Analiza sastava i imunološke aktivnosti oligosaharida izoliranih iz Cistanche Deserticola

Kako poboljšati pamćenje bez lijekova?

Za više informacija obratite seali.ma@wecistanche.com

Ying Bai1, Hai-yan Li1, Shi-xian Chen1 1Koledž prehrambenih znanosti i inženjerstva, Poljoprivredno sveučilište Unutrašnje Mongolije, Hohhot 010018, Kina

Sažetak:Dobiven je oligosaharid (CDOS).Cistanche deserticolalužnatom (pH{{0}}) ekstrakcijom, taloženjem etanolom i frakcioniranom u dvije pročišćene frakcije (tj. CDOS-1 i CDOS-2) Sephadexom G-100 i Sephadex G-25 kolonska filtracijska kromatografija. Sastav monosaharida CDOS-a ispitan je tekućinskom kromatografijom visoke učinkovitosti (HPLC). Utvrđeno je da se CDOS-1 sastoji samo od saharoze, a CDOS-2 se uglavnom sastoji od saharoze, ramnoze i manitola, s molnim omjerom 1:0,73:3,61. Imunološki testovi su pokazali da CDOS ima značajan učinak na indeks mišje slezene, povećavajući aktivnost fagocitoze makrofaga i stimulirajući proliferaciju stanica koje proizvode antitijela. Nadamo se da će se CDOS razviti u funkcionalnu hranu ili lijek.

Ključne riječi:Cistanche deserticola, oligosaharid, pročišćavanje, sastav, imunološke aktivnosti.

Kliknite za proizvode za ekstrakt cistanche

1. Uvod

Cistanche deserticolaYCMa.(ObiteljOrobanchaceae) je niska parazitska biljka porijeklom iz sjeverozapadne Kine. Cijela osušena biljka (bez cvjetova) poznata je kao tonik i zove se "Rou Congrong". U istočnjačkoj medicini klasificira se kao slatko i slano po okusu, toplo po prirodi i pripisuje se kanalima bubrega i debelog crijeva, s funkcijom oživljavanja bubrega i dopune esencije, vlaženja crijeva i opuštanja crijeva [1] -[3]. Suvremena farmakološka studija pokazala je da može potaknuti sintezu DNA i odgoditi proces senilnosti, povećati antioksidativno [4], spriječiti i liječiti kardiovaskularne bolesti [3]. Osim toga, također može izazvati analgetik i anti -upalni učinci [5], pospješuju učenje i pamćenje inducirajući faktore rasta živaca, što su pokazale neke studijeC. deserticola ekstrakti mogu aktivirati fagocitnu funkciju intraabdominalnih makrofaga u miševa [7]-[9] i poboljšati imunitet tijela. Prema prethodnim studijama, ova biljka sadrži više aktivnih sastojaka koji uključuju feniletanoidne glikozide, iridoide, lignane, saharide, alkaloide, itd. [11]C. deserticola feniletanoidni glikozidi i polisaharidi prepoznati su kao glavne aktivne komponente, brojne su studije usredotočene na njihove strukture i bioaktivnost tijekom proteklih desetljeća [12]-[17]. Što se tiče vrijednih oligosaharida uC. deserticola, izvješća su prilično ograničena. Oligosaharidi, kratkolančani saharid koji sadrži homo- ili hetero-šećere, dobro su poznati po svojim blagotvornim učincima na ljudski život i već se dugo koriste u velikoj mjeri [18]. Funkcionalni oligosaharidi, koji imaju fiziološku funkciju kao što je niska karijesnost i faktor rasta bifidobakterija [19], poboljšavaju zdravlje ljudi i životinja. Korišteni su kao sastojak hrane. Nedavno su objavljene nove funkcije oligosaharida koji imaju sposobnost moduliranja imunološkog sustava kod ljudi, životinja i riba [20]. U ovom radu donosimo prvi dio rezultata istraživačkog programa, frakcioniranje ukupnih oligosaharida dobivenih iz lužnatog ekstraktaC. deserticolakombinacijom ultrafiltracije i gel permeacijske kromatografije, te analiza njihovog sastava tekućinskom kromatografijom visoke učinkovitosti (HPLC). Osim toga, također predstavljamo imunološke aktivnostiC. deserticolaoligosaharidi. Koliko znamo, postoji nekoliko objavljenih izvješća o studijama imunostimulirajućeg djelovanjaC. deserticola oligosaharidi.

