Usporedba razlika u sadržaju osam kemijskih komponenti u sirovim i vinom prerađenim proizvodima dviju vrsta Cistanche Deserticola na temelju UPLC Ⅱ

2. Metode i rezultati

2.1 Kromatografski uvjeti

UPLC analiza je provedena pomoću aWaters ACQUITY UPLC™ BEH C18 kolona (100 mm × 2,1 mm, veličina čestica 1,7 μm). Mobilna faza sastojala se odmetanol (A)i0,1% vodena otopina mravlje kiseline (B)sa sljedećim gradijentnim eluiranjem:

0–4 min: 10% → 26% A

4–18 min: 26% → 40% A

18–20 min: 40% → 50% A

Brzina protoka:0,3 ml/min
Volumen injekcije:3 μL
Temperatura kolone:35°C
Valna duljina detekcije:330 nm

2.2 Priprema otopina

2.2.1 Mješovita referentna otopina

Točno izvažite sljedeće standardne spojeve:cistanozid F, ehinakozid, cistanozid A, verbaskozid, tubulozid A, izoverbaskozid, 2'-acetilverbaskozid, itubulozid B. Otopiti u 50% metanolu kako bi se pripremila referentna smjesa sa sljedećim koncentracijama (µg·mL⁻¹):

Cistanosid F: 32,7

Ehinakozid: 102,4

Cistanosid A: 50,2

Verbaskozid: 80,6

Tubulozid A: 25.6

Izoverbaskozid: 86.3

2'-acetilverbaskozid: 77.3

Tubulozid B: 60,8

2.2.2 Otopina uzorka

Sirove Cistanche kriškepripremali su se omekšavanjem biljke, rezanjem i sušenjem.
Cistanche kuhan u vinupripremljen je namakanjem sirovih kriški u 30% rižinog vina, kuhanjem smjese na pari 12 sati, hlađenjem i ponovnim sušenjem.

Približno0.2 gosušenog praha (propuštenog kroz sito od 65 mesha) izvagano je u jantarnu volumetrijsku tikvicu od 50 mL, ekstrahirano s 25 mL 50% metanola, sonicirano 40 minuta (250 W, 35 kHz) i vraćeno na težinu. Otopina je filtrirana kroz a0,22 μm membrana, a filtrat je korišten za analizu.

Napomena: H. Desert Cistanche; G. Tubulosa Cistanche; RH. Cistanche deserticola sirove kriške; RG. Cistanche tubulosa sirove kriške; WH. Cistanche deserticola pirjana s vinom; WG. Cistanche tubulosa pirjana s vinom; Slike 4 do 7 su iste.
Slika 1. Slike ljekovitog materijala Cistanche deserticola i Cistanche tubulosa, sirove kriške i pirjane s vinom

poznato vino cistanche koje se prodaje u Kini

Kupi sada

Usluga podrške tvrtke Wecistanche-Kontaktirajte nas da biste dobili uzorak ili veleprodajne detalje
E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/telefon:+86 15292862950

2.3 Kvantitativna analiza 8 glavnih spojeva u sirovoj i u vinu prerađenoj cistanči

2.3.1 Prikladnost sustava

Pod opisanim kromatografskim uvjetima, teorijski broj ploče zaehinakozid exceeded 6000 with good resolution (>1.5). Kromatogrami miješanog standarda, sirove desertne Cistanche i uzoraka prerađenih u vinu prikazani su na slici 2.

Identifikacija vrha:

cistanozid F

Ehinakozid

cistanozid A

verbaskozid

Tubulozid A

Izoverbaskozid

2'-acetilverbaskozid

Tubulozid B

cistanche deserticola

cistanche tubulosa

2.3.2 Linearnost i granice detekcije

Standardne kalibracijske krivulje utvrđene su korištenjem serijskih razrjeđenja referentne smjese u koncentracijama od 0,1 do 5,0 mL. Kalibracijske krivulje generirane su crtanjemkoncentracija (X)nasprampodručje vrha (Y). Određene su granice detekcije (LOD, S/N=3) i granice kvantifikacije (LOQ, S/N=10) i potvrđena je dobra linearnost u testiranim rasponima.

