Cistanche Tubulosa izaziva apoptozu primarnih i metastatskih stanica ljudskog raka debelog crijeva posredovanu reaktivnim kisikom

Afnan Saleh Al-Menhali, Safia Ali Jameela, Aishah A. Latiff, Mohamed A. Elrayess, Mohammed Alsayrafi, Morana Jaganjac

Antidopinški laboratorij Katar, Toksikologija i višenamjenski, Doha, Katar.

Antidopinški laboratorij Katar, Life Science Research, Doha, Katar.

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

SAŽETAK

Rak debelog crijeva treći je najčešći rak u svijetu. Konvencionalne terapije pokazale su umjerenu učinkovitost s ozbiljnim nuspojavama, stoga postoji hitna potreba za sigurnijim alternativama. U ovoj studiji,Cistanchetubuloza, lokalnog naziva Thanoon, razmatran je kao potencijalna fitoterapijska strategija zbog poznatog visokog terapijskog potencijala u tradicionalnoj medicini i široke rasprostranjenosti u regiji Bliskog istoka. Bioaktivni spojevi ekstrahirani su iz prahaCistanchetubulozai testirana su njihova antikancerogena svojstva protiv četiri debelog crijevaRakstanične linije uključujući dvije izvedene iz primarnog tumora (CaCo2 i HCT116) i dvije izvedene iz metastatskog mjesta (LoVo i SW620). Učinak odCistanchetubulozana indukciju apoptoze i stanične redoks homeostaze također je istraživan.Cistanchetubulozapokazali su koncentracijski i vremenski ovisnu inhibiciju proliferacije svih testiranih staničnih linija raka za više od 60 posto nakon 72 sata tretmana s 1 mg/mL sirovog ekstrakta. Inhibicija proliferacije obilježena je indukcijom apoptoze, unutarstaničnom proizvodnjom reaktivnih kisikovih vrsta i mitohondrijskih superoksida. Ovi podaci sugeriraju da je Cistanche tubulosa obećavajući kandidat za dodatnu terapiju protiv raka debelog crijeva. Ovo je prva studija koja pokazuje antikancerogenu bioaktivnost Cistanche tubulosa protiv stanica raka debelog crijeva.

Aktivni sastojakCistancheimaprotiv rakaposljedica

Kratice:

7-AAD, 7-amino-aktinomicin D;

CTE,Cistancheekstrakt tubuloze;

EMEM, Eagle's Minimum Essential Medium;

FBS, fetalni goveđi serum; DCF, 2,7-diklorofluorescein;

DCFH-DA, 2,7-diklorodihidrofluorescein diacetat;

DMEM, Dulbeccov modificirani Eagleov medij;

DMSO, dimetilsulfoksid; MTT, 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolij;

PE, Phycoerythrin; RFU, jedinice relativne fluorescencije;

ROS, reaktivne vrste kisika

UVOD

Rak debelog crijeva jedan je od najčešćih karcinoma u svijetu (Brenner i sur., 2014.), a njegova učestalost je u stalnom porastu s procijenjenih 2,4 milijuna slučajeva u 2035. godini, zbog suvremene prehrane i načina života te smanjene tjelesne aktivnosti. Trenutačni napori nisu dostatni za suzbijanje sadašnje epidemije kolorektalnog karcinoma i stoga su potrebni novi pristupi za učinkovitu prevenciju i liječenje uključujući promjene u načinu života u kombinaciji sa sigurnijim alternativnim intervencijama kao što je fitoterapija (Weidner et al., 2015.). Fitoterapija, korištenje ljekovitih biljaka u liječenju bolesti, bila je neizbježan dio davne ljudske povijesti. Ljekovite biljke već se dugo koriste kao alternativni izvori liječenja raka, čineći više od šezdeset posto lijekova protiv raka koji se koriste u konvencionalnoj medicini (Balunas i Kinghorn, 2005.; Saibu i sur., 2015.). Neki od najpoznatijih primjera uključuju ekstrakte Catharanthus roseus G. Don. (Apocynaceae), Taxus baccata L. (Taxaceae) i Camptotheca acuminate Decne (Nyssaceae) (Cragg i Newman, 2005; da Rocha i sur., 2001). Pokazalo se da nekoliko biljnih ekstrakata i fitokemikalija ima antitumorske učinke kod kolorektalnog karcinoma što se pripisuje indukciji proizvodnje reaktivnih kisikovih vrsta (ROS) i povezanoj apoptozi stanica raka, kao što je slučaj s ekstraktima Melissa officinalis (Weidner i sur., 2015.).

