Kloniranje, funkcionalna identifikacija i analiza ekspresije kalkon sintaze iz Cistanche Tubulosa

Sažetak: Cilj

Za proučavanje funkcijekalkon sintaza iz Cistanche tubulosai uzorak ekspresije gena CtCHS u bijelim, crvenim i ljubičastim cvjetovima.

MetodeGen CtCHS kloniran je RT-PCR i provedena je bioinformatička analiza. Plazmid pET-28a-CtCHS prebačen je u Escherichia coli da inducira ekspresiju proteina pomoću IPTG. CtCHS rekombinantni protein je inkubiran sa supstratima p-kumaroil CoA i malonil CoA, a produkti su detektirani pomoću HPLC i MS. Plazmid pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS prenesen je u protoplast Arabidopsis thaliana da se promatra subcelularna lokalizacija proteina CtCHS. Uzorak ekspresije CtCHS gena u cvjetovima C. tubulosa s tri boje detektiran je qRT-PCR-om.

RezultatiCtCHS gen je kloniran. Duljina otvorenog okvira za čitanje (ORF) bila je 1173 bp, kodirajući 390 aminokiselina, a molekularna težina proteina bila je 42 8000.

ORGANSKI EKSTRAKT CISTANCHE SA 30% EHINAKOZIDA I 12% AKTEOZIDA

CtCHS je sadržavao katalitičke ostatke Cys164, His303, Asn336, koji su bili konzervirani u kalkon sintazi. CtCHS protein je eksprimiran u E. coli i pročišćen da se dobije rekombinantni protein. Protein CtCHS mogao bi katalizirati p-kumaroil CoA i malonil CoA za proizvodnju naringenin kalkona. CtCHS protein je uglavnom lokaliziran u citoplazmi. Gen CtCHS bio je visoko eksprimiran u ljubičastom i crvenom cvijeću, a relativna razina ekspresije bila je 8,44 odnosno 3,21 puta veća od one u bijelim cvjetovima.

Zaključak CtCHS gen je kloniran iz cvijeta C. tubulosa i protein je eksprimiran. Protein CtCHS ima funkciju kalkon sintaze, a ekspresija gena CtCHS veća je u tamnijim cvjetovima, što ukazuje da gen CtCHS može regulirati boju cvijeta C. tubulosa, što postavlja temelj za daljnja istraživanja mehanizma regulacije boje cvijeta C. tubuloza.

Ključne riječi: Cistanche tubulosa (Schenk) Wight; kalkon sintaza; analiza aktivnosti enzima; subcelularna lokalizacija; analiza izraza

Cistanche Tubulosa(SCHENK) WIGHT je biljka roda Pyreal, koja je prirodno rasprostranjena u južnom Xinjiangu [1] u području Hetian u Xinjiangu [2]. Cvjetovi lule imaju visoku ljekovitu vrijednost. Njegove mesne stabljike jedan su od izvora verzije " 2020.Kineska farmakopeja". [3] Istraživanja o cvjetovima lule cordonus meat stabljikama su se povećala, ali ima relativno malo bioloških istraživanja o cvjetovima. Razdoblje cvatnje cvjetova lule je od travnja do svibnja [4], uglavnom Postoje tri boje bijele boje. , crveni i ljubičasti cvjetovi su bogati bojama, ali njihov mehanizam regulacije boje cvijeta nije povezan s vrstom, sadržajem, sadržajem i distribucijom strukture tkiva latica i regulacije čimbenika okoline i genetski faktori [5].Pigment u biljnom cvijeću uglavnom uključuje tri kategorije: flavonoide, karoten i boju, najširi raspon boja [7]. kao tri varijante Paeonia Lactiflora Pall.

