Kloniranje, funkcionalna identifikacija i analiza ekspresije kalkon sintaze iz Cistanche Tubulosa
Mar 25, 2024
Sažetak: Cilj Proučiti funkciju kalkon sintaze iz Guanhuaroucongronga (Cistanche tubulosa) i uzorak ekspresije gena CtCHS u bijelim, crvenim i ljubičastim cvjetovima.
Metode Gen CtCHS kloniran je RT-PCR i provedena je bioinformatička analiza. Plazmid pET-28a-CtCHS prenesen je u Escherichia coli da inducira ekspresiju proteina pomoću IPTG. CtCHS rekombinantni protein je inkubiran sa supstratima p-kumaroil CoA i malonil CoA, a produkti su detektirani pomoću HPLC i MS. Plazmid pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS prenesen je u protoplast Arabidopsis thaliana da se promatra subcelularna lokalizacija proteina CtCHS. Obrazac ekspresije gena CtCHS u cvjetovimaC. tubulosas tri boje otkrivena je qRT-PCR-om.
Rezultati Kloniran je CtCHS gen. Duljina otvorenog okvira za čitanje (ORF) bila je 1173 bp, kodirajući 390 aminokiselina, a molekularna težina proteina bila je 42 8000. CtCHS je sadržavao katalitičke ostatke Cys164, His303, Asn336, koji su bili konzervirani u kalkon sintazi. CtCHSprotein je eksprimiran u E. coli i pročišćen da se dobije rekombinantni protein. Protein CtCHS mogao bi katalizirati p-kumaroil CoA i malonil CoA za proizvodnju naringenin kalkona. CtCHS protein je uglavnom lokaliziran u citoplazmi. Gen CtCHS bio je visoko eksprimiran u ljubičastom i crvenom cvijeću, a relativna razina ekspresije bila je 8,44 odnosno 3,21 puta veća od one u bjelocvijeću.
Zaključak CtCHS gen je kloniran iz cvijetaC. tubulosaa protein je izražen. Protein CtCHS ima funkciju kalkon sintaze, a ekspresija gena CtCHS veća je u tamnijim cvjetovima, što ukazuje da gen CtCHS može regulirati boju cvijeta C. tubulosa, što postavlja temelje za daljnja istraživanja omehanizam regulacije boje cvijeta C. tubulosa.
Ključne riječi:Cistanche tubulosa (Schenk) Wight; kalkon sintaza; analiza aktivnosti enzima; subcelularna lokalizacija; ekspresiona analiza
KLIKNITE OVDJE DA DOBIJETE PRIRODNI ORGANSKI EKSTRAKT CISTANCHE SA 30% EHINAKOZIDA I 12% AKTEOZIDA
Usluga podrške Wecistanche-najvećeg izvoznika cistanche u Kini:
E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/telefon:+86 15292862950
Kupite za više pojedinosti o specifikacijama:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
Biosintetikaput flavonoidapočinje fenilpropanoidnim putem.Fenilalaninnajprije se pretvara u cimetnu kiselinu poddjelovanje fenilalanin amonijalize(PAL), a cimetna kiselina je 4-hidroksilirana pomoću cimetne kiseline. Enzim (-4-hidroksilaza cimetne kiseline, C4H) i 4-kumaratkoenzim A ligaza (4-kumaratkoenzim A ligaza, 4CL) kataliziraju reakciju za stvaranje 4-kumaroil-CoA [11 ]. Jednu molekulu 4-kumaroil-CoA i tri molekule malonil-CoA katalizira kalkon sintaza (CHS) kako bi se stvorio naringenin kalkon, koji ima flavonoidne spojeve. Osnovni kostur kalkon izomeraze, flavanon-3-hidroksilaze, dihidroflavonol 4-reduktaza itd. stvara niz flavonoida kao što su izoflavoni, flavonoli, antocijanini itd. [12]. Kao ključni enzim u biosintetskom putu flavonoida, CHS regulira sadržaj flavonoida u biljkama, a također igra važnu ulogu u regulaciji boje cvjetova biljaka [13]. Na primjer, posttranskripcijsko utišavanje gena Gentiana scabra Bunge CHS može inhibirati biosintezu antocijana i uzrokovati specifično izbjeljivanje režnjeva vjenčića [14]. Utišavanje CHS gena Actinidia erianthaBenth. CHS smanjuje sadržaj antocijana u laticama i čini latice crvenilima. Latice postaju svjetlije u boji[15]. Stoga je u ovoj studiji CtCHS gen kloniran iz cvjetova Cistanche tubulosa, a bioinformatička analiza, ekspresija i pročišćavanje prokariota, analiza aktivnosti enzima, analiza subcelularne lokalizacije i analiza ekspresije u tri boje cvjetova provedena je na njemu kako bi se istražila funkcija CtCHS protein i obrazac ekspresije gena CtCHS korišteni su za preliminarno istraživanje odnosa između CtCHS i boje cvijeta Cistanche tubulosa, čime su postavljeni temelji za proučavanje regulatornog mehanizmaBoja cvijeta Cistanche tubulosa.