Cistanchedeserticola ima učinak inhibicijećelijaapoptoza

Među fitoterapeutskim kandidatima,Cistanchetubulosa, pustinjska parazitska biljka Orobanchaceae (Jiang et al., 2009.) koja je široko rasprostranjena u sušnim i polusušnim regijama Afrike, Azije i mediteranske regije, pokazalo se da ima vrijedna ljekovita svojstva.Cistanchetubulosa intenzivno se koristi u tradicionalnoj medicini i sugerira se da ima ljekovite učinke kod nedostatka bubrega, morbidne leukoreje, metroragije, ženske neplodnosti i senilnog zatvora (Jiang i sur., 2009.). Uz tradicionalnu medicinsku upotrebu, važna ljekovita svojstva Cistanche Tubulosa intenzivno se proučava tijekom posljednjeg desetljeća, uključujući vazorelaksant (Yoshikawa i sur., 2006.), hepatoprotektivni (Morikawa i sur., 2010.), antihiperglikemijske i hipolipidemijske učinke (Xiong i sur., 2013.). Cistanche Tubulosawas također se predlaže kao snažan pojačivač imunološkog sustava, promotor formiranja kostiju i sredstvo protiv starenja i umora (Xu et al., 2014.). Nadalje, pokazalo se da ekstrakt Cistanche tubulosa blokira taloženje amiloida u modelu Alzheimerove bolesti (Wu et al., 2015.). Unatoč različitim terapeutskim upotrebama, učinak Cistanche Tubulosa kao potencijalnog sredstva protiv raka još nije istražen.

U ovom radu istraživali smo antikancerogeni učinakCistancheTubulosa na dvije primarne i dvije metastatske stanične linije raka debelog crijeva i potencijalni mehanizmi na kojima se temelji ovaj učinak.

MATERIJALI I METODE

Sakupljanje i priprema biljnog ekstrakta

Uzorci odCistanchetubulosa sakupljene su iz pustinjskih područja u Kataru tijekom 2014. godine, a autentičnost biljke potvrdio je herpetolog. Uzorci vaučera arhivirani su u Toksikološkom i višenamjenskom odjelu ADLQ-a. Uzorci biljaka osušenih na suncu samljeveni su Retsch Knife Mill Grindomix GM300 u fini prah. Dvadeset grama praha ekstrahirano je s 200 mL ultračiste vode preko noći na 37 stupnjeva na rotacijskoj mućkalici na 200 pm. SirovaCistanchetubulosa ekstrakti (CTE) centrifugirani su 30 min na 8000 okretaja u minuti kako bi se taložili netopivi spojevi, supernatant je sakupljen i osušen smrzavanjem korištenjem Labconco Freezone 6 plus Freeze sušilnika. Osušeni ekstrakt rekonstituiran je u Dulbeccovom modificiranom Eagleovom mediju (DMEM, SIGMA, Njemačka) do koncentracije od 20 mg/mL i sterilno filtriran kroz membranski filter od 0 2- mikrona.

