Cistanozid Cistanche Herba ublažava hipoksijom izazvana muška reproduktivna oštećenja suzbijanjem oksidativnog stresa-Ⅰ

Uvod

Trenutno je oko 48,5 milijuna (15%) parova u reproduktivnoj dobi diljem svijeta pogođeno neplodnošću, među kojima se 40-50% slučajeva pripisuje muškoj neplodnosti, stanju koje je snažno povezano s čimbenicima okoline i načina života. Dokazi sugeriraju da je osjetljivost testisa sisavaca na nizak tlak kisika uzročni čimbenik u nekim oblicima muške neplodnosti. Kao što je pokazano u prethodnim studijama, spermatogeneza je oslabljena i smanjena nakon izlaganja hipobaričnoj hipoksiji.

PRIRODNA CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE SEKSUALNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Kako bi se istražio temeljni mehanizam, studije su pokazale da izloženost hipobaričnoj hipoksiji povećava proizvodnju reaktivnih kisikovih vrsta (ROS). ROS igra važnu ulogu u muškom reproduktivnom sustavu. U niskim razinama potrebni su za kapacitaciju spermija, reakciju akrosoma i fuziju spermija i jajnih stanica [10]. Međutim, prekomjerni ROS može izazvati oštećenje nuklearne/mitohondrijske DNK sperme i peroksidativno oštećenje plazma membrane, što su zauzvrat glavni etiološki čimbenici zapovećan rizik od muške neplodnosti. Stoga bi nakupljanje ROS-a izazvanog hipoksijom moglo biti jedan od uzroka muške neplodnosti.

Cistanches Herba, višegodišnja parazitska ljekovita biljka, široko je rasprostranjena u sušnim područjima i naširoko se koristi zbog svog farmakološkog djelovanja. Među svim učinkovitim sadržajimaCistanches Herba, PhGs se smatraju glavnom aktivnom komponentom. Do danas su izolirana 34 PhG-a izCistanches biljke. cistanozid(Cis), aktivni PhG izoliran izCistanches Herba, dobio je pozornost zbog svojih antioksidativnih učinaka.

Uzimajući u obzir antioksidativne učinke Cis-a i ulogu ROS-a u muškoj neplodnosti izazvanoj hipoksijom, Cis se smatra potencijalnim lijekom kandidatom za liječenjemuška neplodnost izazvana hipoksijom. Međutim, malo se izvješća bavilo antioksidativnim učincima Cis-a ekstrahiranog iz Cistanches Herba u liječenju muške neplodnosti izazvane hipoksijom ili uključenim signalnim putovima. U ovoj studiji konstruirani su in vitro i in vivo eksperimentalni modeli hipoksije i procijenjeni su učinci različitih Cis.

Materijali i metode

Kultura stanica i reagens

Stanična linija mišjih spermatogonija GC-1spg (GC-1) kupljena je od American Type Culture Collection (ATCC) i uzgojena u DMEM (Invitrogen, SAD) s dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma, 1% L-glutamin (100 mM), penicilin (100 U/mL) i streptomicin (100 ug/mL) na 37 stupnjeva u ovlaženom inkubatoru s 5% CO2. Cis (Cis-A, B, C, H) je kupljen od Chengdu Gelipu Biotechnology Co., Ltd. (Kina).

PRIRODNA CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE SEKSUALNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Test viabilnosti stanica

Preživljavanje stanica testirano je testom kompleta za brojanje stanica{{0}} (CCK-8). Ukratko, GC-1 stanice su nasađene u 96-ploče s jažicama 1,5×103 po jažici i uzgajane na 37 stupnjeva 24 sata. Zatim su stanice tretirane različitim koncentracijama (20%, 15%, 10%, 5%) kisika ili različitim koncentracijama (2 μM, 0,2 μM, 0,02 μM) Cis (Cis-A, Cis-B, Cis- C, Cis-H) za potrebno vrijeme. Zatim je supernatant odbačen, a vijalnost stanica je detektirana pomoću kompleta CCK-8 (Dojindo Japan). Apsorbancija svake jažice izmjerena je na 450 nm pomoću čitača mikropločica (BioRad USA). Na kraju, vijabilnost stanica izračunata je prema sljedećoj formuli: Vijabilnost stanica=(ODeksperimentalna skupina - ODprazna skupina)/ (ODkontrolna skupina - ODblanka skupina) × 100%.