2. Eksperimentalno

2.1. Materijali

TheC. deserticola je uzgojen i sakupljen iz Alexa lige (unutarnja Mongolija, Kina). Kunming miševi (razred II, stari šest tjedana) kupljeni su od Farmakološkog eksperimentalnog centra Sveučilišta Inner Mongolia. Sephadex G-100, Sephadex G-25, trifluoroctena kiselina (TFA), 1-fenil-3-metil-5- pirazolon (PMP), D-glukoza, D- galaktoza, D-fruktoza, D-ksiloza, D-manoza, D-galakturonska kiselina, D-glukuronska kiselina, saharoza, ramnoza, manitol, fukoza, ramnoza, nabavljeni su od Sigme (St. Louis, MO, SAD). Srednji RPMI-1640 je kupljen od Gibco Invitrogen Co. (San Diego, CA, SAD). Sve ostale kemikalije bile su analitičke čistoće.

2.2. Ekstrakcija oligosaharida

Osušena tijelaC. deserticola izrezani su na manje komade i dalje mljeveni u prah pomoću mlina i ekstrahirani su bezvodnim etanolom (3×5000 ml) na 70 stupnjeva 3 sata pod atmosferskim tlakom. Refluksni kondenzator je fiksiran za uklanjanje lipida. Ostatak koji je ostao ekstrahiran je s alkalijom (pH=10) na 60 stupnjeva 3 puta (2h svaki put). Nakon centrifugiranja (2000 g tijekom 15 minuta, na 20 stupnjeva), supernatant je koncentriran na jednu desetinu volumena u rotacijskom isparivaču pod smanjenim tlakom na 50 stupnjeva i filtriran. Zatim je filtrat deproteiniziran Sevag reagensom [21] i obezbojen aktivnim ugljenom.

2.3. Izolacija i pročišćavanje oligosaharida

Zamrzavanjem osušeni sirovi oligosaharidi otopljeni su u destiliranoj vodi, centrifugirani, a zatim je supernatant pročišćen Sephadex G-100 kolonom (1×50 cm), uravnoteženom s ultra čistom vodom. Nakon punjenja uzorkom, kolona je eluirana ultračistom vodom pri brzini protoka od 5 ml/min. Različite frakcije sakupljene su pomoću epruveta. Ukupni sadržaj ugljikohidrata u svakoj epruveti izmjeren je na 490 nm fenol-H₂TAKO₄metoda [22]. Otopina eluirana vodom je razdvojena u dvije frakcije CDOS-1 i CDOs-2. Dvije frakcije su dodatno pročišćene na koloni Sephadex G-25 (2,7×85 cm) korištenjem ultračiste vode (pri brzini protoka od 1 ml/min). Nakon skupljanja pročišćene frakcije, ona je liofilizirana.

2.4. Analiza monosaharida sastav

Sastav monosaharida CDO je postignut HPLC analizom. CDO (2 mg) su hidrolizirani prvo s bezvodnim metanolom koji sadrži 2 M HCl na 80 stupnjeva tijekom 16 sati u atmosferi dušika, a zatim s 2 M TFA na 120 stupnjeva tijekom 1 sata. Nakon što je TFA uklonjena isparavanjem, hidrolizati su naknadno derivatizirani s PMP-om prema navedenoj metodi [23] i analizirani HPLC-om. HPLC separacija je provedena na EF-2002 HPLC sustavu (poduzeće KNAUER, Njemačka). Derivati ​​PMP kromatografirani su korištenjem Sugar-PAK volumena (6,5 × 300 mm, glasses of water company, America), a apsorbancija je izmjerena na 245 nm. Volumen injekcije bio je 20 µL, a mobilna faza, sastavljena od PBS (otapalo A) i acetonitrila (otapalo B), korištena je za izokratsko eluiranje pri omjeru volumena od 82 posto (A) do 18 posto (B). Ukupno HPLC vrijeme izvođenja bilo je 40 min, a brzina protoka bila je 0,5 mL/min.