2.3.3 Preciznost

Pokazalo se šest ponovljenih injekcija miješane referentne otopinerelativne standardne devijacije (RSD)područja vrha u rasponu od0,48% do 2,14%, što ukazuje na izvrsnu preciznost instrumenta.

2.3.4 Stabilnost

Primjeri rješenjasirovi Cistanche prah (serija br. 160901)analizirani su nakon 0, 2, 4, 8, 12 i 24 sata. RSDs područja vrhova za svih 8 spojeva kretali su se od0,71% do 1,93%, potvrđujućistabilnost otopine unutar 24 sata.

Tablica 1. Podaci o uzorku Cistanche materijala

2.3.5 Ponovljivost

Šest neovisno pripremljenih replika iste serije Cistanche pokazalo je dobru ponovljivost. Prosječni sadržaj (mg·g⁻¹) i RSD bili su sljedeći:

2.3.6 Test oporavka

Oporavak je testiran šišanjemšest replika Cistanche praha (0,1 g)s poznatim koncentracijama 8 referentnih spojeva. Prosječni oporavci kretali su se od95,56% do 102,71%, s dinarima između1,44% i 2,97%, što ukazujeizvrsna ekstrakcija i pouzdanost kvantifikacije.

Napomena: A. Mješovita referenca; B. Sirovi Cistanche deserticola; C. Cistanche deserticola pirjana u vinu; 1. Cistancheside F; 2. Ehinakozid; 3. cistanhezid A; 4. verbaskozid; 5. Tubulozid A; 6. Izoverbaskozid; 7. 2΄-acetilverbaskozid; 8. Tubulozid B.

2.3.7 Kvantifikacija aktivnih spojeva u sirovoj naspram u vinu prerađenoj Cistanche

Svaki uzorak testiran je u duplikatu. Kvantificirano je 8 ciljnih spojeva10 serija Cistanche deserticola(sirovo i vino prerađeno) i10 serija Cistanche tubulosa. Rezultati su sažeti u tablici 3, nudeći uvid u:

Specifične razlike u sastavu

Promjene fitokemijskog sadržaja nakon prerade vina

Analitičko uzimanje otisaka za kontrolu kvalitete Cistanche

Tablica 2. Kalibracijske krivulje, korelacijski koeficijenti (r), linearni rasponi, LOD i LOQ za osam spojeva

2.4. Usporedna analiza kemijskog sastava između vrsta Cistanche

Za istraživanjefitokemijske razlikeizmeđuCistanche deserticolaiCistanche tubulosa, koncentracije osam ključnihfeniletanoidni glikozidiiz10 serija uzoraka sirovog i prerađenog vinasvake vrste vizualizirani su pomoćuokvirni dijagrami (slika 3). Statistička analiza pokazala je da, osim2'-acetilverbaskoziditubulozid B, pokazala je većina drugih spojevaznačajne razlike (P < 0,05)između dvije vrste u sirovom i prerađenom obliku.

Posebno:

Usirovi Cistanche, sadržajcistanozid F, ehinakozid, izoverbaskozid, tubulozid A i verbaskozidbio jeznatno nižeuC. deserticolau usporedbi sC. tubulosa(P <0,05).

Thevinsko prerađeni uzorciodražavala slične trendove.

Posebno,cistanozid Apronađeno je kodviše razine uC. deserticolai bio jeneotkrivenuC. tubulosa, sugerirajući da može poslužiti kaopotencijalni spoj markeraza diferencijaciju vrsta.

PLS-DA kemometrijska analiza Cistanche vrsta

A Djelomična diskriminantna analiza najmanjih kvadrata (PLS-DA)provedeno je pomoću podataka o koncentraciji osam spojeva. Rezultirajućibodovni grafikoni (Slika 4A)pokazalo je da sirovi i obrađeni uzorci obiju vrsta jesune grupirati u jasno odvojene skupine.

