mok BW, Chen LL, et al. Neutralizacija varijante SARS-CoV-2 Omicron pomoću seruma primatelja cjepiva BNT162b2 ili Coronavac. Clin Infect Dis. 2022;75(1):e822–e826. https://doi.org/10. 1093/cid/ciab1041.

19 Liu L, Iketani S, Guo Y, et al. Zapanjujuće izbjegavanje antitijela koje se očituje Omicron varijantom SARS-CoV-2. Priroda. 2022;602(7898): 676–681.

20 Iketani S, Liu L, Guo Y, et al. Svojstva izbjegavanja antitijela podloza SARS CoV-2 Omicron. Priroda. 2022;604(7906):553-556.

21 Chen Y, Li C, Liu F, et al. Probojna infekcija SARS-CoV-2 povezana sa starošću i promjene u imunološkom odgovoru na modelu miša. Emerg Microbes Infect. 2022;11(1):368–383.

22 Zhang X, Goncalves R, Mosser DM. Izolacija i karakterizacija mišjih makrofaga. Curr Protoc Immunol. 2008;83(1): 14:14.1.1-14.1.14.

23 Li C, Chen Y, Zhao Y, et al. Intravenska injekcija mRNA cjepiva protiv koronavirusne bolesti 2019 (COVID-19) može izazvati akutni mioperikarditis u mišjem modelu. Clin Infect Dis. 2022;74(11): 1933–1950.

24 Li C, Chen YX, Liu FF, et al. Odsutnost bolesti pojačane cjepivom s neočekivanom pozitivnom zaštitom od teškog akutnog respiratornog sindroma coronavirus 2 (SARS-CoV-2) inaktiviranim cjepivom danim unutar 3 dana nakon izlaganja virusu na modelu sirijskog hrčka. Clin Infect Dis. 2021;73(3):e719–e734.

25 Vogel AB, Kanevsky I, Che Y, et al. BNT162b cjepiva štite rezus makakije od SARS-CoV-2. Priroda. 2021;592(7853):283-289.

26 Lee AC, Zhang AJ, Chan JF, et al. Oralna inokulacija SARS-CoV-2 uspostavlja supkliničku respiratornu infekciju s širenjem virusa kod zlatnih sirijskih hrčaka. Cell Rep Med. 2020;1(7):100121.

27 Meyerholz DK, Beck AP. Načela i pristupi za ponovljivo ocjenjivanje mrlja tkiva u istraživanju. Lab Invest. 2018;98(7): 844–855.

28 Chu H, Shuai H, Hou Y, et al. Usmjeravanje na visoko patogenu apoptozu izazvanu koronavirusom smanjuje virusnu patogenezu i težinu bolesti. Sci Adv. 2021;7(25):eabf8577.

29 Chu H, Hou Y, Yang D, et al. Koronavirusi iskorištavaju cistein asparaginsku proteazu domaćina za replikaciju. Priroda. 2022;609(7928):785–792.

30 Zhang AJ, Li C, To KK, et al. Agonist receptora 7 sličnog Toll-u imikvimod u kombinaciji s cjepivom protiv gripe ubrzava i pojačava humoralni imunološki odgovor protiv infekcije virusom influence A(H1N1)pdm09 u BALB/c miševa. Clin Vaccine Immunol. 2014;21(4):570–579.

31 Li C, To KKW, Zhang AJX, et al. Kostimulacija s TLR7 agonistom imikvimodom i inaktiviranim česticama virusa influence potiče aktivaciju mišjih B stanica, diferencijaciju i ubrzanu proizvodnju antigen-specifičnih antitijela. Front Immunol. 2018;9:2370.

32 Zhou R, To KK, Wong YC, et al. Akutna SARS-CoV-2 infekcija pogoršava odgovore dendritičnih stanica i T-stanica. Imunitet. 2020; 53 (4): 864–877.e5.

33 Chen S, Zhou Y, Chen Y, Gu J. fastp: ultrabrzi sve-u-jednom FASTQ predprocesor. Bioinformatika. 2018;34(17):i884–i890.