Čini se kao bijela, a glavna boja boje sadrži crvenu boju i lijepa kompetencija čini cvjetove prisutne kao ljubičasto-crvene [8]. Boja cvijeća važna je značajka mnogih ukrasnih biljaka, a ujedno je i ključni faktor koji privlači ružičaste kukce [9]. Studije su pokazale da se prenosi. Najveća učestalost posjeta kukaca je tamnoljubičasta biljka cistanča [10]. Za biološka istraživanja o sintetskim genetskim istraživanjima cistanoida u cvjetovima cjevastog cvjetova cistanosaurusa, to je pogodno za razjašnjenje mehanizma kontrole boje kordona cvjetnog cvijeća, pružanje teorijske osnove za poboljšanje tehnologije genetskog inženjeringa boje, promicanje njezinih bogatijih boja, povećanje gledanosti, proširenje opsega primjene.

Biosintetski put odflavonoidipočinje sfenilpropanoidni put. Fenilalanin se najprije pretvara u cimetnu kiselinu pod djelovanjem fenilalanin amonijalize (PAL), a cimetna kiselina se 4-hidroksilira cimetnom kiselinom. Enzim (-4-hidroksilaza cimetne kiseline, C4H) i 4-kumarat koenzim A ligaza (4-kumarat koenzim A ligaza, 4CL) kataliziraju reakciju za stvaranje 4-kumaroil-CoA [11]. Jednu molekulu 4-kumaroil-CoA i tri molekule malonil-CoA katalizira kalkon sintaza (CHS) kako bi se stvorio naringenin kalkon, koji imaflavonoidni spojevi.Osnovni kostur kalkon izomeraze, flavanon-3-hidroksilaze, dihidroflavonol 4-reduktaze itd. stvara niz flavonoida kao što su izoflavoni, flavonoli, antocijanini itd. [12]. Kao ključni enzim u biosintetskom putu flavonoida, CHS regulira sadržaj flavonoida u biljkama, a također igra važnu ulogu u regulaciji boje cvjetova biljaka [13]. Na primjer, posttranskripcijsko utišavanje gena Gentiana scabra Bunge CHS može inhibirati biosintezu antocijana i uzrokovati specifično izbjeljivanje režnjeva vjenčića [14]. Utišavanje CHS gena Actinidia eriantha Benth. CHS smanjuje sadržaj antocijana u laticama i uzrokuje da crvena boja latica postaje svjetlija [15]. Stoga je u ovoj studiji CtCHS gen kloniran iz cvjetova Cistanche deserticola, a bioinformatička analiza, ekspresija i pročišćavanje prokariota, analiza aktivnosti enzima, analiza subcelularne lokalizacije i analiza ekspresije u tri boje cvjetova provedena je na njemu kako bi se istražila funkcija CtCHS protein i uzorak ekspresije gena CtCHS korišteni su za preliminarno istraživanje odnosa između CtCHS i boje cvijeta Cistanche deserticola, čime su postavljeni temelji za proučavanje regulatornog mehanizma boje cvijeta Cistanche deserticola.

1 Materijali i instrumenti

1.1 Materijali

Cvjetovi Cistanche tuberosa prikupljeni su iz okruga Yutian, prefektura Hotan, Xinjiang u svibnju 2018. Tijekom uzorkovanja slijedilo se načelo slučajnog odabira, a odabrani su cvjetovi Cistanche tuberosa s dobrim fiziološkim statusom i dosljednom visinom biljke. Profesor Tu Pengfei s Farmaceutskog fakulteta Sveučilišta u Pekingu uzeo je tri vrste Cistanche deserticola s tri boje cvijeta bijele, crvene i ljubičaste i identificirao ih kao Cistanche tubulosa (Schenk) Wight. Brzo su zamrznuti u tekućem dušiku, pohranjeni na suhom ledu i prevezeni u Peking. E. coli DH5 kemijski kompetentne stanice kupljene su od Nanjing Novezan Biotechnology Co., Ltd., a E. coli BL21 (DE3) kemijski kompetentne stanice kupljene su od Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.; pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP Vektor je kupljen od Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd. Malonyl-CoA je kupljen od Sigma Company, 4-coumaroyl-CoA, naringenin -kalkon je kupljen od Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., a naringenin je kupljen od Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.

