Clec12a ublažava upalu dok ograničava širenje kolitogenog komenzala

SAŽETAK

Regulacija mikrobiote ključna je za zdravlje crijeva, no mehanizmi koje koristi urođeni imunitet ostaju nejasni. Ovdje pokazujemo da su miševi s nedostatkom C-tipa-lektinskog receptora, Clec12a, razvili teški kolitis, koji je ovisio o mikrobioti. Studije transplantacije fekalne mikrobiote (FMT) na miševima bez klica otkrile su kolitogenu mikrobiotu formiranu unutar Clec12a-/- miševa koji su bili obilježeni ekspanzijom gram-pozitivnog organizma, glodavaca Faecalibaculum. Liječenje bakterijom F. rodentium bilo je dovoljno za pogoršanje kolitisa kod miševa divljeg tipa. Makrofagi unutar crijeva izražavaju najviše razine Clec12a. Analiza citokina i sekvenciranja u Clec12a-/- makrofagima otkrila je pojačanu upalu, ali značajno smanjenje gena povezanih s fagocitozom. Doista, Clec12a-/- makrofagi imaju smanjenu sposobnost preuzimanja F. rodentium. Pročišćeni Clec12a imao je veće vezanje za Gram-pozitivne organizme kao što je F. rodentium. Stoga naši podaci identificiraju Clec12a kao urođeni mehanizam imunološkog nadzora za kontrolu širenja potencijalno štetnih komenzala bez očite upale.

koristi cistanche za muškarce-jača imunološki sustav

UVOD

Sastav i funkcija mikrobiote mogu imati dubok utjecaj na zdravlje i bolesti sisavaca (Fassarella et al., 2021.). Ovo je dobro dokumentirano za upalnu bolest crijeva (IBD), gdje je većina mišjih modela IBD-a osjetljiva na promjene u sastavu mikrobiote (Gkouskou et al., 2014.). Razumijevanje čimbenika koji utječu na stabilnost mikrobiote i upravljaju njome bit će važno kako se budu razvijale terapije temeljene na mikrobioti (Sharma et al., 2020.; Sorbara i Pamer, 2022.). Na mikrobiotu utječu brojni parametri uključujući prehranu, lijekove i imunološki sustav. Posljednjih godina pokazalo se da adaptivne imunološke komponente, posebice IgA, utječu na sastav mikrobiote (Nakajima i sur., 2018.; Okai i sur., 2016.; Yang i Palm, 2020.). Međutim, manje se zna o tome kako specifični urođeni imunološki receptori utječu na sastav homeostatske mikrobiote.

Genetski polimorfizmi u genima koji reguliraju mikrobno prepoznavanje i imunost sluznice značajni su rizični aleli za IBD, uključujući protein autofagije ATG16L1 (Cadwell i sur., 2008.; Liu i sur., 2015.; Rioux i sur., 2007.; Wellcome Trust Case Control, 2007. ). U nedavnoj studiji koja istražuje promjene ekspresije mijeloidnog gena kod pojedinaca s polimorfizmom ATG16L1T300A, inhibicijski C-tip lektinskog receptora (CLR), Clec12a, identificiran je kao značajno potisnut u tim stanicama (Begun et al., 2015.). Ista studija pokazala je da Clec12a djeluje u obrani od patogene infekcije kroz povezanost s autofagijskim putem. Ovi podaci sugeriraju da bi regulacija Clec12a u osoba s IBD-om mogla utjecati na ozbiljnost i/ili razvoj bolesti. Unatoč ovim dokazima, malo se zna o mehanizmima imunološke regulacije na koje djeluje Clec12a tijekom kolitisa.

Lektini C-tipa raznolika su skupina topivih ili membranski vezanih molekula sposobnih vezati lipide, proteine ​​i ugljikohidrate porijeklom iz domaćina ili mikroba (Brown i sur., 2018.). Mincle (Clec4e) i Dectin-1 (Clec7a) dva su CLR-a koji utječu na specifične članove mikrobiote za održavanje crijevne homeostaze (Iliev i sur., 2012.; Martinez-Lopez i sur., 2019.). Međutim, s više od 1000 različitih lektina C-tipa, još mnogo toga treba otkriti unutar ove obitelji proteina. Clec12a pripada obitelji prirodnih receptora ubojica i jedan je od samo dva lektina C-tipa koji sadrže motiv inhibicije imunološkog tirozina (ITIM) koji može ograničiti upalne signalne putove (Brown et al., 2018; Marshall et al., 2004) . Clec12a prepoznaje mokraćnu kiselinu koja je signal staničnog oštećenja (Neumann et al., 2014). Clec12a je najizraženiji u prirodnim imunološkim stanicama, au neutrofilima djeluje na smanjenje aktivacije i regulaciju upalne proizvodnje citokina nakon prepoznavanja mokraćne kiseline (Neumann et al., 2014.). Suprotno tome, Clec12a potiče upalu dopuštajući mononuklearnim fagocitima (MNP) transmigraciju preko krvno-moždane barijere tijekom autoimunog modela multiple skleroze i pojačavajući signaliziranje interferona tipa I kao odgovor na virusnu infekciju (Li et al., 2019; Sagar et al. ., 2017). Clec12a je također sposoban prepoznati plazmodijalni produkt, hemozoin, za koji se pokazalo da povećava CD8+ T stanice u mozgu nakon infekcije Plasmodiumom (Raulf et al., 2019.). Dakle, Clec12a predstavlja promiskuitetni CLR s različitim ulogama u imunitetu i jedinstvenim sposobnostima signalizacije, ali njegova uloga u crijevima ostaje nepoznata.

cistanche tubulosa-poboljšava imunološki sustav

Prethodno smo pokazali da specifične crijevne gljivice pogoršavaju kolitis inducirajući metabolit purina, mokraćnu kiselinu (Chiaro et al., 2017.). Štoviše, metabolizam purina nedavno je povezan s ljudskim crijevnim bolestima (Zhu et al., 2019.). Ovi podaci zajedno sugeriraju da otkrivanje mokraćne kiseline može biti relevantno za IBD. Na temelju toga krenuli smo istraživati ​​funkciju Clec12a u crijevima. Otkrili smo da su životinje s manjkom Clec12a vrlo osjetljive na kolitis koji ovisi o sastavu mikrobiote formiranom u odsutnosti Clec12a. FMT Clec12a-/- mikrobiote u WT životinja bez klica bio je dovoljan za pogoršanje kolitisa, a stvaranje kolitogene mikrobiote u Clec12a-/- životinjama neovisno je o adaptivnom imunitetu. Kako bi se identificirali relevantni mikrobi koji bi mogli pogoršati kolitis, životinje Clec12a-/- liječene su različitim antibioticima, a oni koji su ciljali na gram-pozitivne bakterije ublažili su bolest. Sekvenciranjem 16S rDNA utvrđeno je da je Faecalibaculum rodentium značajno zastupljeniji u Clec12a-/- životinjama, a oralna gavaža F. rodentium bila je dovoljna za pogoršanje patologije bolesti kod WT životinja. Imunološko profiliranje Clec12a-/- životinja otkrilo je izrazito smanjenje homeostatskih mijeloidnih stanica u debelom crijevu. Sekvencioniranje RNA makrofaga tretiranih F. rodentium otkrilo je da Clec12a potiče fagocitozu. Kako se pokazalo da Clec12a veže višestruke ligande, pitali smo hoće li se Clec12a vezati na različite članove mikrobiote. Korištenjem Clec12a-Fc fuzijskog proteina identificirali smo da se Clec12a najjače veže na gram-pozitivne članove mikrobiote. Zajedno ovi podaci upućuju na model po kojem Clec12a kontrolira kolitogene članove mikrobiote izravnim vezanjem i fagocitozom dok sprječava upalne reakcije. U scenarijima gdje je ekspresija Clec12a smanjena, gram-pozitivni patobioni mogu se proširiti i potaknuti upalu. Stoga naše studije identificiraju Clec12a kao važan supresor upale koji osigurava homeostazu i održavanje zdrave mikrobiote.

REZULTATI

Clec12a-/- životinje vrlo su osjetljive na kolitis neovisno o adaptivnom imunološkom sustavu

Smanjena ekspresija Clec12a zabilježena je kod osoba s IBD-om i pokazali smo da blokiranje proizvodnje jednog od liganada za Clec12a, mokraćne kiseline, može ublažiti kolitis (Begun i sur., 2015.; Chiaro i sur., 2017.; Liu i sur. ., 2015). Međutim, Clec12a još nije proučavan na životinjskim modelima kolitisa. U tu svrhu, miševi WT i Clec12a-/- C57BL/6 bili su izazvani akutnim DSS kolitisom. Clec12a-/- životinje izgubile su znatno više na težini, imale su kraća debelo crijevo i imale su značajno povećanje upalnog markera LCN2 u izmetu u usporedbi s WT životinjama, što ukazuje na pogoršanje upale i bolesti (Slika 1A-C). Potvrđujući to, histološka analiza otkrila je povećano oštećenje epitela, gubitak kripte i priljev imunoloških stanica kod Clec12a-/- životinja u usporedbi s WT (Slika 1D, E). U skladu s rezultatima u DSS modelu kolitisa, prijenos CD4+ CD45RBhi stanica u TCRb-/-; Clec12a-/- dvostruki nokaut miševi doveli su do manjeg debljanja tijekom vremena i kraćih crijeva u usporedbi s T stanicama prenesenim u TCRb-/- miševe (Slika 1F, G). Zajedno, ovi rezultati pokazuju da gubitak Clec12a dovodi do pogoršanja crijevne bolesti.

Prijavljeno je da se Clec12a uglavnom eksprimira unutar urođenih imunoloških stanica s vrlo niskom ekspresijom zabilježenom u CD8+ T stanicama. Stoga, kako bi se utvrdilo je li adaptivni imunitet uključen u pogoršanu bolest uočenu kod Clec12a-/- životinja, Clec12a-/- životinje su križane s Rag-/- životinjama kako bi se uklonile i T i B stanice. Opet, Clec12a-/- životinje razvile su pogoršanje bolesti u usporedbi s WT životinjama jer su izgubile više težine i imale kraća debelo crijevo od WT kontrola (Slika 1H, I). Slično, Clec12a-/-; Rag-/- je razvio pogoršanu crijevnu bolest u usporedbi s Rag-/- kontrolama i izgubio je toliko težine i imao je kraća debelo crijevo od WT i Rag-/- kao Clec12a-/- (Slika 1H, I). Prethodno smo izvijestili da oralno liječenje S. cerevisiae povećava razinu mokraćne kiseline i pogoršava kolitis. Međutim, nisu primijećene razlike u razinama mokraćne kiseline u serumu ili fecesu u WT u odnosu na Clec12a-/- životinje, što sugerira da pojačana bolest opažena u Clec12A-/- nije rezultat povećane mokraćne kiseline (slika S1). Stoga je pogoršani razvoj kolitisa opažen u Clec12a-/- životinjama neovisan o adaptivnom imunološkom sustavu.

cistanche tubulosa-poboljšava imunološki sustav

Kliknite ovdje za pregled Cistanche proizvoda za jačanje imuniteta

【Tražite više】 E-pošta:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Pogoršanje kolitisa kod Clec12a-/- životinja ovisi o mikrobioti

Poznato je da je kolitis djelomično uzrokovan promjenama u sastavu mikrobiote (Kubinak i sur., 2015.; Ray i Dittel, 2015.). Kako bi se utvrdilo imaju li Clec12a-/- životinje mikrobiotu koja potiče pogoršanje kolitisa, FMT su izvedeni s WT ili Clec12a-/- miševa na WT životinje bez klica. Četiri tjedna nakon transplantacije, polovica životinja bila je smještena zajedno, dok je druga polovica ostala odvojeno. Zatim je induciran akutni DSS kolitis u svakoj skupini (Slika 2A). Životinje koje su primile Clec12a-/- FMT i životinje koje su bile u zajedničkom smještaju izgubile su znatno više na težini (Slika 2B) i imale su znatno kraća debelo crijevo (Slika 2C) od životinja koje su primile FMT od WT miševa. Nadalje, histološka analiza otkrila je veće oštećenje epitela i upalni influks nakon transplantacije s Clec12a-/- mikrobiotom (Slika 2D, E). Utvrđene mikrobne zajednice bile su različite među skupinama kako je određeno sekvenciranjem gena 16S rRNA pomoću Bray-Curtis (PERMANOVA, p=0.0001), neponderirano (PERMANOVA, p=0.0062) i ponderirano- Unifrac udaljenosti (PERMANOVA, str=0.0001). Razlike u mikrobioti unutar grupe bile su najveće kod životinja koje su držane zajedno prema istim metričkim pokazateljima koji ukazuju na stjecanje mikroba iz svakog genotipa FMT (Slika 2 FH). Ovi podaci pokazuju da je pogoršani kolitis kod Clec12a-/- životinja potaknut specifičnim mikrobima obogaćenim u odsutnosti Clec12a; i ti su mikrobi postali dominantni pokretači kolitogenog fenotipa, čak i u prisutnosti uspostavljene WT mikrobiote.