1 Materijali i instrumenti
1.1 Materijali
Cvjetovi Cistanche tubulosa prikupljeni su iz okruga Yutian, prefektura Hotan, Xinjiang u svibnju 2018. Tijekom uzorkovanja slijedilo se načelo slučajnog odabira, a odabrani su cvjetovi Cistanche tubulosa s dobrim fiziološkim statusom i dosljednom visinom biljke. Profesor Tu Pengfei s Farmaceutskog fakulteta Sveučilišta u Pekingu uzeo je tri soja Cistanche tubulosa s tri boje cvijeta bijele, crvene i ljubičaste i identificirao ih kao Cistanche tubulosa (Schenk) Wight. Brzo su zamrznuti u tekućem dušiku i zatim prevezeni u Peking u skladištu suhog leda. E. coli DH5 kemijski kompetentne stanice kupljene su od Nanjing Novezan Biotechnology Co., Ltd., a E. coli BL21 (DE3) kemijski kompetentne stanice kupljene su od Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.; pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP Vektor je kupljen od Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd. Malonyl-CoA je kupljen od Sigma Company, 4-coumaroyl-CoA, naringenin -kalkon je kupljen od Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., a naringenin je kupljen od Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.
1.2 Instrumenti
Nanodrop 2000C spektrofotometar (Thermo Fisher Company, SAD); gradijent PCR instrument (Eppendorf Company, Njemačka); CFX 96 fluorescentni kvantitativni PCR instrument, UVP gel imager, instrument za gel elektroforezu, instrument za elektroforezu proteina (BioRad Company, SAD) ;EnSpire
Čitač mikropločica (PerkinElmer Company, SAD); inkubator konstantne temperature (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.); DHZ-D oscilator pune temperature velikog kapaciteta (Taicang Experimental Equipment Factory); THZ-82Oscilator konstantne temperature vodene kupke (Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.); AIRTECH ultra-clean radni stol (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.); visokotlačni parni sterilizator (TOMY Company, Japan); Milli Q instrument za čistu vodu (Millipore, Sjedinjene Države); LC-20Hromatograf tekuće faze visoke učinkovitosti (Shimadzu Company, Japan); UPLC-Q-Exactive-Orbitrap masena spektrometrija visoke rezolucije (Thermo Fisher Company, SAD); FV1200 laserski konfokalni mikroskop (Olympus Company, Japan).
2 Eksperimentalne metode
2.1 Ekstrakcija RNA i sinteza cDNA.
Cvjetovi Cistanche tubulosa samljeveni su u tekućem dušiku i potom podvrgnuti testu ekstrakcije RNK.
Ukupna RNA ekstrahirana je pomoću kompleta (Norgen, Cat 17200), koncentracija i kvaliteta RNA detektirani su NanoDrop 2000C, a uzorci RNA s omjerom A260/A280 između 1,8 i 2,1 odabrani su za reverznu transkripciju za sintetiziranje cDNA. M-MLV reverzna transkriptaza (Promega, M170B) korištena je za reverznu transkripciju kvalificirane ukupne RNA u cDNA. Eksperimentalni radovi su izvedeni prema uputama.