Western blot analiza

Sakupljene stanice ili tkiva homogenizirana su u RIPA puferu za ekstrakciju proteina (RIPA Beyotime Kina; Cocktail Roche Švicarska). Supernatanti su sakupljeni, a koncentracija proteina ispitana BCA metodom (Beyotime). Približno 40 ug ekstrahiranih proteina iz svakog uzorka je odvojeno pomoću SDS-PAGE i elektrotransferirano na nitroceluloznu (NC) filter membranu (Beyotime China). Membrane NC filtera blokirane su s 5% nemasnog mlijeka 1,5 h i inkubirane sa specifičnim protutijelima (anti-PARP 1:1000, antiCaspase-3 1:1000, anti-Bcl-2 1:1000, anti-Bax 1 :1000, anti-GAPDH 1:1000; sva antitijela su kupljena od Cell Signaling Technology, USA) preko noći na 4 stupnja. Zatim su sve NC membrane inkubirane s odgovarajućim sekundarnim antitijelom konjugiranim s peroksidazom hrena 1,5 h na sobnoj temperaturi i snimljene slikovnim sustavom (Tannon, Kina).

Detekcija staničnog ciklusa

Protočno citometrijsko ispitivanje (FCM) provedeno je za analizu staničnog ciklusa. Stanice su tretirane pod različitim uvjetima 72 sata i sakupljene. Stanice su zatim isprane s PBS-om, fiksirane u 75% etanolu i obojene s propidijevim jodidom (PI). Za svaki uzorak sakupljeno je 1×104 stanica i analizirano protočnom citometrijom (FACS Calibur, BD Biosciences). Zatim je izračunat udio stanica G1/S/G2 faze i indeks proliferacije [Faza(S+G2)/Faza(G1+S+G2) × 100%].

Ki-67 bojenje

Stanice su uzgajane u konfokalnoj posudi i tretirane hipoksijom ili različitim podtipovima Cis tijekom 72 sata. Nakon fiksiranja svih stanica s 4% paraformaldehidom, one su inkubirane s anti-Ki-67 antitijelima (1:200, Cell Signaling Technology). Zatim su sve stanice inkubirane s odgovarajućim CY-3-konjugiranim anti-zečjim IgG protutijelom (1:200, Boster, Kina) i otopinom DAPI (1,0 ug/mL, Beyotime). Fluorescencija je promatrana konfokalnim mikroskopom Fluoview FV1000 (Olympus, Japan).

VRHUNSKI EKSTRAKT CISTANCHE TUBULOSA ZA POJAČANJE TESTOSTERONA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Detekcija ROS

FCM je uveden za mjerenje unutarstaničnih razina ROS-a pomoću DCFH-DA. Suspendirane stanice su nasađene u 6-pločice s jažicama i podvrgnute različitim tretmanima. Nakon 72 sata tretmana, stanice su suspendirane u DMEM bez seruma s 10 µM DCFH-DA (Beyotime). Sadržaj ROS-a zatim je određen sortiranjem stanica aktiviranim fluorescencijom na sustavu protočne citometrije Beckman Coulter s valnom duljinom ekscitacije od 488 nm i valnom duljinom emisije od 525 nm [18].