34 Edgar R. URMAP, kartograf ultrabrzog čitanja. PeerJ. 2020; 8: e9338.

35 Kim D, Paggi JM, Park C, Bennett C, Salzberg SL. Usklađivanje genoma na temelju grafikona i genotipizacija s HISAT2 i HISAT-genotipom. Nat Biotechnol. 2019;37(8):907–915.

36 Pertea M, Pertea GM, Antonescu CM, Chang TC, Mendell JT, Salzberg SL. StringTie omogućuje poboljšanu rekonstrukciju transkriptoma iz očitavanja RNA-seq. Nat Biotechnol. 2015;33(3):290–295.

37 Love MI, Huber W, Anders S. Moderirana procjena promjene nabora i disperzije za RNA-seq podatke s DESeq2. Genome Biol. 2014;15(12):550.

38 Yu G, Wang LG, Han Y, He QY. clusterProfiler: R paket za usporedbu bioloških tema među klasterima gena. OMICI. 2012;16(5):284–287.

39 Miao YR, Xia M, Luo M, Luo T, Yang M, Guo AY. ImmuCellAI miš: alat za sveobuhvatno predviđanje obilja imunoloških stanica miša i prikaz imunološkog mikrookruženja. Bioinformatika. 2021;38:785.

40 Shuai H, Chan JF, Yuen TT, et al. Nove varijante SARS-CoV-2 proširuju tropizam vrsta na mišje. biomedicina. 2021;73:103643.

41 Gu H, Chen Q, Yang G, et al. Prilagodba SARS-CoV-2 u BALB/c miševa za testiranje učinkovitosti cjepiva. Znanost. 2020;369(6511):1603-1607.

42 Halfmann PJ, Iida S, Iwatsuki-Horimoto K, et al. SARS-CoV-2 Omicron virus uzrokuje oslabljenu bolest kod miševa i hrčaka. Priroda. 2022;603(7902):687-692.

43 Krause PR, Fleming TR, Longini IM, et al. SARS-CoV-2 varijante i cjepiva. N Engl J Med. 2021;385(2):179–186.

44 Corbett KS, Nason MC, Flach B, et al. Imunološki korelati zaštite pomoću mRNA-1273 cjepiva protiv SARS-CoV-2 u neljudskih primata. Znanost. 2021;373(6561):eabj0299.

45 Hamer M, Gale CR, Kivimäki M, Batty GD. Prekomjerna tjelesna težina, pretilost i rizik od hospitalizacije zbog COVID-a-19: kohortna studija u zajednici na odraslim osobama u Ujedinjenom Kraljevstvu. Proc Natl Acad Sci USA. 2020;117(35):21011-21013.

46 Mannar D, Saville JW, Zhu X, et al. Varijanta SARS-CoV-2 Omicron: izbjegavanje protutijela i cryo-EM struktura kompleksa šiljasti protein-ACE2. Znanost. 2022;375(6582):760–764.

47 Zhang Y, Huang K, Wang T, et al. SARS-CoV-2 se brzo prilagođava u starim BALB/c miševima i izaziva tipičnu upalu pluća. J Virol. 2021;95(11):e02477.

48 Huang H, Zhu Y, Niu Z, Zhou L, Sun Q. Varijante SARS-CoV-2 N501Y koje izazivaju zabrinutost i njihov mogući prijenos mišem. Stanična smrt Differ. 2021;28(10):2840–2842.

49 Niu Z, Zhang Z, Gao X, et al. Mutacija N501Y omogućuje prijenos SARS-CoV-2 među vrstama na miševe pojačavanjem vezanja na receptore. Signal Transduct Target Ther. 2021;6(1):284.

50 Chu H, Chan JF, Yuen KY. Životinjski modeli u istraživanju SARS-CoV-2. Nat metode. 2022;19(4):392–394.

51 Briand F, Sencio V, Robil C, et al. Pretilost izazvana prehranom i NASH otežavaju oporavak od bolesti kod zlatnih hrčaka zaraženih SARS-CoV-2-. Virusi. 2022;14(9):2067.