Sastav mikrobiote formiran u Clec12a-/- životinjama ne ovisi o adaptivnom imunitetu

Imunološki sustav je važan za diktiranje sastava mikrobiote. Eksperiment FMT pokazao je da Clec12a-/- dovodi do promjene u sastavu mikrobiote koja potiče pogoršani razvoj kolitisa. Prvo smo htjeli utvrditi je li nedostatak Clec12a-/- unutar imunološkog odjeljka sposoban preoblikovati crijevnu mikrobiotu. U tu svrhu, koštana srž WT ili Clec12a-/- miševa prebačena je u smrtonosno ozračene WT SPF miševe primatelje kako bi se standardizirala mikrobiota nakon čega je uslijedilo 8-tjedno razdoblje imunološke rekonstitucije (Slika 3A). Tijekom tog vremena, transplantirani imunološki sustav ima vremena da se razvije unutar primatelja, različito oblikujući sastav mikrobiote. Kako bismo utvrdili jesu li prokolitogene promjene u mikrobioti rezultat ovog imunološkog oblikovanja, izveli smo FMT koristeći izmet ili WT ili Clec12a-/- himeričnih miševa i inducirani DSS kolitis (Slika 3A). Iako nije bilo značajnih promjena u gubitku težine (Slika 3B), debelo crijevo kod životinja koje su primile FMT od Clec12a-/- himeričnih miševa bilo je značajno kraće u usporedbi sa životinjama koje su primile FMT od WT miševa (Slika 3C), što ukazuje na pogoršanje bolesti. Štoviše, kada su primatelji WT i Clec12a-/- FMT bili zajedno smješteni, debelo crijevo je bilo znatno kraće u usporedbi sa životinjama koje su primale WT FMT (Slika 3C). Stoga nedostatak Clec12a-/- unutar hematopoetskog odjeljka dovodi do stvaranja dominantne kolitogene mikrobiote.

Kako bismo dodatno potvrdili da je adaptivni imunološki sustav nepotreban za formiranje kolitogene mikrobiote kod Clec12a-/- životinja, izveli smo FMT koristeći izmet iz Rag-/- ili Rag-/-; Clec12a-/- - kao što je prethodno opisano. Životinje koje su primile Rag-/-; Clec12a-/- FMT izgubio je više na težini i imao je znatno kraća debelo crijevo od životinja koje su primile FMT od Rag-/- životinja, štoviše, životinje koje su držane u zajedničkom smještaju također su razvile pogoršanje bolesti (Slika 3D, E). Ovi podaci pokazuju da je nedostatak Clec12a unutar urođenog imunološkog sustava dovoljan da dovede do stvaranja mikrobiote koja može pogoršati kolitis.

Clec12a suzbija širenje Faecalibaculum rodentium

Upotrijebili smo niz različitih antibiotika kako bismo identificirali relevantne organizme koji pokreću bolest unutar Clec12a-/- životinja. Prvo, liječenje snažnim koktelom antibiotika širokog spektra koji uključuje eritromicin, ampicilin, neomicin i gentamicin, značajno je smanjilo težinu bolesti i kod Clec12a-/- i kod WT životinja, sugerirajući da je bakterijska populacija mikrobiote bila relevantna za bolest ( Slika 4A; Slika S2). Zatim smo dodatno suzili koje su bakterijske populacije najrelevantnije za bolest korištenjem različitih antibiotika usmjerenih na jedinstvene taksone bakterija. Točnije, odabrali smo gentamicin, aminoglikozid koji ciljano djeluje na gram-negativne bakterije, i cefalotin, cefalosporin koji prvenstveno cilja na gram-pozitivne bakterije. Ovi lijekovi su davani Clec12a-/- životinjama tijekom DSS kolitisa. Iako liječenje gentamicinom nije dovelo do promjene u težini bolesti, životinje koje su primale cefalotin zadržale su svoju težinu i imale su značajno duža crijeva od lažno liječenih životinja (Slika 4B, C), što ukazuje da gram-pozitivni organizmi koji žive unutar Clec12a-/- mikrobiote igraju važnu ulogu u pogoršanju patologije bolesti.

Zatim smo izvršili sekvenciranje gena 16S rRNA SPF WT i Clec12a-/- izmeta kako bismo profilirali promjene sastava u mikrobioti. Životinje WT i Clec12a-/- grupirane su značajno različito prema nefilogenetskim i filogenetskim mjernim podacima ponderiranim na bazi broja, Bray-Curtis i ponderirani UniFrac (Slika S3A-C). Alfa metrika raznolikosti nije otkrila značajne razlike u bogatstvu (uočene značajke), što ukazuje da Clec12a-/- nije utočište više vrsta (Slika 4D). Međutim, indeksi ravnomjernosti i Shannonove raznolikosti povećani su u odsutnosti Clec12a, što ukazuje da je proporcionalna distribucija bakterija u Clec12a-/- miševa promijenjena (Slika 4E, F) i dodatno podupire da je Clec12a važan za regulaciju strukture mikrobiote unutar crijeva.

Analiza sastava mikrobioma (ANCOM) otkrila je da je, među ASV-ovima (varijantama sekvenci amplikona) različito zastupljenim, ASV klasificiran u rod Faecalibaculum (obitelj Erysipelotrichaceae), bio značajno proširen unutar Clec12a-/- fecesa u usporedbi s WT-om (Slika 4G, H). BLAST korištenjem ASV reprezentativne sekvence iz naše analize pokazao je 100% identičnost sa sekvencama iz bakterije Faecalibaculum rodentium. Ovi podaci pružaju dokaze da su gram-pozitivne bakterije u Clec12a-/- životinji odgovorne za kolitogeni fenotip, i posebno upućuju na pogoršanje bolesti gram-pozitivnog organizma, F. rodentium.

Na temelju toga, testirali smo hipotezu da F. rodentium može pogoršati kolitis. Prethodno smo tretirali WT SPF životinje s 1 x 108 CFU bilo živog ili fiksnog F. rodentium oralnom sondom i nastavili tretman svaki dan tijekom akutnog modela DSS-a kako bismo osigurali visoke razine kolonizacije F. rodentium. Životinje koje su primile i živu i fiksiranu F. rodentium izgubile su više na težini i imale su značajno kraća crijeva nego životinje tretirane nosačem (Slika 4I, J), što ukazuje da povećane razine F. rodentium mogu pogoršati bolest.

Clec12a ograničava upalni odgovor makrofaga dok pojačava fagocitozu

Kako bismo definirali staničnu ekspresiju Clec12a u odsutnosti bolesti, profilirali smo urođene i adaptivne imunološke stanice u lamina propria (LP) koristeći višebojnu protočnu citometriju. U skladu s prethodnim izvješćima, Clec12a je uglavnom ograničen na mijeloičnu lozu s malo ili nimalo ekspresije na limfocitima (Slika 5A) (Han i sur., 2004; Pyz i sur., 2008; Sobanov i sur., 2001). Intestinalni neutrofili, makrofagi i dendritične stanice pokazali su slične razine ekspresije Clec12a (Slika S4A), dok su makrofagi imali najveći postotak stanica unutar crijevnog tkiva koje eksprimiraju Clec12a (Slika 5A). S obzirom na dvostruku ulogu makrofaga da promiču upalu putem klasične aktivacije, ali i da pokreću reparativne mehanizme kao odgovor na oštećenje tkiva, pitali smo kako Clec12a može utjecati na ovu dihotomiju tijekom kolitisa. Iako su makrofagi prilično raznoliki, mogu se općenito podijeliti na M1 upalne i M2 reparativne makrofage prema ekspresiji CD38 odnosno EGR2. Pokazujemo da Clec12a-/- životinje imaju povećan broj M1 makrofaga i smanjen M2 makrofaga u LP debelog crijeva tijekom kolitisa (Slika 5 B, C, Slika S4B). Ovi podaci pokazuju da Clec12a regulira odgovore makrofaga u crijevima.

Da bismo bolje razumjeli kako Clec12a utječe na biologiju makrofaga kao odgovor na mikrobne ligande, makrofagi porijeklom iz koštane srži (BMDM) izolirani iz WT ili Clec12a-/- životinja tretirani su različitim uobičajenim mikrobnim ligandima uključujući LPS, Pam3CysK i Flagellin. Na svim tim uzorcima učinjena je analiza citokina. Mnogi testirani citokini nisu bili inducirani pod ovim uvjetima, međutim, MCP-1, IL-27, IFN-b, TNF-a i IL-6 dosljedno su otkriveni u tim kulturama ( Slika 5D). Clec12a-/- BMDM-ovi su imali značajno veću ekspresiju ovih citokina kao odgovor na mnoge mikrobne ligande, a najveći diferencijalni odgovori su viđeni kao odgovor na TLR2 agonist Pam3CysK. Ovi su podaci u skladu s poznatom ulogom Clec12a u ublažavanju upalnih odgovora tijekom sterilne upale (Neumann et al., 2014.).

biljka cistanche koja jača imunološki sustav

RNA-seq je izveden na BMDM-ovima iz WT ili Clec12a-/- tretiranih F. rodentiumom kako bi se odredilo kako Clec12a regulira odgovore ovih stanica na ovaj specifični bakterijski organizam. Procijenili smo različiti odgovor usporedbom Clec12a-/- BMDM-a izloženih F. rodentiumu u odnosu na kontrole nosača s odgovorom WT BMDM-a. Analiza obogaćivanja različito eksprimiranih gena pokazala je da su makrofagi s nedostatkom Clec12a imali značajno povećanje gena uključenih u kontrolu staničnog ciklusa kada su izazvani F. rodentiumom (Slika S5A). Stanični ciklus je intrinzično povezan s fagocitozom, a došlo je i do značajnog smanjenja gena povezanih s fagocitozom i upalnim odgovorom (Slika 5E) (Luo et al., 2005.). U skladu s nedavnom studijom o Clec12a i Salmonella, ovi podaci sugeriraju da je fagocitoza neispravna u odsutnosti Clec12a kao odgovor na F. rodentium koji živi u normalnim crijevima (Begun et al., 2015.). Da bi se ovo testiralo, peritonealni makrofagi su sakupljeni od WT i Clec12a-/- životinja i ko-kultivirani sa Sybr®-green označenim F. rodentium. Makrofagi Clec12a-/- imali su znatno manje mikroba po stanici (Slika 5F, G; Slika S5B), što ukazuje da manjak Clec12a dovodi do unosa manjeg broja organizama i da je u skladu sa smanjenom fagocitozom u skupu podataka RNA-seq. Zajedno, ovi podaci pokazuju da Clec12a ima dvostruku ulogu ublažavanja otvorenih upalnih odgovora na uobičajene mikrobne ligande, dok istovremeno potiče unos bakterija makrofaga.

Clec12a se preferirano veže na gram-pozitivne komenzale

Kako se fagocitoza pokreće vezanjem mikroba nakon čega slijedi internalizacija i ubijanje, pretpostavili smo da se Clec12a mogao vezati na specifične članove mikrobiote, kao što je F. rodentium. Kako bi se riješila ova mogućnost, stvoren je fuzijski protein koji sadrži izvanstaničnu veznu domenu mišjeg Clec12a i Fc dio humanog IgG1 (Clec12a-Fc) (Slika 6A) (Maglinao i sur., 2014.; Neumann i sur., 2014.; Raulf i sur., 2019). Protein je pročišćen i pretražen na vezanje na panel različitih gram-pozitivnih i gram-negativnih bakterija za koje se zna da su prisutne u homeostatskom crijevu, uključujući F. rodentium, Roseburia spp., Bifidobacteria animalis, Akkermansia muciniphila, Bacteriodes uniformis, i gljivične komensale Candida albicans, protočnom citometrijom. Salmonella enterica također je bila uključena jer su prethodne studije pokazale da se Clec12a može povezati s ulaskom S. enterica u stanicu (Begun et al., 2015.). Clec12a se u različitim stupnjevima vezao s nekoliko filogenetski različitih bakterija, uključujući F. rodentium, ali ne i s gljivama, C. albicans (Slika 6B). Clec12a se najviše vezao za gram-pozitivne organizme F. rodentium i člana obitelji Lachnospiraceae Roseburia sp., a najmanje je komunicirao s B. animalis, B. uniformis i S. enterica (Slika 6B), što ukazuje da Clec12a može vežu se za specifične članove mikrobiote s preferiranjem gram-pozitivnih organizama. Uzeti zajedno, naši podaci identificiraju Clec12a kao mehanizam koji koristi imunološki sustav za ispitivanje crijevne mikrobne zajednice i skraćivanje mikrobiote putem izravnog vezanja i fagocitoze dok sprječava očite upalne odgovore na obilje gram-pozitivnih mikroba što je ključno za održavanje zdravlja crijeva.