Određivanje lipidne peroksidacije (LPO)

Proveden je test reaktivnih tvari na tiobarbiturnu kiselinu (TBARS) kako bi se otkrio LPO. Svi radni koraci izvedeni su prema uputama (Sigma USA). Koncentracije su izračunate korištenjem koeficijenta molarne ekstinkcije od 1,56×105/(M·cm), koji je dobiven korištenjem malondialdehida kao standarda. Rezultati su izraženi kao nmol MDA ekvivalenata/mg proteina.

Određivanje aktivnosti enzima

Aktivnosti enzima testirane su korištenjem kompleta za ispitivanje uključujući glutation reduktazu (GR), glutation peroksidazu (GPx) i superoksid dismutazu (SOD). Svi operativni koraci izvedeni su u skladu s priloženim uputama (Nan Jing Jian Cheng Bioengineering Institute China).

Protokol životinja i pokusa

Zreli mužjaci Wistar štakora (180-220 g, stari 8 w) dobiveni su iz životinjskog centra Četvrtog vojno-medicinskog sveučilišta, Xi'an, Kina. Dopuštenje za korištenje životinja dobiveno je od Etičkog povjerenstva Sveučilišta (Referentni broj: 20190506). Pokus na životinjama proveden je prema sveučilišnim smjernicama za njegu i korištenje laboratorijskih životinja.

Svi štakori su pušteni da se prilagode otprilike 1 tjedan prije početka eksperimenta. Nakon privikavanja, štakori su nasumično raspoređeni u 6 skupina s 5 životinja u svakoj skupini. Štakori u kontrolnoj skupini uzgajani su pod normalnim tlakom (PO2: 20%; tlak zraka: 101,3 kPa), dok su štakori u modelu i skupini tretiranoj Cis-om uzgajani u komori s niskim tlakom kisika (unutarnji tlak od 61,6 kPa , što je ekvivalentno visini od 4000 metara iznad razine mora; PO2: 14,55%) za simulaciju hipoksičnog okruženja na velikoj nadmorskoj visini. Svi štakori imali su slobodan pristup hrani i vodi u plastičnim kavezima na 22 ± 2 stupnja i uvjetima vlažnosti s automatskim 12-h ciklusom svjetlo/tama. Štakori u modelu i skupini tretiranoj Cis-om ostali su u hipobaričnim uvjetima, ali su prebačeni u normobarične uvjete svakih 96 h, u koje vrijeme su im davani hrana i voda, a kavezi očišćeni. Trajanje prijelaza iz hipobaričnog u hipobarični stanje bilo je približno 2 h. Sve tretirane skupine su tretirane odgovarajućim Cis (8 mg/kg/dan) oralnom sondom tijekom 8 tjedana, dok su kontrolni i model štakori tretirani jednakim volumenom vode.

Nakon 8 tjedana štakori su žrtvovani pod anestezijom. Testisi, epididimis i sjemeni mjehurići su odvojeni i izvagani, a indeks organa je izračunat prema sljedećoj formuli: (težina organa/težina životinje) × 100%. Potom su prikupljeni spermiji u epididimisu i testirana je njihova pokretljivost i aktivnost enzima akrosoma. Slično tome, tkiva testisa su prikupljena za histopatološke studije i otkrivanje aktivnosti ROS, LPO i antioksidativnih enzima.

EKSTRAKT CISTANCHE TUBULOSA EKSTRAKT BILJA CISTANCHE POVEĆAVA SEKSUALNU MOĆ PHGS75% ECH 30% DJELUJE 12%

Procjena broja živih spermija

Epididimis je zarezan kirurškim škarama, a suspenzija sperme je pripremljena u fiziološkoj otopini. Za procjenu udjela živih spermija, 5 μL suspenzije spermija pažljivo je pomiješano s jednakim volumenom boje eozinom-Y. Spermiji su zatim izbrojani pod svjetlosnim mikroskopom. Stope živih spermija procijenjene su izračunavanjem i obojenih (mrtvih spermija) i neobojanih spermija (živih spermija).