Stanične linije i održavanje stanica

Stanične linije ljudskog karcinoma debelog crijeva CaCo2, SW620 i LoVo dobivene su od Cell Lines Service (CLS, Eppelheim, Njemačka), dok je stanična linija HCT 116 bila ljubazan dar Odsjeka za biološke i okolišne znanosti Sveučilišta u Kataru. CaCo2 i HCT11 izvedeni su iz primarnog mjesta karcinoma debelog crijeva, dok su SW620 i LoVo izvedeni iz metastatskog mjesta. Stanice SW620, HCT116 i LoVo uzgajane su i održavane u mediju DME, dok su stanice CaCo2 održavane u mediju Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM, SIGMA, Njemačka). Stanice su uzgajane kao monoslojne kulture na 37 stupnjeva u odgovarajućem mediju s dodatkom 10 posto fetalnog goveđeg seruma (FBS, SIGMA, Njemačka) i 1 posto penicilina/streptomicina (SIGMA, Njemačka) u vlažnoj atmosferi koja je sadržavala 5 posto ugljičnog dioksida.

Test viabilnosti stanica

Test {{0}}[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolij (MTT) korišten je za procjenu citotoksične aktivnosti CTE slično kao što je ranije opisano (Jaganjac et al., 2010). Gustoća nasađivanja stanica CaCo2, HCT116, SW620 i LoVo uzgojenih u 96-pločama s jažicom bila je 104 stanice po jažici. Stanice su posađene u odgovarajući medij s dodatkom 10 posto FBS-a 24 sata prije tretmana. Nakon 24 sata, medij je uklonjen i stanice su tretirane s 0, 0,25, 0,5, 1 i 2 mg/mL CTE 24, 48 i 72 sata na 37 stupnjeva u vlažnoj atmosferi koja je sadržavala 5 posto CO2. Nakon CTE tretmana, medij je uklonjen i 40 µL MTT otopine (0,5 mg/mL) je dodano u svaku jažicu.

Nakon 3 sata inkubacije, MTT otopina je uklonjena, produkt formazana otopljen u dimetilsulfoksidu (DMSO, SIGMA, Njemačka), a apsorbancija je izmjerena na 590 nm čitačem mikropločica (Infinite 200 PRO NanoQuant, Tecan Trading AG, Švicarska).

Test apoptoze

Apoptoza u CaCo2, HCT116, SW620 i LoVo stanicama otkrivena je pomoću PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I s 7-Amino-Actinomycin D (7-AAD) kao vitalnom bojom (Becton Dickinson International, Belgija) prema uputama proizvođača. Ukratko, stanice su nasađene u 24-ploče s jažicama u gustoći od 5×104 stanice po jažici u odgovarajućem mediju dopunjenom s 10 posto FBS-a 24 sata prije dodavanja CTE (0, 0,5, ili 1 mg/mL). Nakon inkubacije od 24 CTE, stanice su sakupljene, dvaput isprane hladnom fiziološkom otopinom puferiranom fosfatom i obojene fikoeritrinom (PE) aneksinom V i 7-AAD 15 minuta na sobnoj temperaturi u mraku. Obojene stanice analizirane su unutar 1 sata protočnom citometrijom pomoću FACS-a. Protočni citometar Aria III i softver FACSDiva (Becton Dickinson) pri niskom protoku s najmanje 104 stanice. Tretiranje stanica tijekom 4 sata sa 6 uM kamptotecina (SIGMA) korišteno je kao pozitivna kontrola za test.

Intracelularna proizvodnja ROS

Intracelularna proizvodnja ROS ispitana je pomoću 2,7-diklorodihidrofluorescein diacetata (DCFH-DA, SIGMA, Njemačka). DCFH-DA je nefluorescentna sonda koja se oksidira unutarstaničnim ROS-om u fluorescentni spoj 2,7-diklorofluorescein (DCF) (Poljak-Blazi i sur., 2011). DCFH DA analiza izvedena je na sličan način kao što smo ranije opisali (Cindric i sur., 2013; Poljak-Blazi i sur., 2011.). Ukratko, gustoća nasađivanja stanica CaCo2, HCT116, SW620 i LoVo uzgojenih u crnim pločama 96-jažica bila je 104 stanice po jažici. Stanice su stavljene na ploču u odgovarajući medij s dodatkom 10 posto FBS-a tijekom 24 sata. Prije tretmana stanice su inkubirane s 10 µM DCFH-DA na 37 stupnjeva tijekom 30 minuta u 5 posto CO2/95 posto zraka. Stanice su zatim isprane i tretirane s 0, 0,5 i 1 mg/mL CTE u mediju bez fenol crvenog. Intracelularno stvaranje ROS-a praćeno je kontinuirano tijekom 25 sati na 37 stupnjeva i 5 posto CO2 pomoću čitača mikroploča s gornjim modulom za kontrolu fluorescencije i plina (Infinite 200 PRO, Tecan Trading AG, Švicarska). Intenzitet fluorescencije mjeren je valnom duljinom ekscitacije od 500 nm i detekcijom emisije na 529 nm. Proizvoljne jedinice, relativne jedinice fluorescencije (RFU), temeljile su se izravno na intenzitetu fluorescencije.