RASPRAVA

Homeostaza unutar crijeva zahtijeva mehanizme za ograničavanje komenzalnih mikroba bez iniciranja štetne upale (Macpherson et al., 2000.). IgA se posljednjih godina pokazao kao jedan od kritičnih načina na koji crijevni imunitet može vršiti kontrolu nad mikrobiotom (Pabst i Slack, 2020.). Doista, IgA se može izravno vezati za mikrobe i/ili njihove produkte i eliminirati ih iz crijeva bez indukcije prototipične upale. Druge imunološke molekule koje posjeduju ova dvojna svojstva do danas nisu proučavane. Lektini tipa C sastoje se od raznolike klase proteina koji mogu prepoznati različite molekule proteina, ugljikohidrata i lipida iz proizvoda mikroba i domaćina (Brown i sur., 2018; Drouin i sur., 2020). Međutim, malo ih je proučavano u kontekstu crijevnog imuniteta i mikrobiote (Iliev i sur., 2012.; Martinez-Lopez i sur., 2019.). Dakle, prema našim saznanjima, ovo je prva demonstracija da nedostatak Clec12a mijenja sastav mikrobiote koja uzrokuje ozbiljnost bolesti.

cistanche koristi-jača imunološki sustav

Clec12a je u velikoj mjeri proučavan u kontekstu prepoznavanja mononatrijevog urata (MSU) ili mokraćne kiseline, što je često pokazatelj stanične smrti (Kono i sur., 2010.; Neumann i sur., 2014.). Mokraćna kiselina je sposobna aktivirati upalne odgovore putem inflamasoma NLRP3, stoga, kako bi se spriječilo uništavanje tkiva tijekom stanične smrti, ova upala mora biti kontrolirana (Martinon et al., 2006). Pokazalo se da Clec12a uravnotežuje ovaj upalni odgovor snižavanjem Syk signalizacije (Marshall et al., 2004.). U skladu s ovim, brisanje Clec12a u modelu sterilne upale i autoinflamatornom modelu artritisa uzrokuje pojačanu aktivaciju neutrofila i pogoršanje bolesti, čineći Clec12a važnom upalnom kočnicom (Redelinghuys et al., 2016.). Međutim, nedavno je također dokazano da Clec12a pojačava signaliziranje interferona tipa I kao odgovor na virusnu infekciju i posreduje u unosu salmonele putem puta antibakterijske autofagije (Begun i sur., 2015.; Li i sur., 2019.). Ovo pokazuje da Clec12a ne funkcionira samo za ograničavanje upale, već može igrati različite uloge ovisno o kontekstu. Crijeva se razlikuju po tome što postoji veliki broj imunoloških stanica čak i u odsutnosti bolesti. To je zbog prisutnosti mikrobiote koja ima važnu ulogu u upravljanju imunološkim razvojem i sprječavanju kolonizacije patogenih organizama. Mikrobiota posjeduje iste površinske uzorke koje otkrivaju TLR-ovi koji također prepoznaju patogene, pa stoga crijevni imunološki sustav mora imati uspostavljene stroge regulatorne mehanizme za suzbijanje upale tim stranim organizmima (Blander et al., 2017.).

Prvotno smo se zainteresirali za Clec12a jer smo identificirali da crijevna gljivica, Saccharomyces cerevisiae, potiče mokraćnu kiselinu da pogorša kolitis (Chiaro et al., 2017.). Štoviše, druge su studije otkrile da mikrobiota može utjecati na crijevne bolesti putem indukcije metabolizma purina, čiji je krajnji produkt kod sisavaca mokraćna kiselina (Zhu et al., 2019.). Ovi podaci sugeriraju da mehanizmi za otkrivanje mokraćne kiseline, kao što je Clec12a, mogu utjecati na crijevnu homeostazu. Međutim, nismo uočili promjene u razinama mokraćne kiseline u serumu ili fecesu, što ukazuje da pojačana ozbiljnost bolesti kod Clec12a-/- životinje nije bila uzrokovana povećanom mokraćnom kiselinom. Međutim, povećana ozbiljnost kolitisa u Clec12a-/- uzrokovana je sastavom mikrobiote. Stoga, na temelju naših podataka, smanjena ekspresija Clec12a-/- mogla bi utjecati na sastav mikrobiote kod bolesnika s IBD-om (Jason L. Kubinak, 2015.; Rehman i sur., 2011.; Vijay Kumar i sur., 2010.). Zanimljivo je da smo otkrili da su antibiotici usmjereni na gram-pozitivne organizme mogli ublažiti težinu kolitisa kod Clec12a-/- životinja. Ovo je u suprotnosti s nekoliko izvješća koja su identificirala ekspanziju gram-negativnih Enterobacteriaceae tijekom crijevne upale, stoga je ovo jedna od rijetkih studija koja je identificirala ekspanziju u gram-pozitivnim organizmima koji su povezani s razvojem kolitisa. Iako vjerojatno nije jedini organizam koji utječe na ozbiljnost kolitisa u ovom modelu, dramatična ekspanzija F. rodentium primijećena je u Clec12a-/- životinja. F. rodentium je gram-pozitivan, oksidaza i katalaza-negativan član grupe Firmicutes (Bacillota) (Chang et al., 2015.). Svakodnevno unošenje F. rodentium čak i WT miševima pojačava kolitis, što potvrđuje da su povećane razine F. rodentium u crijevima štetne i vjerojatno uzrokuju ozbiljnost kolitisa u Clec12a-/-. Nedavno izvješće pokazalo je da F. rodentium može povećati epitelnu promjenu i potisnuti ekspresiju enzima unutar epitela koji reguliraju upalne reakcije i stoga je u skladu s pogoršanom bolešću koju vidimo kada se F. rodentium proširi u crijevima (Cao et al., 2022). Budući da su ljudi kolonizirani organizmom sličnim F. rodentium (Zagato et al., 2020.), daljnje studije trebale bi razjasniti utjecaj ovih bakterija sličnih F. rodentiumu na aspekte ljudske fiziologije povezane s kolitisom.

Potvrđujući ulogu Clec12a među urođenim imunološkim stanicama, uočili smo da se kolitogena mikrobiota još uvijek stvara u Clec12a-/- životinjama koje nemaju adaptivni imunološki sustav. Najveći postotak stanica unutar crijeva koje izražavaju Clec12a bili su makrofagi što nas je navelo da se usredotočimo na funkciju Clec12a u tim stanicama. Prethodne studije pokazale su da je Clec12a važan medijator proizvodnje interferona tipa I kao odgovor na virusnu infekciju (Li et al., 2019.). Međutim, nije procijenjeno kako Clec12a utječe na odgovore na široki spektar bakterijskih liganada; ovo je vrlo važno u crijevima gdje postoji obilje TLR liganada. Ovdje pokazujemo da Clec12a služi za ublažavanje reakcija makrofaga u crijevima i vjerojatno funkcionira za osiguranje homeostaze kao odgovor na mikrobiotu. RNA-seq makrofaga inkubiranih s F. rodentium istaknuo je da nedostatak Clec12a dovodi do poremećaja staničnog ciklusa i fagocitoze kao odgovor na te komenzalne bakterije. Nedavna studija pokazala je da su makrofagi Clec12a-/- smanjili autofagiju kao odgovor na salmonelu (Begun et al., 2015.). Naši podaci nadopunjuju i proširuju ove nalaze kako bi uključili da Clec12a također djeluje na kontrolu neinvazivnih komenzalnih organizama. Drugi su pokazali da F. rodentium utječe na biologiju epitela, što sugerira da F. rodentium leži u neposrednoj blizini domaćina i stoga mora biti pod strogom kontrolom imunološkog sustava. Naši podaci potvrđuju da Clec12a kontrolira F. rodentium regulacijom fagocitoze. Fagocitoza se pokreće fizičkim vezanjem liganda ili mikroba, a lektini tipa C mogu se povezati s višestrukim ligandima, što nas je dovelo do testiranja može li se Clec12a izravno povezati s bakterijama koje žive u crijevima. Zanimljivo je da se Clec12a najviše vezao za gram-pozitivne organizme F. rodentium i Roseburia, a mnogo manje za gram-negativne organizme A. muciniphila i B. uniformis, a ne uopće za C. albicans. Ovi podaci pokazuju da Clec12a ima sklonost vezati specifične članove mikrobiote. To nam omogućuje da izgradimo model prema kojem uključivanje Clec12a i naknadne fagocitoze može kontrolirati određene članove mikrobiote i spriječiti potencijalno štetne učinke njihova širenja. Ovo naglašava dvostruku funkciju Clec12a koja može obuzdati upalu protiv mikrobnih liganda dok također prepoznaje i kontrolira specifične članove mikrobiote. Stoga Clec12a predstavlja jedinstveni način na koji urođeni imunološki sustav koristi kako bi osigurao homeostazu unutar gastrointestinalnog trakta.

LEGENDE FIGURE

Slika 1. Clec12a obuzdava crijevnu bolest neovisno o adaptivnom imunološkom sustavu

(A) Kako bi se procijenila ozbiljnost kolitisa WT ili Clec12a-/- C57BL/6 specifični patogeni miševi (SPF) tretirani su s 2,5% dekstran natrij sulfatom (DSS) ad libitum tijekom 7 dana u vodi za piće. Postotak gubitka težine ocjenjivan je dnevno. Srednja vrijednost +/- SEM, podaci su prikupljeni iz tri neovisna eksperimenta korištenjem dvosmjerne ANOVE i Śídákovog testa višestruke usporedbe.

(B) Duljina debelog crijeva (cm) navedenih životinja izmjerena je pri žrtvovanju. Dijagram raspršenosti je srednja vrijednost +/- SEM, podaci su prikupljeni iz tri neovisna eksperimenta pomoću neuparenog t-testa. Svaka točka predstavlja jednog miša

(C) Fekalni lipokalin-2 (ng/mL) naznačenih životinja izmjeren je kao očitanje upale. Stupčasti grafikon je srednja vrijednost +/- SEM, podaci su prikupljeni iz dva neovisna eksperimenta korištenjem neuparenog t-testa. Svaka točka predstavlja jednog miša

(D) Reprezentativni H&E obojeni dijelovi debelog crijeva indiciranih životinja nakon kolitisa izazvanog DSS-om.

(E) Histološki rezultati za navedene životinje generirani su iz presjeka debelog crijeva u

(D). Stupčasti grafikon je srednja vrijednost +/- SEM, uspoređena korištenjem neuparenog t-testa. Svaka točka predstavlja jednog miša.

(F) Model kolitisa prijenosa T stanica proveden je za procjenu kroničnog kolitisa. Težina TCRb-/- i Clec12a-/- ;TCRb-/- životinja mjerena je tjedno. Grafikon prikazuje postotak gubitka težine naznačenih životinja tijekom eksperimenta. Srednja vrijednost +/- SEM, u usporedbi s 2-way ANOVA.

(G) Duljina kolonije naznačenih životinja iz (I) izmjerena je pri žrtvovanju. Stupčasti grafikon je srednja vrijednost +/- SEM, uspoređena korištenjem neuparenog t-testa. Svaka točka predstavlja jednog miša.

(H) WT, Clec12a-/-, Rag-/- ili Rag-/-; Clec12a-/- C57BL/6 SPF miševi su procijenjeni na akutni kolitis. Indiciranim životinjama davano je 2,5% DSS ad libitum tijekom 7 dana. Postotak gubitka težine ocjenjivan je dnevno. Srednja vrijednost +/- SEM, podaci su reprezentativni za dva neovisna eksperimenta. Dvosmjerna ANOVA i Śídákov test višestruke usporedbe.