2.2 Kloniranje CtCHS gena
Na temelju podataka o transkriptomu cvijeta Cistanche tubulosa naše istraživačke grupe [16], CtCHS s potpunim otvorenim okvirom za čitanje je odabran, a softver SnapGene korišten je za dizajniranje specifičnih početnica na temelju sekvence gena (Tablica 1). PCR amplifikacija je izvedena korištenjem cDNA cvijeta Cistanche tubulosa kao uzorka. Sustav pojačanja bio je 2×Phanta Max pufer 25 μL, dNTPMix (10 mmol/L) 1 μL, uzvodni i nizvodni primeri (10 μmol/L) po 2 μL, cDNA 2 μL, Phanta Max Super-Fidelity DNA polimeraza 1 μL, ddH2O 17 μL. Uvjeti reakcije su bili: preddenaturacija na 95 stupnjeva tijekom 3 minute; 25 ciklusa denaturacije na 95 stupnjeva tijekom 15 s, žarenja na 55 stupnjeva tijekom 15 s i produženja na 72 stupnja tijekom 1 minute; produljenje reakcije na 72 stupnja tijekom 5 min. Produkt PCR detektiran je elektroforezom na 1% agaroznom gelu, a pribor za pročišćavanje DNA (Novizan, Cat DC301-01) korišten je za izdvajanje gela, a zatim je obnovljena DNA pročišćena priborom za brzo kloniranje (Novizan, Cat C601-01). Fragment DNA je povezan s pCE2TA/Blunt-Zero vektorom, transformiran u kompetentne stanice Escherichia coli DH5, i nakon uzgoja preko noći na 37 stupnjeva , pojedinačni sojevi klona su odabrani i poslani u tvrtku na sekvenciranje.
Tablica 1 Primer sekvence
2.3 Bioinformatička analiza
Koristite ProtParam online softver za analizu fizikalnih i kemijskih svojstava proteina; koristiti Prot Scale online alat za analizu hidrofilnosti/hidrofobnosti proteina; koristiti online alat SOPMA za predviđanje sekundarne strukture proteina; koristiti softver za online analizu SWISS-MODEL za predviđanje tercijarne strukture proteina; koristiti online softver TMHMM Predvidjeti transmembransku strukturu proteina; koristiti softver DNAMAN za usporedbu homologije CtCHS s CHS aminokiselinskim sekvencama drugih vrsta; koristiti MEGA-X softver za konstruiranje filogenetskog stabla, korištenjem susjednog spajanja (NJ) i Poissonove korekcije. Evolucijska udaljenost izračunava se metodom Bootstrap, a broj ponavljanja Bootstrapa je 1000 puta.
2.4 CtCHS prokariotska ekspresija i pročišćavanje
Dizajnirajte početnice s restrikcijskim mjestima BamHⅠ i XhoⅠ na temelju CtCHS sekvence, a PCR pojačava odgovarajuće ciljane fragmente. Vektor pET-28a i ciljni fragment digestirani su pomoću endonukleaza BamHI i Klonirani soj je sekvenciran, a plazmid je ekstrahiran nakon ispravnog sekvenciranja. Plazmid pET-28a-CtCHS verificiran sekvenciranjem prenesen je u kompetentne stanice Escherichia coli BL21 (DE3). Pogledajte metodu Ding Ning i sur. [17] s izopropilom
-D-tiogalaktopiranozid (IPTG) korišten je za induciranje ekspresije proteina na niskoj temperaturi i pročišćen je kroz Ni2+ afinitetnu kromatografsku kolonu (Cytiva, Cat 17531901). Protein je koncentriran centrifugiranjem u ultrafiltracijskoj epruveti (Millipore, 30 000) i odsoljen. Čuvati u 20 mmol/L KPB puferu (pH 8,0, koji sadrži 1 mmol/LEDTA) i čuvati u hladnjaku na -80 stupnjeva za dugotrajno skladištenje.
2.5 Analiza aktivnosti enzima CtCHS
CtCHS enzimski reakcijski sustav: 100 mmol/L KPB (pH 7,5) 468 μL, 1 mmol/L malonil-CoA 10 μL, 5 mmol/L 4-kumaroil-CoA 2 μL, CtCHS rekombinantni proteina 20 μL, u Nakon reakcije u vodenoj kupelji na 37 stupnjeva tijekom 12 sati, smjesa je ekstrahirana tri puta s 800 μL etil acetata, osušena strujom dušika i zatim otopljena u 100 μL metanola. Koristite tekućinsku kromatografiju visoke učinkovitosti za detekciju proizvoda. Uvjeti su kolona Ultimate LP-C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm), temperatura kolone 30 stupnjeva, volumen uzorka 10 μL i voda (A) i acetonitril (B) kao protok. Faza, elucijski gradijent: 0~10
min, 30% B; 10~20 min, 30%~60% B; 20~25 min, 60%~70% B; 25~30 min, 70%~80% B; 30~35 min, 80%~100% B; 35-40 min, 100% B; 40-46 min, 100%-30% B. Volumetrijski protok je 1 mL/min, a detekcija je na valnoj duljini od 290 nm.