Stvaranje mitohondrijskog superoksida

Sposobnost CTE-a da inducira stvaranje superoksida u mitohondrijima procijenjena je pomoću mitoSOX crvene sonde propusne za stanice, usmjerene na mitohondrije (Life Technologies) i Hoechst 33342 za nuklearno bojenje (Life Technologies). Stanice CaCo2, HCT116, SW620 i LoVo nasađene su u 96-ploče s jažicama pri gustoći od 104 stanice po jažici u odgovarajućem mediju s dodatkom 10 posto FBS-a tijekom 24 sata. Stanice su zatim napunjene s 4 µM MitoSOX-a i 2 µM Hoechsta 33342 tijekom 20 minuta, višak boje je ispran, a jažice su tretirane s 0, 0,5 i 1 mg/mL CTE-a tijekom 24 sata na 37 stupnjeva i 5 posto CO2. Intenzitet fluorescencije mjeren je valnom duljinom ekscitacije od 510 nm i detekcijom emisije pri 580 nm za MitoSOX i valnom duljinom ekscitacije od 350 nm i detekcijom emisije pri 461 nm za Hoechst 33342 pomoću čitača mikropločica s vrhunskom fluorescencijom (Infinite 200 PRO, Tecan Trading AG, Švicarska).

Statistička analiza

Deskriptivna statistika prikazana je kao srednja vrijednost plus /- SD. Značajnost razlika između skupina procijenjena je Studentovim t-testom i Hi-kvadrat testom. Kada je uspoređeno više od dvije skupine, koristili smo jednostranu ANOVA-u s odgovarajućim post hoc testiranjem. Korišten je SPSS 11.01 za Mircosoft Windows. Razlike s P manjim od 0,05 smatrane su statistički značajnim.