(I) Duljina debelog crijeva (cm) naznačenih životinja izmjerena je pri žrtvovanju. Stupčasti grafikon predstavlja srednju vrijednost +/- SEM, podaci su reprezentativni za dva neovisna eksperimenta koji koriste nesparene t-testove. Svaka točka predstavlja jedan miš * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001

Slika 2. Mikrobiota nastala u Clec12a-/- životinjama uzrokuje pogoršanje kolitisa

A) Transplantacije fekalne mikrobiote (FMT) izvedene su prijenosom fekalnih supernatanata iz WT ili Clec12a životinja u WT miševe bez klica. Mikrobiote su ostavljene da se homogeniziraju četiri tjedna, nakon čega je polovica WTFMT miševa i polovica Clec12a-/-FMT miševa smještena zajedno i ostavljena su još četiri tjedna da se miješaju. Sve skupine su zatim primile 2,5% DSS ad libitum u svojoj vodi za piće i žrtvovane su 7. dana.

B) Postotak gubitka težine indiciranih životinja ocjenjivan je dnevno. Grafikon prikazuje srednju vrijednost +/- SEM, podaci su prikupljeni iz dva neovisna eksperimenta korištenjem dvosmjerne ANOVE i Śídákovog testa višestruke usporedbe.

C) Duljina debelog crijeva (cm) kod naznačenih životinja izmjerena je pri žrtvovanju. Dijagram raspršenosti je srednja vrijednost +/- SEM, uspoređena korištenjem Uobičajene jednosmjerne ANOVE s Dunnettovim testom višestrukih usporedbi. Svaka točka predstavlja jednog miša.

D) Reprezentativni H&E obojeni dijelovi debelog crijeva naznačenih životinja nakon kolitisa izazvanog FMT-om i DSS-om.

E) Histološki rezultati generirani su iz presjeka debelog crijeva u (D). Stupčasti grafikon je srednja vrijednost +/- SEM, uspoređena korištenjem neuparenog t-testa. Svaka točka predstavlja jednog miša.

F) Ponderirane Unifrac udaljenosti od sekvenciranja gena 16S rRNA WTFMT, Clec12a-/- FMT ili životinja u zajedničkom smještaju. Dijagrami okvira i brkova koji prikazuju sve točke (usporedba udaljenosti po parovima) i uspoređeni Kruskal-Wallisovim testom.

G) Neponderirane Unifrac udaljenosti od sekvenciranja gena 16S rRNA WTFMT, Clec12a-/- FMT ili životinja u zajedničkom smještaju. Dijagrami okvira i brkova koji prikazuju sve točke (usporedba udaljenosti po parovima) i uspoređeni Kruskal-Wallisovim testom.

H) Bray-Curtisova udaljenost od sekvenciranja gena 16S rRNA WTFMT, Clec12a-/- FMT ili životinja u zajedničkom smještaju. Dijagrami okvira i brkova koji prikazuju sve točke (usporedba udaljenosti po parovima) i uspoređeni Kruskal-Wallisovim testom.

Slika 3: Sastav mikrobiote formiran u Clec12a-/- životinjama neovisan je o adaptivnom imunitetu

A) Shematski dijagram koji prikazuje rekonstituciju koštane srži s kasnijom FMT. C57Bl/6 WT miševi su smrtonosno ozračeni i rekonstituirani s WT ili Clec12a-/- koštanom srži. Nakon 8 tjedana, izmet je uzet od ovih miševa i prenesen u WT miševe bez klica kao što je objašnjeno u (A). Izvorno rekonstituiranim himernim životinjama je tada dano 2,5% DSS ad libitum u njihovoj vodi za piće.

B) Postotak gubitka težine FMT miševa iz (F) ocjenjivan je dnevno. Srednja vrijednost +/- SEM, koristeći dvosmjernu ANOVA i Tukey test višestruke usporedbe.

C) Duljina debelog crijeva (cm) kod naznačenih životinja izmjerena je pri žrtvovanju. Dijagram raspršenja je srednja vrijednost +/- SEM, neupareni t-test. Svaka točka predstavlja jednog miša

D) FMT-ovi za procjenu uloge adaptivnog imunološkog sustava na oblikovanje mikroba i težinu kolitisa izvedeni su prijenosom fekalnih supernatanata iz Rag-/- ili Rag-/-; Clec12a-/- SPF životinje u WT miševe bez klica kako je opisano u (A). Miševi su tretirani s 2,5% DSS tijekom 7 dana. Postotak gubitka težine ocjenjivan je dnevno. Grafikon je srednja vrijednost +/- SEM, korištenjem dvosmjerne ANOVA i Tukey testa višestruke usporedbe.

E) Duljina debelog crijeva (cm) kod naznačenih životinja u (F) je izmjerena pri žrtvovanju. Srednja vrijednost +/-, SEM u usporedbi korištenjem Ordinary One-way ANOVA i Dunnet testa višestruke usporedbe. Svaka točka predstavlja jednog miša. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001

Slika 4. Clec12a ograničava širenje glodavaca Faecalibaculum, mikroba koji pogoršava kolitis

A) WT ili Clec12a-/- C57BL/6 SPF miševi dobili su koktel antibiotika (A) (neomicin, gentamicin, ampicilin, eritromicin), cefalotin ili gentamicin (B, C) u koncentraciji 0. 5g/L tijekom četrnaest dana. Nakon sedam dana životinje su dobile 2,5% DSS u vodi za piće do žrtvovanja. Duljina debelog crijeva (cm) kod naznačenih životinja mjerena je pri žrtvovanju. Dijagram raspršenja je srednja vrijednost +/- SEM, neupareni t-test. Svaka točka predstavlja jednog miša.

B) Postotak gubitka težine indiciranih životinja ocjenjivan je dnevno. Grafikon je srednja vrijednost +/- SEM, korištenjem dvosmjerne ANOVA i Tukey testa višestruke usporedbe

C) Duljina debelog crijeva (cm) naznačenih životinja izmjerena pri žrtvovanju. Dijagram raspršenja je srednja vrijednost +/- SEM, neupareni t-test. Svaka točka predstavlja jednog miša.

D) Opažene značajke iz WT ili Clec12a-/- fecesa, 16S rRNA sekvenciranje alfa raznolikosti. Srednja vrijednost +/- SEM, u usporedbi pomoću Mann-Whitney testa.

E) Pielou Ravnost iz WT ili Clec12a-/- fecesa, 16S rRNA sekvenciranje alfa raznolikosti. Srednja vrijednost +/- SEM, u usporedbi pomoću Mann-Whitney testa.

F) Srednja vrijednost Shannonove entropije +/- SEM, uspoređena Mann-Whitneyjevim testom.

G) ANCOM analiza iz WT i Clec12a-/- fecesa. Taksonomski nazivi najbolja su klasifikacija ASV-ova pomoću baze podataka taksonomije genoma (GTDB).

H) Relativna brojnost ASV-a Faecalibaculum rodentium. Uspoređeno pomoću Mann Whitney * p < {{0}}.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001

I) C57Bl/6 WT SPF miševi prethodno su tretirani s 1x108 CFU F. rodentium oralnom sondom tri dana. Životinje su tada primale 2,5% DSS u svojoj vodi za piće tijekom 7 dana dok su nastavile svakodnevno primati F. rodentium. Postotak gubitka težine ocjenjivan je dnevno. Srednja vrijednost +/- SEM, Podaci su skupljeni od četiri odvojena eksperimenta korištenjem dvosmjerne ANOVA i Tukey testa višestruke usporedbe.

J) Duljina debelog crijeva (cm) naznačenih životinja izmjerena je pri žrtvovanju. Stupčasti grafikon je srednja vrijednost +/- SEM, Podaci su prikupljeni iz četiri odvojena eksperimenta uspoređeni korištenjem Uobičajene jednosmjerne ANOVA s Dunnet testom višestruke korekcije. Svaka točka predstavlja jednog miša. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001

Slika 5. Clec12a ograničava upalu i potiče fagocitozu u makrofagima.

A) Imunofenotipizacija je provedena putem protočne citometrije na stanicama izoliranim iz lamine proprije debelog crijeva (cLP) na WT i Clec12a-/- životinjama. Toplinska karta pokazuje učestalost ekspresije Clec12a na urođenim i adaptivnim imunološkim stanicama

B) Stupčasti grafikon prikazuje učestalost pred-vrata, CD38+ stanica (M1 makrofaga) iz cLP-a navedenih životinja. Srednja vrijednost +/- SEM, uspoređena korištenjem neuparenog t-testa. Svaka točka predstavlja jednog miša.

C) Stupčasti grafikon prikazuje učestalost pred-vrata, EGR2+ stanica (M2 makrofaga) iz cLP-a navedenih životinja. Srednja vrijednost +/- SEM, uspoređena korištenjem neuparenog t-testa. Svaka točka predstavlja jednog miša.

D) BMDM su sakupljeni iz WT i Clec12a-/- dugih kostiju i uzgajani u prisutnosti M-CSF (20 ng/mL) tijekom 7 dana. Osmog dana BMDM-ovi su pulsirani LPS-om (100 ng/mL), MDP-om (10 mg/mL), Pam3cyskom (1 mg/mL) ili Flagellinom (1 mg/mL) tijekom 24 sata. Medij je sakupljen i testiran na proizvodnju citokina. Toplinska karta pokazuje Log2 putanju promjene naznačenih citokina iz Clec12a-/- u odnosu na WT.

E) BMDM iz WT i Clec12a-/- miševa izolirani su i uzgojeni kao u (A), a zatim sukultivirani s F. rodentium pri MOI od 10 tijekom 24 sata. Nakon što su BMDM isprani, RNA je sakupljena i pripremljena za RNA sekvenciranje. Top 10 pojednostavljenih kategorija GO izraza (biološki proces) obogaćenih među Clec12a-/- smanjenom regulacijom

F) Peritonealni makrofagi su izolirani iz WT i Clec12a-/- miševa, a zatim sukultivirani sa Sybr zeleno obojenim F. rodentium kako bi se procijenila fagocitoza. Lijevo: WT makrofagi. Desno: Clec12a-/- makrofagi. Prikazane su reprezentativne slike iz svijetlog polja (lijevi stupci), fluorescencije (srednji stupci) i spojene (desni stupci). Žuti vrhovi strelica označavaju primjere stanica F. rodentium progutanih makrofagima. skala=20 µm. Slike predstavljaju dva odvojena eksperimenta.

G) Stupčasti grafikon prikazuje organizme po stanici, kao što se vidi na (F). 250 WT stanica i 269 Clec12a-/- stanica izbrojano je kako bi se kvantificirala količina F. rodentium po stanici.

Slika 6: Clec12a izravno se veže na određene članove mikrobiote.

A) Shematski dijagram koji prikazuje Clec12a-ljudski IgG1-Fc fuzijski protein ili prazan vektor (samo Fc dio) B) Histogrami protočne citometrijske analize koji predstavljaju diferencijalno vezanje Clec12a-Fc na različite bakterije ili C. albicans.

DODATNE LEGENDE SLIKA

Dopunska slika 1. Odsutnost Clec12a ne remeti razine mokraćne kiseline.

A) Izmjerena je serumska mokraćna kiselina (µM) naznačenih životinja kako bi se procijenio metabolizam purina između WT i Clec12a-/- C57Bl/6 miševa. Dijagram raspršenosti je srednja vrijednost +/- SEM, podaci su prikupljeni iz tri neovisna eksperimenta korištenjem neuparenog t-testa. Svaka točka predstavlja jednog miša.

B) Izmjerena je fekalna mokraćna kiselina (µM) naznačenih životinja kako bi se procijenilo izlučivanje mokraćne kiseline iz crijeva između WT i Clec12a-/- C57Bl/6 miševa. Dijagram raspršenosti je srednja vrijednost +/- SEM, podaci su prikupljeni iz tri neovisna eksperimenta korištenjem neuparenog t-testa. Svaka točka predstavlja jednog miša.

Dodatna slika 2. WT i Clec12a-/- mikrobiote uzrokuju diferencijalnu bolest

Postotak gubitka težine WT i Clec12a-/- životinja liječenih antibiotskim koktelom koji se sastoji od neomicina, gentamicina, ampicilina i eritromicina.

Dodatna slika 3. Na sastav mikrobiote utječe Clec12a.

A) PCoA dijagrami prve 3 osi temeljeni na Bray-Curtisovim udaljenostima koji pokazuju sveukupne odnose mikrobiote i odgovarajuće dijagrame okvira i brkova koji kvantificiraju razlike unutar svake skupine i uspoređuju se s Mann-Whitneyevim testom.

B) PCoA dijagrami koji se temelje na ponderiranim Unifrac udaljenostima i odgovarajućim kvadratićima i dijagramima brkova koji kvantificiraju različitost unutar grupe u usporedbi korištenjem neuparenog Mann-Whitneyevog testa.