Za daljnju detekciju korišten je UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS. Uvjeti tekuće faze bili su kolona Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18 (100 mm × 3.0 mm, 1,7 μm), temperatura kolone 40 stupnja, naringenin- kontrole kalkona i naringenina. Volumen punjenja proizvoda je 4 μL, a volumen punjenja produkta enzimske reakcije je 7 μL. Kao mobilna faza koristi se voda (A)-acetonitril (B). Gradijent eluiranja je: 0 do 5 min, 30% B; 5 do 15 min, 30 %-60% B; 15-20 min, 60%-100% B; 20-25 min, 100% B; 25-31 min, 100%-30% B. Volumetrijski protok je 0,3 mL/min. Uvjeti masene spektrometrije su izvor elektroraspršenih iona, dušik kao plin nosač, tlak plinskog omotača 3,5 MPa, tlak pomoćnog plina 1,0 MPa, tlak raspršivanja 3500 V, temperatura kapilare 350 stupnjeva, temperatura grijanja pomoćnog plina 200 stupnjeva, pozitivni i negativni ionski načini rada, skeniranje raspon iona m/z je 100-1500, puna MS rezolucija je 35 000, dd-MS2 rezolucija je 17 500, (N)
CE/stepped nce postavljen na 35, 60.
2.3 Bioinformatička analiza
Koristite ProtParam online softver za analizu fizikalnih i kemijskih svojstava proteina; koristiti Prot Scale online alat za analizu hidrofilnosti/hidrofobnosti proteina; koristiti online alat SOPMA za predviđanje sekundarne strukture proteina; koristiti softver za online analizu SWISS-MODEL za predviđanje tercijarne strukture proteina; koristiti online softver TMHMM Predvidjeti transmembransku strukturu proteina; koristiti softver DNAMAN za usporedbu homologije CtCHS s CHS aminokiselinskim sekvencama drugih vrsta; koristiti MEGA-X softver za konstruiranje filogenetskog stabla, korištenjem susjednog spajanja (NJ) i Poissonove korekcije. Evolucijska udaljenost izračunava se metodom Bootstrap, a broj ponavljanja Bootstrapa je 1000 puta.
2.4 CtCHS prokariotska ekspresija i pročišćavanje
Dizajnirajte početnice s restrikcijskim mjestima BamHⅠ i XhoⅠ na temelju CtCHS sekvence, a PCR pojačava odgovarajuće ciljane fragmente. Vektor pET-28a i ciljni fragment digestirani su pomoću endonukleaza BamHI i Klonirani soj je sekvenciran, a plazmid je ekstrahiran nakon ispravnog sekvenciranja. Plazmid pET-28a-CtCHS verificiran sekvenciranjem prenesen je u kompetentne stanice Escherichia coli BL21 (DE3). Pogledajte metodu Ding Ning i sur. [17] s izopropilom
-D-tiogalaktopiranozid (IPTG) korišten je za induciranje ekspresije proteina na niskoj temperaturi i pročišćen je kroz Ni2+ afinitetnu kromatografsku kolonu (Cytiva, Cat 17531901). Protein je koncentriran centrifugiranjem u ultrafiltracijskoj epruveti (Millipore, 30 000) i odsoljen. Čuvati u 20 mmol/L KPB puferu (pH 8,0, koji sadrži 1 mmol/LEDTA) i čuvati u hladnjaku na -80 stupnjeva za dugotrajno skladištenje.
2.5 Analiza aktivnosti enzima CtCHS
CtCHS enzimski reakcijski sustav: 100 mmol/L KPB (pH 7,5) 468 μL, 1 mmol/L malonil-CoA 10 μL, 5 mmol/L 4-kumaroil-CoA 2 μL, CtCHS rekombinantni proteina 20 μL, u Nakon reakcije u vodenoj kupelji na 37 stupnjeva tijekom 12 sati, smjesa je ekstrahirana tri puta s 800 μL etil acetata, osušena strujom dušika i zatim otopljena u 100 μL metanola. Koristite tekućinsku kromatografiju visoke učinkovitosti za detekciju proizvoda. Uvjeti su kolona Ultimate LP-C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm), temperatura kolone 30 stupnjeva, volumen uzorka 10 μL i voda (A) i acetonitril (B) kao protok. Faza, elucijski gradijent: 0~10
min, 30% B; 10~20 min, 30%~60% B; 20~25 min, 60%~70% B; 25~30 min, 70%~80% B; 30~35 min, 80%~100% B; 35-40 min, 100% B; 40-46 min, 100%-30% B. Volumetrijski protok je 1 mL/min, a detekcija je na valnoj duljini od 290 nm.