Određivanje enzimske aktivnosti akrosoma spermija

Test aktivnosti enzima akrosoma sperme korišten je za procjenu enzima akrosoma sperme [19]. Rezultati u svakoj skupini izračunati su pomoću sljedeće formule: Aktivnost akrosomskog enzima (μIU)=(ODExperimentalna skupina - ODBlank skupina)/(247,5×10) × 106.

Rezultati

Učinci hipoksije na GC-1 stanice

Kako bismo odredili učinke hipoksije na zametne stanice, prvo smo ispitali promjene u vitalnosti stanica nakon liječenja hipoksijom s različitim koncentracijama kisika (20%, 15%, 10% i 5%) za 1, 3, 5 , odnosno 7 dana. Rezultati testa CCK-8 pokazali su da su u usporedbi s kontrolnom skupinom (20% koncentracija kisika), stanice izložene hipoksiji pokazale značajno smanjenje vitalnosti (P ​​<0,01; Slika 1A). Štoviše, njihova stopa preživljavanja bila je obrnuto proporcionalna koncentraciji kisika i dalje se smanjivala s vremenom indukcije. Kako bi se izbjegao pretjerani citotoksični učinak, 10%-tna koncentracija kisika i 3-dnevno vrijeme indukcije odabrani su kao kriteriji modela hipoksije za sljedeće in vitro pokuse.

Nakon toga, provedeno je FCM i imunofluorescentno bojenje kako bi se dodatno procijenila promjena proliferacije GC{{0}} stanica pod tretmanom hipoksije. Rezultati su pokazali da hipoksija može inducirati zaustavljanje GC-1 stanica u G1 fazi, čime se smanjuje ulazak stanica u S fazu i inhibira replikacija DNA. Stoga je hipoksija značajno smanjila indeks proliferacije GC-1 stanica (P < 0,01; Slika 1B). Pozitivno Ki-67 bojenje još je jedan specifični biomarker proliferirajućih stanica. Stoga smo također ispitali omjer Ki-67-pozitivnih stanica sa ili bez liječenja hipoksijom. U usporedbi s kontrolnom skupinom, liječenje hipoksijom značajno je smanjilo Ki-67-pozitivne stanice, kao što je prikazano na slici 1C.

Zatim smo željeli istražiti način inhibicije vitalnosti GC{{0}} stanica izazvan hipoksijom. Kao što je navedeno u literaturi, razina ROS-a se povećala kako su štakori bili izloženi hipobaričnom hipoksičnom okruženju [8, 20]. Stoga su endogene razine ROS-a u GC-1 stanicama mjerene korištenjem FCM testa. Rezultati su pokazali više razine ROS-a pod hipoksijom u usporedbi sa skupinom s normalnim kisikom (P <0,01; Slika 1D). Akumulirani ROS uzrokuje izrazito oštećenje DNK, što zauzvrat uzrokuje aktivaciju staničnog puta apoptoze i može biti glavni etiološki čimbenik za povećanje rizika od muške neplodnosti [21, 22]. Zatim smo TUNEL bojanjem otkrili učinak apoptotičke aktivacije hipoksije na GC-1 stanice. Kao što je prikazano na slici 1E, liječenje hipoksijom rezultiralo je povećanjem TUNEL fluorescencije u usporedbi s kontrolnom skupinom, što ukazuje na povećanje apoptoze u modelnoj skupini.

Budući da oštećenje stanica izazvano ROS-om obično uzrokuje OS, dodatno smo testirali OS GC-1 stanica. Kao što je prikazano na slici 1F, razine LPO stanica GC-1 u modelnoj skupini bile su značajno povećane u usporedbi s razinama LPO stanica GC-1 u kontrolnoj skupini. Ovi nalazi sugeriraju da bi oštećenje GC-1 stanica izazvano hipoksijom moglo biti povezano s OS-om, koji je induciran nakupljanjem ROS-a.