C) Tablica koja prikazuje rezultate PERMANOVA testa za WT u odnosu na Clec12a-/- fekalnu mikrobiotu s Bray-Curtisovim i ponderiranim Unifrac udaljenostima.

Dodatna slika 4: Clec12a u makrofagima ograničava upalu.

A) Violin grafikoni prikazuju geometrijski srednji fluorescentni intenzitet (MFI) imunoloških stanica prikazanih u (A). Srednja vrijednost +/- SEM, Kruskal-Wallisov test s Dunnovom korekcijom za višestruke usporedbe. Slova označavaju skupine koje se bitno razlikuju.

B) Reprezentativni dijagrami protočne citometrije M1 i M2 makrofaga iz cLP WT ili Clec12a-/- miševa nakon DSS kolitisa. Stanice su prethodno zatvorene na live, CD45+, Ly6C-, CD11b+, MHCII+ i CD64+. Sa slike 5A

Dodatna slika 5. Clec12a stabilizira kontrolu staničnog ciklusa i regulira fagocitozu u makrofagima.

A) Top 10 pojednostavljenih kategorija pojmova GO (biološki proces) obogaćenih Clec12a-/- pojačano reguliranim genima u usporedbi s WT kao odgovor na F. rodentium. BMDM iz WT i Clec12a-/- miševa kokultiviranih s F. rodentium izolirani su i analizirani kao na slici 7A.

B) Peritoneal macrophages were prepared as described and co-cultured with Sybr®-green stained F. rodentium. Bacteria cells were counted inside macrophages. >Izbrojano je 200 makrofaga. Stupčasti grafikon prikazuje prosječan broj F. rodentium iz 4 pojedinačne jažice kako bi se prikazala dosljednost brojanja i učinka na sve jažice. Srednja vrijednost +/- SEM u usporedbi korištenjem neuparenog t-testa.

ZAHVALA

Željeli bismo zahvaliti Gordonu Brownu što je osigurao Clec12a-/- životinje za ovaj projekt. Ovaj rad podržali su Zaklada Helen Hay Whitney (KSO), NRSA Microbial Pathogenesis T32 Training Grant (KSO) Sveučilišta u Utahu, CCFA Senior Research Award (JLR), NIDDK R01DK124336, NIDDK R01124317 i NCCAM R01AT011423 (JLR), Edward Mallinckrodt Jr. Foundation (JLR), NSF nagrada za KARIJERU (IOS-1253278) (JLR), Packard Fellowship in Science and Engineering (JLR), Burroughs Welcome Investigator in Pathogenesis Award (JLR), American Asthma Foundation (JLR), Margolis Zaklada (JLR), grant MS Society Center (JLR) i Zaklada WM Keck (JLR) NIH nagrada za nove inovatore DP2GM111099-01 (RMO), NHLBI R00HL102228-05 ( RMO), stipendija Američkog društva za istraživanje raka (RMO), nagrada Kimmel Scholar (RMO), R01AG047956 (RMO) i NIAID R01AI141202 (ASI). Ovaj je rad podržala ustanova za protočnu citometriju Sveučilišta Utah uz Nacionalni institut za rak kroz nagradu broj 5P30CA042014-24. Zahvaljujemo se na podršci i resursima Centra za računalstvo visokih performansi na Sveučilištu Utah.

AUTORSKI PRILOZI

TRC je pomogao osmisliti studiju, izveo većinu pokusa s miševima i imunoloških eksperimenata, spojio podatke u brojke i pomogao napisati rukopis. RB je postavio pokuse bez klica i održavao sve životinje bez klica. ESV je pomogao u imunološkim eksperimentima s laminom propriom crijeva. KSO je pomogao u žetvi miševa i pružio uvid i smjernice. KMB je pomogao u sakupljanju miševa i protočnoj citometriji. MCN je pomogao u žetvi miševa. WV je pružio pomoć u izgradnji konstrukta za fuzijski protein i pročišćavanju. TJ je pružio pomoć u ispitivanju fagocitoze. JH analizirao mikroskopske stakalce fagocitoze. MH je pružio pomoć u pročišćavanju i upotrebi fuzijskog proteina. KAK osigurava izolate bakterija. ROC je pružio imunološku ekspertizu i uvid. WZS je pomogao osmisliti studiju, proveo je bioinformatičke analize, pomogao u pripremi slika i statistike te pomogao napisati rukopis. JLR je pomogao osmisliti i usmjeriti studiju, nadzirao eksperimentalni dizajn i rezultate, organizirao suradnike i reagense, prikupio sredstva za studiju i pomogao napisati rukopis.

METODE

Mišji sojevi

Sve ovdje korištene mišje linije bile su na pozadini C57BL/6. Clec12a-/- miševe ljubazno je ustupio Gordon Brown (Medical Research Council Center for Medical Mycology, University of Exeter) i genotip im je bio u skladu s njihovim prethodno opisanim protokolom (Redelinghuys, et al. 2016.). Rag2-/- i TCRb-/- (Jackson Laboratories, 002118) dobiveni su od Jackson Laboratories i održavani u našoj koloniji miševa nekoliko generacija. Za sve pokuse in vivo kolitisa korišteni su miševi spolno podudarnog spola stari 8 do 12- tjedana. Korišteni su i mužjaci i ženke miševa. Miševi su držani u specifičnim uvjetima bez patogena.

Bakterijski i gljivični sojevi

Sljedeći organizmi nabavljeni su iz DSMZ-njemačke zbirke mikroorganizama i staničnih kultura GmbH: Faecalibaculum rodentium (DSM# 103405); Akkermansia mucinophilia DSMZ (DSM# 26127); Bifidobacterium animalis DSMZ (DSM# 26074). Bacteroides uniformis je nabavljen iz American Type Culture Collection (ATCC® 8492™). Roseburia sp (oznaka soja JLR.KK002) izolirana je na Schaedlerovom agaru iz C57BL/6 miševa koji sadrže mikrobiotu obogaćenu sporama. Obogaćivanje sporama provedeno je kako je prethodno opisano, a miševi su održavani više generacija s ovom mikrobiotom u našem gnotobiotičkom objektu prije nego što je JLR.KK002 izoliran iz izmeta (Browne et al., 2016.). PCR-om smo pojačali, a Sanger je sekvencionirao gen 16S rRNA i zatim ga klasificirao uslugom SILVA ACT i bazom podataka SILVA (Pruesse et al., 2012.). Korišten je soj Salmonella typhimurimum ST2. Korišten je soj Candida albicans sc5314. Bakterijski sojevi koji se koriste u sintetičkoj zajednici PhyLo11b opisani su u nastavku.

DSS-inducirani eksperimentalni kolitis

Kolitis je izazvan dodatkom 2,5% ili 3% (w/v) 36,000-50,000MW dekstran natrij sulfata (DSS) (MP Biomedicals) u vodi za piće tijekom 7 dana. Ozbiljnost kolitisa praćena je svakodnevno kroz promjene tjelesne težine, konzistencije stolice i fekalne krvi. Za eksperiment spašavanja monocita svi su miševi primali 2,5% DSS tijekom 5 dana, nakon čega im je dana redovita voda; praćenje težine se nastavilo do 10. dana kada su životinje sakupljene. Granice ozbiljnosti veće od 20% gubitka težine nametnute su kao prag ozbiljnosti. Na krajnjim točkama eksperimenta uklonjeni su MLN i debelo crijevo. Debelo crijevo je mjereno od cekuma do rektuma kako bi se odredila duljina. Tkiva su zatim obrađena za histologiju, ekstrakciju RNA ili protočnu citometrijsku analizu.

Histologija debelog crijeva i bodovanje

Colons were fixed within histology cassettes O/N at RT in 10% buffered formalin phosphate solution after removal of fecal contents and then transferred to 70% EtOH at 4 C until staining. Sectioning and H&E staining were done at the HCI Biorepository and Molecular Pathology Resource core in the ARUP-operated Research Histology division. Colon scoring was done in a blinded manner with the following rubric scales: percentage of colon crypt loss (0.5 (5%) - 7 (>75%)), crypt loss severity (1 (partial loss) – 5 (full loss)) and inflammatory aggregates (1 (1-3) – 3 (>7)).

Lipocalin-2 (LCN-2) ELISA

Protokol je proveden u skladu s protokolom proizvođača (Fischer Scientific DY1857-05). Ukratko, izmet je sakupljen, izvagan i zgnječen u HBSS 1X u koncentraciji od 100 mg/mL. Uzorci su tada centrifugirani na 50 xg tijekom 5 minuta kako bi se uklonili veliki ostaci. Supernatant je zatim uklonjen i stavljen u novu epruvetu i vrtio se na 8000 xg 5 minuta kako bi se taložile bakterije. Ovaj supernatant je zatim razrijeđen prema bolesti životinja, ali je općenito bio u rasponu od 1:100- 500 (zdrave) – 1:500-1000 (tretirane DSS-om). Mjerenje mokraćne kiseline Koncentracija mokraćne kiseline izvedena je prema uputama proizvođača (Invitrogen™ Amplex™ Red Uric/Uricase act assay kit, cat# A22181). Ukratko, krv je sakupljena iz WT ili Clec12a-/- miševa srčanom punkcijom u epruvete za odvajanje seruma sa zlatnim vrhom. Epruvete su ostavljene da se zgrušaju 30 minuta, a zatim su okretane na 1300 xg 10 minuta. Serum je uklonjen i stavljen u Eppendorfove epruvete od 1,5 ml, brzo zamrznut i pohranjen na -80 stupnjeva Celzija do testiranja. Fekalna mokraćna kiselina je određena dobivanjem svježih fekalnih peleta iz WT i Clec12-/- miševa. Peleti su izvagani i zabilježeni, a zatim usitnjeni u 1 mL 1x reakcijskog pufera. Nakon fizičkog gnječenja, epruvete su okretane na 50 xg 5 minuta kako bi se uklonili veliki ostaci. Preostala fekalna kaša je ispitana na mokraćnu kiselinu.

Eksperimentalni kolitis prijenosa T-stanica

WT slezene su izolirane i zgnječene u RPMI koji je sadržavao 10% fetalnog goveđeg seruma, penicilina i streptomicina. Stanice su centrifugirane na 367 xg da se izoliraju stanice. Dobiveni talog je zatim suspendiran u 1x RBC puferu za lizu 5 minuta, u mraku, na sobnoj temperaturi. Dobivene bijele krvne stanice zatim su propuštene kroz kolonu Miltenyi CD4+ MACS da se izoliraju CD4+ T-stanice. T-stanice su zatim obojene s CD4 i CDRB i sortirane na FACS Aria Fusion (BD Biosciences). CD4+ CDRBhi stanice su sakupljene i primijenjene na TCRb-/- ili TCRb-/-; Clec12a-/- miševi intraperitonealno (IP). Svaki miš je dobio 5 x 105 stanica. Ozbiljnost i razvoj kolitisa praćeni su tjedno procjenom gubitka težine. Na krajnjoj točki eksperimenta, MLN-ovi i debelo crijevo su uklonjeni, a debelo crijevo izmjereno od cekuma do rektuma kako bi se procijenila ozbiljnost bolesti.

Izolacija leukocita iz lamine proprije debelog crijeva

Mišja crijeva s pričvršćenim cecama su sakupljena i stavljena u 1X PBS u 6-jažične ploče na ledu. Svako vidljivo preostalo masno i vezivno tkivo je uklonjeno, a cekum je izrezan iz debelog crijeva. Debela crijeva su otvorena, a sluz i izmet pažljivo su uklonjeni iz debelog crijeva prije nego što su ponovno stavljeni u 6-ploču s jažicama. Nakon što su sva crijeva raširena i ostrugana, svako crijevo je narezano na poklopcu Petrijeve zdjelice pomoću oštrice i stavljeno u zasebnu epruvetu od 50 mL. Dodano je 10 mL prethodno zagrijane otopine za disocijaciju (1X HBSS bez Ca+ i Mg+, 1,5 mM DTT, 10 mM HEPES i 30 mM EDTA) i epruvete su kratko promiješane. Koloni su inkubirani otprilike 25 minuta. na 37 stupnjeva uz mućkanje na 150 okretaja u minuti dok otopine nisu postale mutne od IEC odvajanja. Uzorci su protreseni 3X i vorteksirani 15 sekundi, zatim su izliveni preko 100 mM filtera na konus od 50 ml da se uklone neimune stanice kao što su IEC, a filteri su kratko isprani sa 2 mL ledeno hladnog 1X PBS. Preostalo tkivo je sakupljeno na filtru pincetom i premješteno u novu koničnu posudu od 50 mL. 15 mL prethodno zagrijane otopine za probavu (1X HBSS s Ca+ i Mg, 5% FBS, 50 U/ml Dispase II [Millipore-Sigma, kat. br. 4942078001], 0,5 mg/ml DNAse I [Worthington Biochemical, kat. br. LS002139] i 0,5 mg/mL kolagenaze D [Millipore-Sigma, kat br. 11088866001]) je dodano, uzorci su kratko promiješani, a potom inkubirani 45 minuta. na 37 stupnjeva uz mućkanje pri 150 okretaja u minuti, ili dok otopina ne postane mutna. Uzorci su zatim protreseni 3X i vorteksirani 15 sekundi. Kako bi se prikupile preostale imunološke cLP stanice, probavljeno tkivo je zatim izliveno preko 40 mM filtera na konusnu epruvetu od 50 mL koja je sadržavala 10 mL 1X PBS. Uzorci se zatim isperu i filtriraju s 2 mL ledeno hladnog 1X PBS-a i vrte se na 800 xg 10 minuta na 4 stupnja. Zatim je supernatant uklonjen i odbačen vakuumom. Stanice su zatim resuspendirane u 500 ml potpunog RPMI i prebrojane uz isključeno bojenje Trypan blue.