Za daljnju detekciju korišten je UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS. Uvjeti tekuće faze bili su kolona Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18 (100 mm × 3.0 mm, 1,7 μm), temperatura kolone 40 stupnja, naringenin- kontrole kalkona i naringenina. Volumen punjenja proizvoda je 4 μL, a volumen punjenja produkta enzimske reakcije je 7 μL. Kao mobilna faza koristi se voda (A)-acetonitril (B). Gradijent eluiranja je: 0 do 5 min, 30% B; 5 do 15 min, 30 %-60% B; 15-20 min, 60%-100% B; 20-25 min, 100% B; 25-31 min, 100%-30% B. Volumetrijski protok je 0,3 mL/min. Uvjeti masene spektrometrije su izvor elektroraspršenih iona, dušik kao plin nosač, tlak plinskog omotača 3,5 MPa, tlak pomoćnog plina 1,0 MPa, tlak raspršivanja 3500 V, temperatura kapilare 350 stupnjeva, temperatura grijanja pomoćnog plina 200 stupnjeva, pozitivni i negativni ionski načini rada, skeniranje raspon iona m/z je 100-1500, puna MS rezolucija je 35 000, dd-MS2 rezolucija je 17 500, (N)
CE/stepped nce postavljen na 35, 60.
2.6 Subcelularna lokalizacija CtCHS proteina
Na temelju CtCHS sekvence i principa besprijekornog kloniranja, dizajnirani su primeri s mjestima za rezanje enzima Kpn Ⅰ i BamH Ⅰ, a odgovarajući ciljani fragmenti umnoženi su PCR-om. Plazmid pCAMBIA1300-35S-GFP razgrađen je restrikcijskim endonukleazama Kpn Ⅰ i BamH Ⅰ, a ciljni fragment i vektor povezani su pomoću kompleta za besprijekorno kloniranje (Novizan, Cat C115-01), a zatim prebačeni u kompetentne stanice E. coli DH5. , odaberite pojedinačne klonirane sojeve za sekvenciranje i ekstrahirajte plazmide iz točnih sojeva. Plazmidi pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS i pCAMBIA 1300-35S-GFP transformirani su u protoplaste Arabidopsis thaliana pomoću PEG4000 i uzgajani pod slabim svjetlom 8 do 10 h. Podstanična lokalizacija CtCHS proteina promatrana je pod laserskim konfokalnim mikroskopom.
2.7 Analiza obrasca ekspresije CtCHS
Fluorescentni kvantitativni primeri u stvarnom vremenu dizajnirani su korištenjem DNAMAN-a na temelju CtCHS sekvence, s F-boxom kao unutarnjim referentnim genom. Slijedovi početnica prikazani su u tablici 1. Relativna ekspresija CtCHS u cvjetovima Cistanche tubulosa različitih boja detektirana je fluorescentnom kvantitativnom PCR-om u stvarnom vremenu. Upotrijebite TransStart Green qPCR SuperMix (puno zlato, AQ101-02) za mjerenje metodom fluorescentne boje SYBRGreen. Reakcijski sustav: 2×TransStartGreen qPCR SuperMix 5 μL, uzvodni i nizvodni primeri (10 μmol/L) 0.2 μL svaki, cDNA predložak 0,5 μL, 4,1 μL vode bez nukleotidaze korišteno je za reakciju pomoću metode u dva koraka. Reakcijski postupak temeljio se na metodi Dong Xianjuana i sur. [18]. Svaki uzorak sadržavao je 3 biološka ponavljanja, a eksperiment je ponovljen tri puta. Eksperimentalni podaci analizirani su pomoću Excela, relativni izraz CtCHS izračunat je metodom 2−ΔΔCt, a GraphPadPrism 8 korišten je za analizu značajnosti i crtanje histograma.