52 Port JR, Adney DR, Schwarz B, et al. Promjene u metabolizmu lipida izazvane prehranom s visokim udjelom masti i visokim udjelom šećera povezane su s blago povećanom težinom bolesti COVID-19 i odgođenim oporavkom kod sirijskog hrčka. Virusi. 2021;13(12):2506.

53 Zhang YN, Zhang ZR, Zhang HQ, et al. Povećani morbiditet pretilih miševa zaraženih SARS-CoV-om prilagođenim miševima-2. Cell Discov. 2021;7(1):74.

54 Akbar AN, Gilroy DW. Imunitet starenja može pogoršati COVID-19. Znanost. 2020;369(6501):256–257.

55 Rebello CJ, Kirwan JP, Greenway FL. Pretilost, najčešći komorbiditet kod SARS-CoV-2: je li leptin poveznica? Int J Obes. 2020;44(9):1810–1817.

56 Mullen M, Gonzalez-Perez RR. Leptinom inducirana JAK/STAT signalizacija i rast raka. Cjepiva (Basel). 2016;4(3):26.

57 Zhu A, Chen Z, Wang Y, et al. Imunološki odgovori na SARS-CoV-2 infekciju kod ljudi i ACE2 humaniziranih miševa. Fundam Res. 2021;1(2):124–130.

58 Achkar JM, Casadevall A. Imunitet protiv tuberkuloze posredovan antitijelima: implikacije za razvoj cjepiva. Mikrob stanica domaćin. 2013;13(3):250–262.

59 Casadevall A, Pirofski LA. Nova sinteza za imunitet posredovan antitijelima. Nat Immunol. 2011;13(1):21–28.

60 Israelow B, Mao T, Klein J, et al. Adaptivne imunološke determinante uklanjanja virusa i zaštite u mišjim modelima SARS-CoV-2. Sci Immunol. 2021;6(64):eabl4509.

61 Smith AG, Sheridan PA, Tseng RJ, Sheridan JF, Beck MA. Selektivno oštećenje funkcije dendritičnih stanica i promijenjeni antigen-specifični odgovori T-stanica CD8+ u pretilih miševa izazvanih prehranom zaraženih virusom influence. Imunologija. 2009;126(2):268–279.

62 Macia L, Delacre M, Abboud G, et al. Oštećenje funkcionalnosti dendritičnih stanica i ravnotežnog broja u pretilih miševa. J Immunol. 2006;177(9):5997–6006.

63 Honce R, Schultz-Cherry S. Utjecaj pretilosti na patogenezu, imunološki odgovor i evoluciju virusa influence A. Front Immunol. 2019;10:1071.

64 Frasca D, Blomberg BB. Pretilost ubrzava dobne nedostatke kod mišjih i ljudskih B stanica. Front Immunol. 2020;11:2060.

65 Kennedy DE, Knight KL. Inhibicija B limfopoeze adipocitima i supresorskim stanicama koje proizvode IL-1-mijeloid. J Immunol. 2015;195(6):2666-2674.

66 Pham TD, Chng MHY, Roskin KM, et al. Prehrana bogata masnoćama izaziva sistemske promjene repertoara B-stanica povezane s inzulinskom rezistencijom. Mucosal Immunol. 2017;10(6):1468–1479.

67 Alu A, Chen L, Lei H, Wei Y, Tian X, Wei X. Intranazalna COVID-19 cjepiva: od klupe do kreveta. EBioMedicine. 2022;76:103841.

68 Tiboni M, Casettari L, Illum L. Nazalno cijepljenje protiv SARS CoV-2: sinergističko ili alternativa intramuskularnim cjepivima? Int J Pharm. 2021;603:120686.

69 Klein SL, Flanagan KL. Spolne razlike u imunološkim odgovorima. Nat Rev Immunol. 2016;16(10):626–638.