Protočna citometrija

Leukociti izolirani iz cLP-a obojeni su na održivost pomoću zombi boje 510 (AmCyan) 10 minuta na sobnoj temperaturi u mraku. Uzorci su zatim blokirani Fc receptorom s CD-16/32 20 minuta na 4 stupnja u mraku. Nakon centrifugiranja na 367 xg tijekom 5 minuta dekantirane stanice su obojene 30 minuta u mraku na 4 stupnja. Sva antitijela su korištena u razrjeđenju od 1:250 osim ako nije drugačije navedeno. Myleloid ploča sastojala se od CD45-BV421, CD11b-PerCpCy5.5, MHCII-BV605, CD64-BV711, CX3CR1-BV785, Ly6C-FITC, CD38-PE- Cy7, Ly6G-CF-594, Clec12a-PE (1:500), EGR2-APC (unutarstanični, 1:50). T stanice su se razlikovale po: Zombie boji 510 (AmCyan), CD45-BV421, CD3e-BV711, CD4-FITC, Foxp3-APC (intracelularno 1:50), IL{{ 50}}PE (unutarstanični 1:50), IFN-g (BV605) (unutarstanični 1:50), RORgt-PE610 (unutarstanični 1:50), IL-17A-BV785 (unutarstanični 1:50). Nakon bojenja, stanice su isprane 2 puta po 5 minuta s puferom u koloni (1X HBSS bez Ca2+, Mg2+ i HEPES, EDTA, FBS). Stanice su fiksirane O/N s 2% PFA ako nije bilo potrebno intracelularno bojenje, a zatim su isprane u puferu kolone 2X prije pokretanja na protočnom citometru. Ako je unutarstanično bojenje bilo potrebno, slijedili su se FoxP3 / komplet pufera za bojenje transkripcijskih faktora (Tonbo Biosciences) i protokol. Svi su uzorci zatim resuspendirani u 300 ul kolonskog pufera i testirani na BD LSR Fortessa nakon kompenzacije s UltraComp eBeads (ThermoFisher Scientific) i korištenja pojedinačnih kontrola mrlja.

IgA bojenje bakterija

Bakterije su izolirane iz fekalnih peleta miješanjem u HBSS w/ Ca2+ i Mg2+, u koncentraciji od 100 mg fecesa po mL HBSS. Zgnječeni izmet je zatim centrifugiran na 50 xg tijekom 5 minuta da se uklone veliki ostaci. Supernatant je uklonjen i stavljen u novu epruvetu. To je zatim centrifugirano na 8000 xg tijekom 5 minuta da se talože bakterije. Supernatant je uklonjen i peleti su isprani u HBSS w/ Ca2+ i Mg2+. Konačno, pelete su resuspendirane u HBSS-u u koncentraciji od 100 mg/mL, a 10 uL toga stavljeno je u 96-ploču s jažicama i blokirano s HBSS-om s Ca2+ i Mg2+ koji sadrži 10% FBS tijekom 20 minuta na sobnoj temperaturi. 100 uL anti-IgA (PE) je zatim dodano izravno u uzorak i inkubirano 30 minuta na 4 C u mraku. Stanice su zatim isprane u otopini HBSS+FBS 2x i na kraju resuspendirane u HBSS+1x Sybr®-green i ostavljene da se inkubiraju 20 minuta u mraku na sobnoj temperaturi. Uzorci su potom izravno očitani na protočnom citometru.

Izolacija koštane srži

Koštana srž je izolirana kao što je prethodno opisano. Ukratko, duge kosti C57Bl/6 Divljeg tipa ili Clec12a-/- životinja izvađene su i očišćene papirnatim ručnikom blagim trljanjem. Čiste kosti držane su na ledu dok su životinje obrađene. Krajevi kostiju su lagano odrezani kako bi se otkrila srž. Kost je umetnuta (izloženi kraj okrenut prema dolje) u 0.5mL Eppendorf epruvetu koja je probušena iglom od 18g. Ova Eppendorfova epruveta od 0.5 mL stavljena je u Eppendorfovu epruvetu od 1,5 mL i vrtjela se na 13,{13}} x g 1 minutu. Provučena kroz koštanu srž zatim je lizirana eritrocitima, korištenjem pufera za lizu eritrocita (Biolegend) prema preporukama proizvođača. Nakon lize eritrocita, stanice su resuspendirane u potpunom Dulbecco modificiranom Eagle mediju (DMEM) koji sadrži: 10% FBS, 1 mg/mL Pen/Strep, HEPES 10 mM, 1x neesencijalnu aminokiselinu, natrijev piruvat 1 mM. Stanice su tada centrifugirane na 367 xg pet minuta da se stanice talože. Izolirane stanice su zatim korištene za razvoj BMDM-a ili za daljnju izolaciju monocita.

Makrofagi koji potječu iz koštane srži

Leukociti su izolirani iz izolacije koštane srži, suspendirani u kompletnom DMEM-u i prebrojani pomoću isključenog bojenja tripan plavim na hemocitometru. Stanice su nasađene na zdjelice od 10 cm tretirane kulturom tkiva u koncentraciji od 5-8 x 106 stanica/ploči u 10 mL kompletnog medija + M-CSF (20 ng/mL). Svježi mediji, uključujući M-CSF, dodani su postojećim medijima 4. i 7. dana. Potpuno diferencirani BMDM-ovi korišteni su za eksperimentalnu upotrebu između dana 7-9.

Izolacija monocita

Koštana srž je sakupljena iz WT i Clec12a-/- životinja kao što je prethodno opisano. Monociti su izolirani s Monocyte Isolation Kit (BM), mišem (Miltenyi Biotec) i LS MACS kolonom prema uputama proizvođača.

F. rodentium BMDM kokultura i RNAseq

Kulture F. rodentium kvantificirane su pomoću OD 600 nm (upotrebom 1 OD 600 nm=1 x 10^8 stanica/mL), isprane 2x u sterilnom PBS-u i kokultivirane s 1 x 106 stanica/mL potpuno diferenciranih BMDM-ova na MOI od 10 u 6-pločama za kulturu tkiva s jažicama. Nakon 24 sata zajedničkog uzgoja, medij je sakupljen i pohranjen na -20 C do daljnje upotrebe. BMDM su isprani hladnim, sterilnim PBS-om, 2x. Qiazol (Qiagen cat# 79306) RNA-stabilizacijski reagens je zatim dodan izravno u svaku jažicu. Jažice su sastrugane strugačem za stanice sakupljene u 1,5 Eppendorfove epruvete i zamrznute na -20 stupnjeva do ekstrakcije RNA. Ekstrakcija RNA provedena je korištenjem kompleta Direct-zol RNA miniprep (Zymo Research kat. br. R2070) u skladu s uputama proizvođača, a biblioteke sekvenciranja pripremio je temeljni pogon Huntsman Cancer Institute High-throughput Genomics. Ukupna RNA prvo je hibridizirana s NEBNext rRNA Depletion kit v2 (NEB, cat# E7400) kako bi se smanjila rRNA iz uzoraka. Biblioteke sekvenciranja nasukane RNA pripremljene su korištenjem NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit za Illumina (NEB, br. kat. E7760L). Pročišćene biblioteke su kvalificirane na Agilent Technologies 4150 TapeStation pomoću D1000 ScreenTape testa (Agilent, cat# 5067-5582 i 5067-5583). Molarnost adapterom modificiranih molekula definirana je kvantitativnom PCR uporabom Kapa Biosystems Kapa Library Quant Kit (Roche, cat#07960140001). Pojedinačne biblioteke normalizirane su na 5 nM u pripremi za Illumina analizu sekvence i sekvencirane na NovaSeq 6000 s parnim završetkom 150-ciklusa sekvenciranja.

Analiza citokina

BMDM su izolirani i uzgajani kao što je prethodno opisano. Potpuno diferencirani BMDM-ovi stavljeni su na 1 x 105 stanica/jažici u 12-pločice za kulture tkiva. BMDM su stimulirani sa 100 ng/mL LPS; 1 ug/mL Pam3Cysk; ili 1 ug/mL flagelina. Stanice su stimulirane 24 sata, medij je sakupljen i spremljen na -20 C za analizu. Citokini su analizirani s LEGENDplex™ Mouse Inflammation Panel (13-plex) (Biolegend, cat# 740150). Podaci su analizirani pomoću LEGENDplex™ softvera za analizu podataka.

Sekvenciranje gena 16s rRNA

Fekalne kuglice ili sadržaj ileuma prikupljeni su od pojedinačnih miševa i odmah zamrznuti na {{0}} stupnjeva u epruvetama s navojnim čepom od 2 mL koje sadrže 250 mg granatnih kuglica od 0,15 mm (MoBio, kat. br. {{5) }}). DNK je ekstrahirana korištenjem Power Fecal DNA Isolation Kit (MoBio ili QIAGEN), prema uputama za komplet, i uključivala je 2 ciklusa od 1 minute mućenja kuglica na 4 stupnja na Mini-Bead-Beater 16 (BioSpec Products). Regije V3 i V4 gena 16S rRNA umnožene su jednom rundom PCR-a pomoću početnica koje su sadržavale (opisane 3' do 5') ciljanu sekvencu gena 16S rRNA regije V3/4, nakon čega je slijedio 2-nukleotidni jastučić sekvencama početnica Illumina, 8- sekvencom nukleotidnog indeksa i preostalom sekvencom adaptera Illumina. V3/4 16S-ciljane sekvence preuzete su od Takahashija (Takahashi et al., 2014), a indeksi su preuzeti od Kozicha (Kozich et al., 2013). Korištene pune oligonukleotidne sekvence bile su (indeksi označeni s Xs): Prok16SV34_Za: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXXXXACACTCTTTCCTACACGACGCTC TTCCGATCTTGCCTACGGGNBGCASCAG; Prok16SV34_Rev: CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCC GATCTGCGACTACNVGGGTATCTAATCC. Uvjeti PCR ciklusa bili su sljedeći: početna denaturacija od 98 stupnjeva tijekom 2 minute; 26 ciklusa od 20 sekundi denaturacije od 98 stupnjeva, 20 sekundi žarenja od 51,5 stupnjeva, 20 sekundi ekstenzije od 72 stupnja; i jedno konačno produženje od 72 stupnja u trajanju od 2 minute. Svaki PCR (proveden u triplikatu za svaki uzorak) učinjen je u volumenu od 25 ul upotrebom Q5 High-Fidelity 2X Master Mix (NEB, kat. br. M0492L), 5 pmol svakog primera i 50 ng uzorka DNA. Nakon amplifikacije, triplikati PCR-a iz svakog uzorka su skupljeni, 5 ul je testirano na agaroznom gelu da se potvrdi amplifikacija, a preostali volumen je očišćen pomoću Axygen AxyPrep MAG PCR zrna za čišćenje (Corning, kat. br. MAG-PCR-CL{{53). }}) razrijeđen do 62,5% u vodi kako bi se učinkovito uklonio svaki dimer početnica koji bi se preferencijalno sekvencirao. Dodane su razrijeđene kuglice u 1,8X volumenu PCR reakcija, očišćene prema smjernicama proizvođača i očišćeni amlikoni eluirani s 25 ul 10 mM Tris-Cl, pH 8,0. Amplikoni su zatim kvantificirani pico green dsDNA testom (ThermoFisher, cat #P11495) na čitaču mikropločica, a zatim su očišćene i indeksirane pojedinačne biblioteke sekvenciranja ravnomjerno multipleksirane (po ng DNA) i sekvencionirane na instrumentu Illumina MiSeq u uparenom kraju Način rada od 300 ciklusa u objektu zajedničkih resursa High-Throughput Genomics Instituta za rak Huntsman.