Međutim,slučajni testovi permutacije (Slika 4B)otkrio da je modelnije pretjerano opremljen, kao prave vrijednostiR²Y i Q²bili viši od onih kod permutiranih modela. Relativnoniske Q² vrijednostipredložitiograničena predvidljivost, vjerojatno zbogvarijabilnost unutar grupeipreklapajući složeni rasponiizmeđu sirovog i prerađenog oblika.

Daljnje PLS-DA modeliranje i VIP analiza

Konstruirani su zasebni modeli PLS-DA za sirove i vino obrađene uzorke obiju vrsta za istraživanjekemijske razlike specifične za vrstu. Uočeno je sljedeće:

Dijagrami rezultata (slike 5A i 5C)pokazaoizrazito grupiranjeizmeđuC. deserticolaiC. tubulosau sirovom i prerađenom obliku.

Validacija modela (slike 5B i 5D)potvrđena dobra prediktivna moć bez pretjeranog opremanja.

Dijagrami varijabilne važnosti u projekciji (VIP) (slike 6A i 6B)identificirali ključne spojeve koji doprinose diskriminaciji vrsta:

Zasirovi uzorci: cistanozid A, cistanozid F, ehinakozid, iverbaskozidbili najinformativniji.

Zavinsko prerađeni uzorci: cistanozid Aitubulozid Bigrao dominantne uloge.

2.5 Utjecaj prerade vina na fitokemiju Cistanche

Zbog značajnih varijacija u sadržaju spoja u serijama,uparene usporedbenapravljeni su između sirovih i vinom prerađenih uzorakaista serija. Rezultati, vizualizirani pomoćucrteži violine (slika 7), otkrio je sljedeće:

UC. deserticola, razine2'-acetilverbaskozid, cistanozid A, cistanozid F, ehinakozid, tubulozid A i verbaskozid značajno smanjenanaknadna obrada (P < 0,05), doktubulozid B povećana.

UC. tubulosa, razine2'-acetilverbaskozid, ehinakozid i verbaskozidtakođersmanjena, dokizoverbaskozid i tubulozid B povećanaznačajno (P < 0,05).

Ovi nalazi sugeriraju da prerada vina može dovesti dohidroliza, izomerizacija, ilikemijska transformacijaaktivnih sastojaka.

3. Rasprava

PremaIzdanje Kineske farmakopeje iz 2020, Cistanche deserticolane smije sadržavati manje od0.3%kombiniranog sadržajaehinakozid i verbaskozid, dokCistanche tubulosane smije sadržavati manje od1.5%od ova dva spoja. U ovoj studiji, svi sirovi i obrađeni uzorci - osim jedne serije (180710) - zadovoljili su te standarde.

Usprkosvarijabilnost od serije do serijeunutar svake vrste (neki spojevi su se razlikovali i do 10 puta, kao što su tubulozid A i izoverbaskozid), statistički značajne razlike u sadržaju spojeva dosljedno su uočene između dvije vrste. Ovo to potvrđujepodrijetlo vrste je glavni faktorutjecaj na fitokemijski sastav.

Osim toga,cistanozid Abio jeotkriveno samo uC. deserticolai odsutan uC. tubulosa, što ga čini avrijedan marker za autentifikaciju vrste, osobito u postavkama farmakognostike ili kontrole kvalitete.

🔬 Utjecaj prerade vina na kemijski sastav

Nakon obrade vina, obje su vrste pokazale dosljedan trend:

Snižene razineod:
Cistanozid F, ehinakozid, cistanozid A, verbaskozid, tubulozid A i 2'-acetilverbaskozid

Povećane razineod:
Tubulozid B i izoverbaskozid

Ovi trendovi mogu proizaći izkemijska hidroliza, degradacija, ilistrukturno preuređenjetijekom procesa kuhanja na pari. Zanimljivo je da jeveličina i smjer promjena varirali su među serijama, vjerojatno zbog razlika u:

Početne koncentracije spojeva

Morfologija biljke (veličina, debljina)

Osjetljivost na uvjete obrade

Ovo naglašava važnoststandardiziranje parametara obradei dirigiranjeprocjene kvalitete specifične za serijutijekom biljne pripreme.