2.5. Imunobiološki Aktivnosti

2.5.1. Fagocitna funkcija monocita-makrofaga

Šezdeset Kunming miševa (razred II, stari šest tjedana) kupljeno je od Farmakološkog eksperimentalnog centra Sveučilišta Inner Mongolia i aklimatizirani su tjedan dana prije upotrebe. Svi miševi su nasumično podijeljeni u četiri skupine, koje su se sastojale od kontrolne skupine s fiziološkom otopinom, skupine s visokom dozom CDO, skupine s umjerenom dozom i skupine s niskom dozom CDO. Miševima je intraperitonealno ubrizgano 0.5 mL otopine oligosaharida jednom dnevno tijekom 5 dana. Skupina s visokom, umjerenom ili niskom dozom CDO-a primila je 10{{10}}, 50 ili 25 mg/kg/TM CDO-a; a kontrolnoj skupini ubrizgano je 0,5 ml fiziološke otopine. Sedmog dana proveden je pokus uklanjanja čestica ugljika, prema Hou [24], te su izmjereni indeks slezene i indeks timusa. Ukratko, 0,05 mL/10 g/tjelesne težine indijske tinte ubrizgano je u svakog miša kroz venu caudalis, zatim je 20 μL krvi dobiveno iz vene orbitalis posterior 3 i 7 minuta nakon injekcije. Uzorci krvi stavljeni su u epruvete s 2 mL 0,1 posto Na₂CO₃, a OD vrijednosti su izmjerene na 600 nm. Indeks klirensa (K), fagocitni indeks () i indeks imunoloških organa izračunati su kako slijedi (1), t₂i T₁znači 7 minuta odnosno 3 minute.

2.5.2. Stanica koja proizvodi antitijela proliferacija

Skupine Kunming miševa (pet po skupini) imunizirane su intraperitonealnom injekcijom 2 x 10⁷SRBC u 1.0 ml PBS-a dodanog s 50 ug ispitnog materijala (nijedan u kontroli). Tjedan dana kasnije, splenociti (10⁶stanice po 2 ml po jažici) Kunming miševa uzgajane su sa ili bez testnih materijala 72 h u 10 postotnom mediju RPMI 1640 pod 5 posto CO₂u zraku, u tri primjerka za svaku kulturu. Broj PFC protiv SRBC na 10⁶utvrđeni su splenociti.

2.6. Statistički analiza

Podaci su izraženi kao srednje vrijednosti ±SD. Razlika između ispitivanih skupina i kontrole analizirana je Studentovim t-testom. P < 0.05="" smatra="" se="">

3. Rezultati i Rasprava

3.1. Izolacija i pročišćavanje oligosaharida

CDO su izolirani iz lužnatog ekstrakta osušenih tijelaC. deserticola s prinosom od 3.07 posto . Dvije frakcije CDOS-1 i CDOS-2 izolirane su iz eluata destilirane vode kolonom Sephadex G-100 (slika 1). Pročišćene frakcije CDOS-1 i CDOS-2 pokazale su jedan vrh na stupcu Sephadex G-25, što ukazuje da u uzorku nisu bili prisutni nikakvi drugi oligosaharidi. Rezultati sastava monosaharida pokazali su da se CDOS-1 sastoji samo od saharoze (Slika 2), a CDOS-2 se uglavnom sastoji od saharoze, ramnoze i manitola (Slika 3), s molnim omjerom od 1:0,73:3,61.

3.2. Imunobiološke aktivnosti CDO-a

Mnogi dokazi in vivo i in vitro pokazali su da su prirodni oligosaharidi pokazali imunomodulacijsku funkciju stimulirajući i stanični i humoralni imunološki odgovor [27], [28]. U ovom radu, CDO od 100 mg/kg/tt povećao je indeks mišje slezene, ali nije bilo značajnih razlika u indeksu timusa između tretiranih skupina i kontrolnih skupina (Tablica 1). Makrofagi su važna komponenta obrane domaćina od virusne infekcije inhibicijom unutarstanične replikacije virusa i ubijanjem stanica zaraženih virusom [29]. Kada se aktiviraju, niz kisikovih ili dušikovih intermedijera i citokina otpuštaju se iz makrofaga i sudjeluju u raznim važnim biološkim funkcijama, kao što su protuupalne i antitumorske aktivnosti [30]-[32]. Stoga je fagocitna aktivnost makrofaga važan pokazatelj imunoloških funkcija organizma. U ovoj studiji, umjerene i visoke doze CDO povećavaju aktivnost fagocitoze makrofaga (Tablica 1). Stanična proliferacija koja proizvodi antitijela izazvana CDO proučavana je ispitivanjem porasta hemolitičkog PFC-a u slezeni Kunming miševa koji su bili imunizirani sa SRBC plus testni uzorak. Rezultati su pokazali da umjerene i visoke doze CDO značajno pojačavaju proliferaciju stanica koje proizvode antitijela (Tablica 2). Visoke doze CDO uzrokovale su vrlo značajan porast broja PFC-a (P <>