Bioinformatička obrada sekvenci podataka

Neobrađena očitavanja gena 16S rRNA demultipleksirana su dopuštajući 0 nepodudaranja u indeksima, a zatim obrađena i analizirana unutar okvira QIIME2 (Bolyen i sur., 2019.) kao što smo prethodno opisali (Stephens i sur., 2021.). Ukratko, demultipleksirane i kvalitetno filtrirane sekvence prvo su odrezane od sekvenci primera i povezivača s dodatkom Cutadapt, a zatim su uklonjene buke s DADA2 (Callahan et al., 2016; Martin, 2011). Taksonomije su zatim dodijeljene ASV-ovima metodom classifysklearn u dodatku za klasifikator značajki, nasuprot referentnom skupu GTDB (izdanje 89) skraćenom na pojačanu regiju V3/4 i obučenom metodom fit-classifier-naive-bayes (Bokulich et al. , 2018; Parks i sur., 2018; Pedregosa i sur., 2011). Mjerni podaci o raznolikosti, udaljenosti i statistička značajnost grupiranja beta raznolikosti prema permanovi izračunati su unutar QIIME2 (Anderson, 2001.).

Za RNA-seq BMDM-ova, neobrađena očitanja bila su prvo kvalitetna i prilagođena adapterom korištenjem trima u izobilju, a zatim su brojevi transkripata kvantificirani korištenjem Salmona u odnosu na transkriptom iz sklopa GRCm38 (mm10) (Patro et al., 2{{ 16}}17). Kvantifikacije razine transkripta očitane su u R pomoću vremenskog paketa i sažete u brojčane razine gena prije diferencijalne analize ekspresije s DESeq2 pomoću formule dizajna '~ Genotip + Liječenje + Genotip: Liječenje' (Love et al., 2014; Love et al., 2020). Diferencijalni odgovori na F. rodentium predstavljali su razliku između odgovora svakog genotipa na tretman živom bakterijom F. rodentium u odnosu na stanice tretirane kontrolom nosačem. Značajno različito izraženi geni definirani su kao oni s prilagođenom p-vrijednošću < 0,05 i log2 fold-change > |0,58| (1,5 puta promjena). Značajno regulirani prema dolje i prema gore regulirani popisi gena zatim su korišteni za testiranje obogaćivanja termina genske ontologije (GO) pomoću paketa clusterProfiler uključujući funkciju pojednostavljenja za smanjenje redundantnosti termina GO i identificiranje ključnih bioloških procesa (S, 2020; Wu et al. ., 2021).

F. rodentium DSS izazov

F. rodentium je uzgajan kao što je prethodno opisano i kvantificiran do 1 x 109 CFU/mL u sterilnom PBS-u. F. rodentium je fiksiran prvim ispiranjem 2x u sterilnom PBS-u i zatim resuspendiranjem u 1 mL 10% Fomalin-PBS-a tijekom 10 minuta. Stanice su zatim isprane još dva puta u 10 mL sterilnog PBS-a da se pripreme za oralnu sondu. Nefiksirane su isprane kao i fiksirane stanice i držane na ledu do gavaže. WT C57BL/6 SPF miševi oralno su mjereni sa 100 uL otopine koja je sadržavala ili sam PBS (nosač), F. rodentium (živ) ili F. rodentium (fiksan) od dana -3 do 10. Životinjama je dano 3,0% DSS na dane 0-7; svježa DSS voda zamijenjena je svaki drugi dan. Granice ozbiljnosti veće od 20% gubitka težine nametnute su kao prag ozbiljnosti. Na krajnjim točkama eksperimenta uklonjeni su MLN i debelo crijevo. Debelo crijevo je mjereno od cekuma do rektuma kako bi se odredila duljina. Tkiva su zatim obrađena za histologiju, ekstrakciju RNA ili protočnu citometrijsku analizu.

Određivanje fagocitoze

Peritonealni makrofagi izolirani su ubrizgavanjem 5 mL sterilnog PBS-a u peritonealnu šupljinu. PBS je lagano protresan dok je bio u šupljini svakih nekoliko sekundi. Nakon 2 minute, PBS je izvučen iglom veličine 28 i raspodijeljen u hladni kompletni DMEM. Stanice su centrifugirane na 367 xg i isprane u potpunom mediju. Stanice su zatim izbrojane hemocitometrom i stavljene u 12-pločice za kulture tkiva u koncentraciji od 2,5 x 105 stanica/mL. Stanice su ostavljene da prianjaju preko noći. Sljedeći dan, jažice su lagano miješane vrtloženjem i medij je aspiriran. Prilijepljene stanice su zatim isprane dva puta s 500 uL hladnog, sterilnog, PBS-a. Prethodno zagrijani potpuni DMEM koji je sadržavao F. rodentium na MOI od 10 je zatim dodan adherentu (makrofagi). Ploče su zatim lagano centrifugirane na 200 xg, na sobnoj temperaturi tri minute i zatim inkubirane pod standardnim uvjetima stanične kulture (37 C, 5% CO2) 90 minuta. F. rodentium je pripremljen kao što je opisano za ko-kulturu BMDM samo za sekvenciranje RNA, nakon ispiranja, stanice su resuspendirane u 1x Sybr® zelenom (Sigma-Aldrich CAS: 163795-75-3), na sobnoj temperaturi 20 minuta. Bakterijske stanice su zatim peletirane pri 4000 okretaja u minuti tijekom 5 minuta, resuspendirane s kompletnim DMEM i prethodno zagrijane za peritonealne makrofage. Nakon 90 minuta kokulture, medij je aspiriran, a stanice su dvaput isprane hladnim, sterilnim PBS-om. Prilijepljene stanice koje sadrže Sybr® zeleno obojenu F. rodentium fiksirane su s 2% paraformaldehidom (PFA) 10 minuta. PFA je aspiriran i sterilni PBS je stavljen na stanice. Stanice su zatim slikane za fagocitozu F. rodentium

Analiza slike makrofaga

Slike svijetlog polja i fluorescentne slike kultura makrofaga tretiranih F. rodentiumom snimljene su pomoću EVOS m7000 Imaging System (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Za svaku kulturu snimljeno je tri do pet odvojenih nasumičnih slika, koje su izvedene u tri primjerka.

Images were blinded and quantified using the software Fiji (Schindelin et al., 2012). Individual bacteria and macrophages were easily distinguished based on size. The total number of bacteria that were associated with (touching or overlapping with) single macrophages was quantified for a randomized subset of cells within the image. Equal numbers of cells were quantified between genotypes (n>200).

CLEC12A-Fc konstrukcija fuzijskog proteina and pročišćavatina

cDNA koje kodiraju izvanstanične domene mišjeg Clec12a umnožene su PCR-om iz bijelih krvnih stanica izoliranih iz C57Bl/6 WT SPF koštane srži i potvrđene sekvenciranjem. cDNA su spojene na C kraj humanog IgG1-Fc u ekspresijskom vektoru pFuse-hIgG1- Fc2 (InvivoGen). Konstrukti koji sadrže Clec12a ili prazan vektor transficirani su u Lx293 stanice uzgojene s DMEM +10% FBS i Pen/strep (1 mg/mL). Izlučeni fuzijski proteini sakupljeni su iz medija 24-48 nakon transfekcije. Medij je centrifugiran na 367 xg tijekom 5 minuta da se uklone ostaci/mrtve stanice, a supernatant je zamrznut na -20 C do upotrebe. Fuzijski proteini Clec12a-Fc ili samo Fc izolirani su s Pierce™ Classic Magnetic IP/Co-IP kitom (Thermo Fisher Scientific, kataloški broj: 88804), kvantificirani s Pierce™ BCA kompletom za analizu proteina (Thermo Fisher Scientific kataloški broj: 23227) i potvrđeno Western blotom korištenjem antiClec12a protutijela (Novus Biologicals NBP2-27346SS).

Clec12a-Fc-test vezanja

Pročišćeni konstrukti razrijeđeni su do 0.4 mg/mL u HBSS w/ Ca2+ i Mg2+. Bakterije su uzgajane u odgovarajućim medijima i aerobnim uvjetima i normalizirane na OD 600 nm. Bakterije su isprane s HBSS w/ Ca2+ i Mg2+ i blokirane s HBSS w/ Ca2+ i Mg2+ +10% FBS 20 minuta na sobnoj temperaturi. Svi postupci bojenja odvijali su se u atmosferskim uvjetima. 1 x 107 bakterijskih stanica stavljeno je u 96-ploču s jažicama s okruglim dnom, centrifugirano na 3,000 xg, i dekantirano. 50 uL konstrukata stavljeno je na bakterijske stanice, lagano promiješano i inkubirano na 4 °C 1 sat. Bakterijske stanice su isprane s HBSS w/ Ca2+ i Mg2+ + 10% FBS, 2x. 50 uL kozjeg anti-humanog Fc (PE) (ebioscience Catalog # 12-4998-82) dodano je stanicama i inkubirano na 4 °C 1 sat, u mraku. Stanice su zatim isprane kao prije i stavljene u HBSS w/ Ca2+ i Mg2+ koji sadrži 1x Sybr® zeleno (Sigma-Aldrich CAS: 163795-75-3). Stanice su inkubirane na sobnoj temperaturi 20 minuta u mraku i odmah očitane na protočnom citometru BD LSR Fortessa.

Zračenje i rekonstitucija koštane srži

Koštana srž je sakupljena iz WT i Clec12a-/- životinja kao što je prethodno opisano. Primljeni miševi primatelji bili su smrtonosno ozračeni s 500 Radova dana -1, nakon čega je slijedilo 400 Radova dana 0. Četiri sata nakon posljednjeg ozračivanja, miševi primatelji stavljeni su pod anesteziju izofluranom i 100uL izoliranog Stanice koštane srži suspendirane u sterilnom PBS-u (1 x 108 stanica/mL) isporučene su iglom veličine 28,5 u retro-orbitalni prostor. Zanimala nas je mikrobiota stoga životinje nisu bile stavljene na antibiotike, a nakon 8 tjedana prikupljene su fekalne kuglice za prijenos mikrobiote u GF životinje.

REFERENCE

Anderson, MJ (2001). Nova metoda za neparametarsku multivarijantnu analizu varijance. Austral Ecol. 26, 32-46. DOI 10.1111/j.1442-9993.2001.01070.pp.x.

Begun, J., Lassen, KG, Jijon, HB, Baxt, LA, Goel, G., Heath, RJ, Ng, A., Tam, JM, Kuo, SY, Villablanca, EJ, et al. (2015). Integrirana genomika varijante rizika od Crohnove bolesti

identificira ulogu CLEC12A u antibakterijskoj autofagiji. Rep. ćelije 11, 1905-1918. 10.1016/j.celrep.2015.05.045.

Blander, JM, Longman, RS, Iliev, ID, Sonnenberg, GF, i Artis, D. (2017.). Regulacija upale interakcijom mikrobiote s domaćinom. Nat. Immunol. 18, 851-860. 10.1038/ni.3780.

Bokulich, NA, Kaehler, BD, Rideout, JR, Dillon, M., Bolyen, E., Knight, R., Huttley, GA, i Caporaso, JG (2018.). Optimiziranje taksonomske klasifikacije sekvenci amplikona marker-gena s dodatkom QIIME 2 ''sq2-feature-classifier. Mikrobiom 6. ARTN 90 10.1186/s40168-018-0470-z.

Bolyen, E., Rideout, JR, Dillon, MR, Bokulich, N., Abnet, CC, Al-Ghalith, GA, Alexander, H., Alm, EJ, Arumugam, M., Asnicar, F., et al. (2019). Ponovljiva, interaktivna, skalabilna i proširiva znanost o mikrobiomskim podacima pomoću QIIME 2. Nat. biotehnologija. 37, 852-857. 10,1038/s41587-019-0209-9.

Brown, GD, Willment, JA, i Whitehead, L. (2018). C-tip lektina u imunitetu i homeostazi. Nat. Rev. Immunol. 18, 374-389. 10,1038/s 41577-018-0004-8.

Browne, HP, Forster, SC, Anonye, ​​BO, Kumar, N., Neville, BA, Stares, MD, Goulding, D., i Lawley, TD (2016.). Uzgoj 'nekulturne' ljudske mikrobiote otkriva nove taksone i opsežnu sporulaciju. Priroda 533, 543-+. 10.1038/nature17645.