1.2 Instrumenti

Nanodrop 2000C spektrofotometar (Thermo Fisher Company, SAD); gradijent PCR instrument (Eppendorf Company, Njemačka); CFX 96 fluorescentni kvantitativni PCR instrument, UVP gel imager, instrument za gel elektroforezu, instrument za elektroforezu proteina (BioRad Company, SAD) ;EnSpire

Čitač mikropločica (PerkinElmer Company, SAD); inkubator konstantne temperature (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.); DHZ-D oscilator pune temperature velikog kapaciteta (Taicang Experimental Equipment Factory); THZ-82Oscilator konstantne temperature vodene kupke (Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.); AIRTECH ultra-clean radni stol (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.); visokotlačni parni sterilizator (TOMY Company, Japan); Milli Q instrument za čistu vodu (Millipore, Sjedinjene Države); LC-20Hromatograf tekuće faze visoke učinkovitosti (Shimadzu Company, Japan); UPLC-Q-Exactive-Orbitrap masena spektrometrija visoke rezolucije (Thermo Fisher Company, SAD); FV1200 laserski konfokalni mikroskop (Olympus Company, Japan).

2 Eksperimentalne metode

2.1 Ekstrakcija RNA i sinteza cDNA. Cvjetovi Cistanche deserticola samljeveni su u tekućem dušiku i potom podvrgnuti testu ekstrakcije RNK.

Ukupna RNA ekstrahirana je pomoću kompleta (Norgen, Cat 17200), koncentracija i kvaliteta RNA detektirani su NanoDrop 2000C, a uzorci RNA s omjerom A260/A280 između 1,8 i 2,1 odabrani su za sintezu cDNA reverznom transkripcijom. M-MLV reverzna transkriptaza (Promega, M170B) korištena je za reverznu transkripciju kvalificirane ukupne RNA u cDNA. Eksperimentalni radovi su izvedeni prema uputama.

2.2 Kloniranje CtCHS gena

Na temelju podataka o transkriptomu cvijeta Cistanche deserticola naše istraživačke grupe [16], CtCHS s potpunim otvorenim okvirom za čitanje je odabran, a softver SnapGene korišten je za dizajniranje specifičnih početnica na temelju sekvence gena (Tablica 1). PCR amplifikacija je izvedena korištenjem cDNA cvijeta Cistanche deserticola kao uzorka. Sustav pojačanja bio je 2×Phanta Max pufer 25 μL, dNTP Mix (10 mmol/L) 1 μL, uzvodni i nizvodni primeri (10 μmol/L) 2 μL svaki, cDNA 2 μL, Phanta Max Super-Fidelity

DNA polimeraza 1 μL, ddH2O 17 μL. Uvjeti reakcije su bili: pred-denaturacija na 95 stupnjeva tijekom 3 minute; 25 ciklusa denaturacije na 95 stupnjeva tijekom 15 s, žarenja na 55 stupnjeva tijekom 15 s i produženja na 72 stupnja tijekom 1 minute; i produljenje reakcije na 72 stupnja tijekom 5 min. Produkt PCR detektiran je elektroforezom na 1% agaroznom gelu, a kit za pročišćavanje DNA (Novizan, Cat DC301-01) korišten je za izdvajanje gela, a zatim je obnovljena DNA pročišćena kitom za brzo kloniranje (Novizan, Cat C601-01). Fragment DNA je povezan s vektorom pCE2 TA/Blunt-Zero, transformiran u kompetentne stanice Escherichia coli DH5, i nakon uzgoja preko noći na 37 stupnjeva , pojedinačni sojevi klona su odabrani i poslani u tvrtku na sekvencioniranje.

Tablica 1 Primer sekvence

2.3 Bioinformatička analiza

Koristite ProtParam online softver za analizu fizikalnih i kemijskih svojstava proteina; koristiti Prot Scale online alat za analizu hidrofilnosti/hidrofobnosti proteina; koristiti online alat SOPMA za predviđanje sekundarne strukture proteina; koristiti softver za online analizu SWISS-MODEL za predviđanje tercijarne strukture proteina; koristiti online softver TMHMM Predvidjeti transmembransku strukturu proteina; koristiti softver DNAMAN za usporedbu homologije CtCHS s CHS aminokiselinskim sekvencama drugih vrsta; koristiti MEGA-X softver za konstruiranje filogenetskog stabla, korištenjem susjednog spajanja (NJ) i Poissonove korekcije. Evolucijska udaljenost izračunava se metodom Bootstrap, a broj ponavljanja Bootstrapa je 1000 puta.