Reference

[1] J. Li, Y. Jiang, R. Fan. Prepoznavanje mješovitog biološkog signala na temelju Wavelet analize. U: Y. Jiang, et al (ur.).Proc. UK-China Sports Engineering Workshop. Liverpool: Svjetska akademska unija. 2007., str. 1-8.

[2] J. Ouyang, XD Wang, B. Zhao, et al. Učinci elemenata rijetkih zemalja na rastCistanche deserticolastanica i stvaranje feniletanoidnih glikozida.JB io-technol, 2003, 102 (2) : 129-134

[3] Xu Zhaohui, Yang Junshan, Lu Ruimian, et al. Novi prirodni proizvod izCistanche deserticolaYCMA. Časopis kineskih farmaceutskih znanosti,1999, 8(2):61-63.

[4] X. Wang, L. Li, Muhuyati, X. Wanag, N. Du. Antioksidativno djelovanje glikozidaCistancheu tkivu miševa.Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 1998, 23(9):554-5.

[5] Lin LW, Hsieh MT, Tsai FH, Wang WH, Wu CRA Antinocicepcijska i protuupalna aktivnost uzrokovanaCistanche deserticolakod glodavaca.J Ethnopharmacol. 2002, 83(3):177-82.

[6] Choi, JG; Mjesec, M; Jeong, HU; Kim, MC; Kim, SY; Oh, MSCistanches Herbapoboljšava učenje i pamćenje inducirajući faktor rasta živaca.Bihevioralno istraživanje mozga. 2011, 216 (2): 652–8.

[7] Zong G, He W, Wu G, Chen M, Shen X, Shi M. Usporedba izmeđuCistanche deserticolaYC Ma i C,tubuloza(Shenk) Wight o nekim farmakološkim djelovanjima.Zhongguo Zhong Yao Za Zhi.1996, 21(7):436-7.

[8] He W, Shu XF, Zeng GZ, et al. Studija o povećanju seksualne potencijeC. deserticola. J Chin Med.1996, 21(9): 534- 537.

[9] Zeng GZ, He W, Wu GL, et al. Usporedbe izmeđuCistanche deserticolaYC Ma i C.tubulosa utječu na neka farmakološka djelovanja.J Chin Med. 1996, 21(7): 436-438.

[10] Zeng QL, Zheng YF, Lu ZL Imunomodulacijski učinci polisaharidaCistanche deserticolaYC Ma.J Zhejiang Univ, Med Sci.2002, 31(4): 284- 287.

[11] Li Yuan, Song Yuanyuan, Zhang Hongquan. Napredak u istraživanju kemijskih sastojaka i ljekovitog djelovanja Cistanche.Kineski divlji biljni resursi, 2010, 29(1):7-11.

[12] Du NS, Wang H, Yi YH. Izolacija i identifikacija feniletanoidnih glikozida izCistanche deserticola.

Nat Prod istraživanje i razvoj, 1993, 5(4): 5- 8.

[13] Lu NS, Liu JL Određivanje feniletanoidnih glikozida uCistanche deserticolaspektrofotometrijom makrovezikularne smole.Nat Prod istraživanje i razvoj, 1993, 5(3): 30-33.

[14] Xiong QB, Tezuka Y, Kaneko T, et al. Inhibicija dušikovog oksida feniletanoidima u aktiviranim makrofagima.

European Journal of Pharmacology, 2000, 400: 137- 144.

[15] Zhao Wei, Yan Hong, Liang Zhong-Yan, et al. Strukturna analiza polisaharida topljivog u vodi SPA izoliranog iz stabljike Cistanche Deserticola Ma.Kemijski časopis kineskih sveučilišta, 2005, 26(3):461-463.

[16] Wang Xiangyan. Studija imunološke farmakologije i apsorpcijskog karaktera polisaharidaCistanche deserticola. 2011, br.S1,Medicina i zdravstvene znanosti, E057-235-1-70.