Cadwell, K., Liu, JY, Brown, SL, Miyoshi, H., Loh, J., Lennerz, JK, Kishi, C., Kc, W., Carrero, JA, Hunt, S., et al. (2008). Ključna uloga za autofagiju i autofagijski gen Atg16l1 u mišjim i ljudskim crijevnim Paneth stanicama. Priroda 456, 259-263. 10.1038/nature07416.

Callahan, BJ, McMurdie, PJ, Rosen, MJ, Han, AW, Johnson, AJA, i Holmes, SP (2016.). DADA2: Zaključivanje uzorka visoke razlučivosti iz podataka o amplikonu tvrtke Illumina. Nat. Metode 13, 581-+. 10.1038/Nmeth.3869.

Cao, YG, Bae, S., Villarreal, J., Moy, M., Chun, E., Michaud, M., Lang, JK, Glickman, JN, Lobel, L., i Garrett, WS (2022.). Faecalibaculum rodentium remodelira signalizaciju retinoične kiseline kako bi upravljala homeostazom crijevnog epitela ovisnom o eozinofilima. Stanica domaćin i mikrob 30, 1295- 1310 e1298. 10.1016/j.chom.2022.07.015.

Chang, DH, Rhee, MS, Ahn, S., Bang, BH, Oh, JE, Lee, HK, i Kim, BC (2015.). Faecalibaculum rodentium gen. nov., sp. nov., izoliran iz fecesa laboratorijskog miša. Antonie Van Leeuwenhoek 108, 1309-1318. 10,1007/s10482-015-0583-3.

Chiaro, TR, Soto, R., Stephens, WZ, Kubinak, JL, Petersen, C., Gogokhia, L., Bell, R., Delgado, JC, Cox, J., Voth, W., et al. (2017). Član mikobiote crijeva modulira metabolizam purina domaćina pogoršavajući kolitis kod miševa. Sci. prev. Med. 9, .

Drouin, M., Saenz, J., i Chiffoleau, E. (2020.). Receptori slični lektinima tipa C: Glava ili rep u imunitetu stanične smrti. Ispred. Immunol. 11. ARTN 251 10.3389/fimmu.2020.00251.

Fassarella, M., Blaak, EE, Penders, J., Nauta, A., Smidt, H., i Zoetendal, EG (2021.). Stabilnost i otpornost crijevnog mikrobioma: razjašnjavanje odgovora na poremećaje kako bi se moduliralo zdravlje crijeva. Gut 70, 595-605. 10.1136/gutjnl-2020-321747.

Gkouskou, KK, Deligianni, C., Tsatsanis, C., i Eliopoulos, AG (2014.). Crijevna mikrobiota u mišjim modelima upalne bolesti crijeva. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology 4. ARTN 28 10.3389/fcimb.2014.00028.

Han, YM, Zhang, MH, Li, N., Chen, TY, Zhang, Y., Wan, T., i Cao, XT (2004.). KLRL1, novi receptor nalik lektinu stanica ubojica, inhibira citotoksičnost prirodnih stanica ubojica. Krv 104, 2858-2866. DOI 10.1182/krv-2004-03-0878.

Iliev, ID, Funari, VA, Taylor, KD, Nguyen, Q., Reyes, CN, Strom, SP, Brown, J., Becker, CA, Fleshner, PR, Dubinsky, M., et al. (2012). Interakcije između komenzalnih gljiva i C-tipa lektinskog receptora Dectin-1 utječu na kolitis. Znanost 336, 1314-1317. 10.1126/znanost.1221789.

Jason L. Kubinak, WZS, Ray Soto, Charisse Petersen, Tyson Chiaro, Lasha Gogokhia, Rickesha Bel1, Nadim J. Ajami, Joseph F. Petrosino, Linda Morrison4, Wayne K. Potts, Peter E. Jensen, Ryan M. O' Connell & June L. Runda (2015). MHC varijacija oblikuje individualizirane mikrobne zajednice koje kontroliraju osjetljivost na crijevne infekcije. Komunikacija s prirodom. 0,1038/ncomms9642.

Kono, H., Chen, CJ, Ontiveros, F., i Rock, KL (2010.). Mokraćna kiselina potiče akutni upalni odgovor na smrt sterilnih stanica kod miševa. J. Clin. Investirati. 120, 1939-1949. 10.1172/Jci40124.

Kozich, JJ, Westcott, SL, Baxter, NT, Highlander, SK, i Schloss, PD (2013.). Razvoj strategije sekvenciranja dvostrukog indeksa i cjevovoda za kuriranje za analizu podataka o sekvencama amplikona na platformi za sekvenciranje MiSeq Illumina. Primijenjena mikrobiologija i mikrobiologija okoliša 79, 5112-5120. 10.1128/Aem.01043-13.

Kubinak, JL, Petersen, C., Stephens, WZ, Soto, R., Bake, E., O'Connell, RM, i Round, JL (2015.). MyD88 signalizacija u T stanicama usmjerava kontrolu mikrobiote posredovanu IgA za promicanje zdravlja. Mikrob stanica domaćin 17, 153-163. 10.1016/j.chom.2014.12.009.

Li, K., Neumann, K., Duhan, V., Namineni, S., Hansen, AL, Wartewig, T., Kurgyis, Z., Holm, CK, Heikenwalder, M., Lang, KS i Ruland, J. (2019). Kristalni receptor mokraćne kiseline Clec12A potencira odgovore interferona tipa I. Proc Natl Acad Sci USA 116, 18544-18549. 10.1073/pnas.1821351116.

Liu, JZ, van Sommeren, S., Huang, H., Ng, SC, Alberts, R., Takahashi, A., Ripke, S., Lee, JC, Jostins, L., Shah, T., et al . (2015). Analize povezanosti identificiraju 38 lokusa osjetljivosti na upalnu bolest crijeva i ističu zajednički genetski rizik među populacijama. Nat. Genet. 47, 979-986. 10.1038/ng.3359.

Love, MI, Huber, W. i Anders, S. (2014.). Moderirana procjena promjene nabora i disperzije za RNA-seq podatke s DESeq2. Genome Biol. 15. ARTN 550 10.1186/s13059-014-0550-8.

Love, MI, Soneson, C., Hickey, PF, Johnson, LK, Pierce, NT, Shepherd, L., Morgan, M., i Patro, R. (2020.). Tximeta: Kontrolne sume referentnih sekvenci za identifikaciju provenijencije u RNA-seq. Plos Computational Biology 16. ARTN e1007664 10.1371/journal.pcbi.1007664.

Luo, Y., Tucker, SC, i Casadevall, A. (2005.). Aktivacija Fc- i receptora komplementa stimulira napredovanje staničnog ciklusa stanica makrofaga od G1 do SJ Immunol. 174, 7226- 7233. 10.4049/jimmunol.174.11.7226.

Macpherson, AJ, Gatto, D., Sainsbury, E., Harriman, GR, Hengartner, H., i Zinkernagel, RM (2000.). Primitivni mehanizam IgA odgovora crijevne sluznice na komenzalne bakterije neovisan o T stanicama. Znanost 288, 2222-+. DOI 10.1126/znanost.288.5474.2222.

Maglinao, M., Eriksson, M., Schlegel, MK, Zimmermann, S., Johannssen, T., Gotze, S., Seeberger, PH, i Lepenies, B. (2014.). Platforma za provjeru ugljikohidrata koji se vežu na receptor C-tipa lektina i njihov potencijal za ciljanje specifično za stanicu i imunološku modulaciju. Journal of Controlled Release 175, 36-42. 10.1016/j.jconrel.2013.12.011.

Marshall, ASJ, Willment, JA, Lin, HH, Williams, DL, Gordon, S., i Brown, GD (2004.). Identifikacija i karakterizacija novog humanog mijeloidnog inhibitornog c-tipa receptora sličnog lektinu (MICL) koji se pretežno eksprimira na granulocitima i monocitima. J. Biol. Chem. 279, 14792-14802. 10.1074/jbc.M313127200.

Martin, M. (2011). Cutadapt uklanja sekvence adaptera iz čitanja sekvenciranja visoke propusnosti. EMBNet.journal 17. Martinez-Lopez, M., Iborra, S., Conde-Garrosa, R., Mastrangelo, A., Danne, C., Mann, ER, Reid, DM, Gaboriau-Routhiau, V., Chaparro , M., Lorenzo, MP, et al. (2019). Senzor mikrobiote putem Mincle-Syk osi u dendritskim stanicama regulira proizvodnju interleukina-17 i -22 i promiče integritet crijevne barijere. Imunitet 50, 446-461 e449. 10.1016/j.immuni.2018.12.020.

Martinon, F., Petrilli, V., Mayor, A., Tardivel, A., i Tschopp, J. (2006.). Kristali mokraćne kiseline povezani s gihtom aktiviraju inflamasom NALP3. Nature 440, 237-241. 10.1038/nature04516.

Nakajima, A., Vogelzang, A., Maruya, M., Miyajima, M., Murata, M., Son, A., Kuwahara, T., Tsuruyama, T., Yamada, S., Matsuura, M., et al. (2018). IgA regulira sastav i metaboličku funkciju crijevne mikrobiote promicanjem simbioze između bakterija. J. Exp. Med. 215, 2019-2034. 10.1084/jem.20180427.

Neumann, K., Castineiras-Vilarino, M., Hockendorf, U., Hannesschlager, N., Lemeer, S., Kupka, D., Meyermann, S., Lech, M., Anders, HJ, Kuster, B. , et al. (2014). Clec12a je inhibitorni receptor za kristale mokraćne kiseline koji regulira upalu kao odgovor na staničnu smrt. Imunitet 40, 389-399. 10.1016/j.immuni.2013.12.015.

Okai, S., Usui, F., Yokota, S., Hori, IY, Hasegawa, M., Nakamura, T., Kurosawa, M., Okada, S., Yamamoto, K., Nishiyama, E., et. al. (2016). Monoklonski IgA visokog afiniteta regulira crijevnu mikrobiotu i sprječava kolitis kod miševa. Nat Microbiol 1, 16103. 10.1038/nmicrobiol.2016.103.

Pabst, O. i Slack, E. (2020). IgA i crijevna mikrobiota: važnost specifičnosti. Mucosal Immunol. 13, 12-21. 10,1038/s41385-019-0227-4.

Parks, DH, Chuvochina, M., Waite, DW, Rinke, C., Skarshewski, A., Chaumeil, PA, i Hugenholtz, P. (2018.). Standardizirana taksonomija bakterija temeljena na filogeniji genoma bitno revidira stablo života. Nat. biotehnologija. 36, 996-+. 10.1038/nbt.4229.

Patro, R., Duggal, G., Love, MI, Irizarry, RA, i Kingsford, C. (2017.). Salmon pruža brzu kvantifikaciju ekspresije transkripta koja je svjesna pristranosti. Nat. Metode 14, 417-+. 10.1038/nmeth.4197.

Pedregosa, F., Varoquaux, G., Gramfort, A., Michel, V., Thirion, B., Grisel, O., Blondel, M., Prettenhofer, P., Weiss, R., Dubourg, V., et al. (2011). Scikit-learn: Strojno učenje u Pythonu. J Mach Learn Res 12, 2825-2830.

Pyz, E., Huysamen, C., Marshall, AS, Gordon, S., Taylor, PR, i Brown, GD (2008.). Karakterizacija mišjeg MICL (CLEC12A) i dokaz za endogeni ligand. Eur. J. Immunol. 38, 1157-1163. 10.1002/eji.200738057.

Raulf, MK, Johannssen, T., Matthiesen, S., Neumann, K., Hachenberg, S., Mayer-Lambertz, S., Steinbeis, F., Hegermann, J., Seeberger, PH, Baumgartner, W., et al. (2019). C-tip lektinskog receptora CLEC12A prepoznaje plazmodijalni hemozoin i doprinosi razvoju cerebralne malarije. Rep. ćelije 28, 30-38 e35. 10.1016/j.celrep.2019.06.015.

Ray, A. i Dittel, BN (2015). Međusobna povezanost između disbioze u crijevnoj mikrobioti zbog imunodeficijencije i penetracije bolesti kolitisa. Imunologija 146, 359-368. 10.1111/imm.12511.

Redelinghuys, P., Whitehead, L., Augello, A., Drummond, RA, Levesque, JM, Vautier, S., Reid, DM, Kerscher, B., Taylor, JA, Nigrović, PA, et al. (2016). MICL kontrolira upalu kod reumatoidnog artritisa. Ann. Sluz. Dis. 75, 1386-1391. 10.1136/annrheumdis-2014-206644.