Za daljnju detekciju korišten je UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS. Uvjeti tekuće faze bili su kolona Waters Acquity UPLC BEH Sheild RP18 (100 mm × 3.0 mm, 1,7 μm), temperatura kolone 40 stupnjeva, naringenin , kalkon i naringenin. Volumen punjenja kontrolne tvari je 4 μL, a volumen punjenja produkta enzimske reakcije je 7 μL. Kao mobilna faza koristi se voda (A)-acetonitril (B). Gradijent eluiranja je: 0 do 5 min, 30% B; 5 do 15 min. , 30%~60% B; 15~20 min, 60%~100% B; 20~25 min, 100% B; 25~31 min, 100%~30% B. Volumetrijski protok je 0,3 mL/min. Uvjeti masene spektrometrije su izvor elektroraspršenih iona, dušik kao plin nosač, tlak plinskog omotača 3,5 MPa, tlak pomoćnog plina 1,0 MPa, tlak raspršivanja 3500 V, temperatura kapilare 350 stupnjeva, temperatura zagrijavanja pomoćnog plina 200 stupnjeva, pozitivni i negativni ionski načini rada, skeniranje raspon iona m/z je 100-1500, puna MS rezolucija je 35 000, dd-MS2 rezolucija je 17 500, (N)

CE/stepped nce postavljen na 35, 60.

2.6 Subcelularna lokalizacija CtCHS proteina

Na temelju CtCHS sekvence i principa besprijekornog kloniranja, dizajnirani su primeri s mjestima za rezanje enzima Kpn Ⅰ i BamH Ⅰ, a odgovarajući ciljani fragmenti umnoženi su PCR-om. Plazmid pCAMBIA1300-35S-GFP razgrađen je restrikcijskim endonukleazama Kpn Ⅰ i BamH Ⅰ, a ciljni fragment i vektor povezani su pomoću kompleta za besprijekorno kloniranje (Novizan, Cat C115-01), a zatim prebačeni u kompetentne stanice E. coli DH5. , odaberite pojedinačne klonirane sojeve za sekvenciranje i ekstrahirajte plazmide iz točnih sojeva. Plazmidi pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS i pCAMBIA 1300-35S-GFP transformirani su u protoplaste Arabidopsis thaliana pomoću PEG4000 i uzgajani pod slabim svjetlom 8 do 10 h. Podstanična lokalizacija CtCHS proteina promatrana je pod laserskim konfokalnim mikroskopom.

2.7 Analiza obrasca ekspresije CtCHS

Na temelju CtCHS sekvence, DNAMAN je korišten za dizajniranje kvantitativnih primera fluorescencije u stvarnom vremenu, s F-boxom kao internim referentnim genom. Slijedovi početnica prikazani su u tablici 1. Relativna ekspresija CtCHS u cvjetovima Cistanche deserticola različitih boja detektirana je kvantitativnom PCR fluorescencije u stvarnom vremenu. Upotrijebite TransStart Green qPCR SuperMix (puno zlato, AQ101-02) za mjerenje metodom fluorescentne boje SYBR Green, reakcijski sustav: 2×TransStart Green qPCR SuperMix 5 μL, uzvodni i nizvodni primeri (10

μmol/L) {{0}}.2 μL svaki, cDNA predložak 0,5 μL, voda bez nukleotidaze 4,1 μL, za reakciju je korištena metoda u dva koraka, a postupak reakcije temeljio se na metodi Dong Xianjuana i sur. [18]. Svaki uzorak sadržavao je 3 biološka ponavljanja, a eksperiment je ponovljen tri puta. Eksperimentalni podaci analizirani su pomoću programa Excel do 2

Relativni izraz CtCHS izračunat je metodom −ΔΔCt, a GraphPad Prism 8 korišten je za analizu značajnosti i crtanje histograma.