[17] Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Tani T, Namba T, Kadota S. Hepatoprotektivna aktivnost feniletanoida izCistanche deserticola. Planta Med. 1998, 64(2):120-5.

[18] Handbook of Amylases and Related Enzymes (ed. Japansko istraživačko društvo za amilaze), Pergamon Press (1988.)

[19] Araya, S. (ur.) Proceedings of the 5^thKonferencija o zubnom karijesu i spojnom šećeru (na japanskom), Nacionalni institut za zdravlje, Tokio (1980.)

[20] Kodo Otaka. Funkcionalni oligosaharid i njegov novi aspekt kao imunološka modulacija.J. Biol. Makromol. 2006, 6

(1), 3-9.

[21] Navarini L, Gilli R, Gombac V, Abatangelo A, Bosco M, Toffanin R. Polisaharidi iz vruće vodenih ekstrakata prženih zrna kave arabice: Izolacija i karakterizacija. ugljikohidrat.Polym.1999, 40:71–81.

[22] Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. Kolorimetrijska metoda za određivanje šećera i srodnih tvari.analno Chem. 1956, 28:350–356.

[23] Yang X, Zhao Y, Wang Q, Wang H, Mei Q. Analiza monosaharidnih komponenti u polisaharidima anđelike pomoću tekućinske kromatografije visoke učinkovitosti.Anal Sci. 2005, 21:1177–1180.

[24] Yufang Hou, Yubao Hou, Liu Yanyan, et al. Ekstrakcija i pročišćavanje lektina iz crvenog graha i preliminarne studije imunološke funkcije lektina i četiri kineska biljna polisaharida.Časopis za biomedicinu i biotehnologiju, 2010:1-9.

[25] Cunningham, AJ i A. Szenberg. Daljnja poboljšanja tehnike plakova za otkrivanje pojedinačnih stanica koje stvaraju protutijela.Imunologija.1968, 14:599-600.

[26] Haruhiko Takada, Tomohiko Ogawa, Fuminobu Yoshimura, et al. Imunobiološke aktivnosti frakcije porina izolirane iz Fusobacterium nucleatum ATCC 10953 [J]. Infekcija i imunitet. 1988, 56(4): 855-863.

[27] Wang MQ, Guilbert LJ, Ling L, Li J, Wu YQ, Xu SR, Pang P, Shan JJ Imunomodulacijska aktivnost CVT-E002: zaštićeni ekstrakt sjevernoameričkog ginsenga (Panax quinque folium).J Pharm Pharmacol.2001, 53:1515–1523.

[28] Nergard CS, Kiyohara H, Reynolds JC, Thomas-Oates JE, Matsumoto T, Yamada H, Patel T, Petersen D, Michaelsen TE, Diallo D, Paulsen BS Strukture i odnosi struktura-aktivnost triju mitogenih i fiksirajućih komplementa pektinske arabinogalaktane iz malijskih biljaka protiv čiraCochlospermum tinctoriumA. Bogati iVernonia kotschyanaSch Bip. bivši Walp.Biomakromolekule. 2006, 7:71–79.

[29] E.-M. Choi, A.-J. Kim, Y.-O. Kim i J.-K. Hwang, Imunomodulacijska aktivnost arabinogalaktana i fukoidana in vitro.Časopis za ljekovitu hranu. 2005, 8(4):446–453.

[30] Y. Chen, J.-A. Duan, D. Qian, et al. Procjena i usporedba imunoregulacijske aktivnosti četiri hidrosolubilne frakcije Angelice Sinensis in vitro na peritonealnim makrofagima u ICR miševa.Međunarodna imunofarmakologija. 2010, 10:422–430.

[31] YS Lee, OK Han, CW Park, et al. Ekspresija gena za upalne citokine i regulacija dušikovog oksida vodeno ekstrahiranog Astragali radixa u stanicama makrofaga RAW 264.7.Časopis za etnofarmakologiju. 2005, 100(3): 289–294.

[32] KY Lee i YJ Jeon. Polisaharid izoliran iz sklerocija Poria cocos inducira NF-κB/Rel aktivaciju i ekspresiju iNOS u mišjim makrofagima.Međunarodna imunofarmakologija. 2003, 3(10-11):1353–1362.