Cistancheimaprotiv rakasvojstva i poboljšavaimunitet

REZULTATI

Učinak CTE na proliferaciju staničnih linija ljudskog raka debelog crijeva prikazan je na slici 1. Sve testirane koncentracije CTE pokazale su snažan inhibitorni učinak na staničnu liniju CaCo2 na način ovisan o koncentraciji i vremenu (slika 1A). Sedamdeset i dva sata CTE tretmana inhibiralo je rast stanica CaCo2 za više od 60 posto u usporedbi s kontrolom (p < 0.05="" za="" sve="" koncentracije).="" značajan="" utjecaj="" liječenja="" cte-om="" na="" rast="" stanica="" hct116="" također="" je="" otkriven="" u="" svim="" vremenskim="" točkama="" pri="" dvjema="" najvišim="" koncentracijama="" (1="" mg/ml="" i="" 2="" mg/ml),="" dosegnuvši="" smanjenje="" veće="" od="" 70="" posto="" u="" posljednjoj="" koncentracije="" (slika="" 1b,="" p="">< 0,05).="" iako="" su="" dvije="" niže="" koncentracije="" cte="" (0,25="" i="" 0,5="" mg/ml)="" značajno="" smanjile="" rast="" stanica="" hct116="" nakon="" 24="" sata=""><0.05), they="" had="" no="" significant="" effect="" following="" 72="" hours="" treatment="" compared="" to="" control="" (p="">{{0}}.{{10}}5). Inhibicija proliferacije ovisna o vremenu i koncentraciji s CTE dodatno je potvrđena u LoVo stanicama za više od 60 posto pri najvišoj koncentraciji (p < 0.05)="" (slika="" 1c)="" ,="" a="" sve="" četiri="" testirane="" koncentracije="" cte="" smanjile="" su="" rast="" stanica="" sw620="" nakon="" 48="" sati="" (slika="" 1d,="" p="">< 0.05="" za="" sve).="" nakon="" 72="" sata="" tretmana="" isti="" učinak="" primijećen="" je="" samo="" za="" dvije="" najveće="" koncentracije="" (p="">< 0,05),="" dok="" koncentracije="" od="" 0,25="" i="" 0,5="" mg/ml="" nisu="" pokazale="" značajan="" učinak="" u="" usporedbi="" s="" kontrolom="" (p=""> 0,05). Utjecaj tretmana 0,5 i 1 mg/mL CTE na indukciju apoptoze dodatno je ispitan u sve četiri stanične linije (Slika 2). Povećan broj stanica u ranoj apoptozi otkriven je u HCT116 i LoVo nakon 24 sata tretmana s 0,5 mg/mL (p<0.05, figure="" 2b="" and="" 2c)="" and="" in="" all="" cell="" lines="" at="" 1="" mg/ml=""><0.05). a="" significant="" increase="" in="" necrotic="" or="" late="" apoptotic="" cell="" number="" was="" further="" observed="" in="" caco2="" and="" sw620="" cell="" lines=""><0.05, figure="" 2a="" and="" 2d).="" the="" ability="" of="" cte="" to="" induce="" intracellular="" ros="" production="" is="" demonstrated="" in="" figure="" 3.="" three="" hours="" following="" cte="" treatment="" there="" was="" a="" strong="" increase="" in="" intracellular="" ros="" production="" in="" all="" cell="" lines=""><0.05). the="" intracellular="" ros="" production="" increased="" progressively="" throughout="" the="" 25="" hours="" of="" treatment="" in="" a="" time="" and="" concentration-dependent="" manner.="" furthermore,="" staining="" of="" cells="" with="" mitochondria-targeted="" probe="" revealed="" a="" strong="" impact="" of="" cte="" on="" mitochondrial="" superoxide="" production="" in="" a="" concentration-dependent="" manner="" (figure="" 4).="" the="" highest="" increase="" in="" superoxide="" production="" by="" mitochondria="" was="" observed="" in="" hct116="" (69%,="" figure="" 4b)="" and="" lovo="" cells="" (82%,="" figure="" 4c)="" following="" 24="" hours="" of="" treatment="" with="" 1="" mg/ml="" of="">

RASPRAVA

Iako su ranije studije izvijestile o brojnim ljekovitim svojstvimaCistanchetubulosa, ovo je prvo izvješće o njegovom antiproliferativnom učinku na maligne stanice. Bioaktivni spojevi Cistanchetubulosa ekstrahirani vodom, visoko polarnim otapalom, pokazali su snažnu bioaktivnost protiv raka. Prethodno smo usporedili učinkovitostCistanchetubulosa solubilizirao u vodi u odnosu na druga otapala kao što su metanol i etil acetat, ali vodeni ekstrakti pokazali su antikancerogeno djelovanje koje najviše obećava (podaci nisu prikazani).

Pokazali smo sposobnost CTE-a pri 1 mg/mL i 2 mg/mL da inhibira 60 posto rasta primarnih i metastatskih staničnih linija raka debelog crijeva, otkrivajući potencijalno važnu ulogu Cistanche tubulosa u liječenju raka debelog crijeva. U usporedbi s normalnim stanicama, stanice raka općenito su karakterizirane poremećajem redoks homeostaze, a uobičajena strategija trenutnih terapija protiv raka je povećanje staničnog oksidativnog stresa (Yang et al, 2013.). Iako fiziološki niske razine ROS-a imaju važnu ulogu kao signalne molekule, prekomjerna proizvodnja ROS-a može pridonijeti nestabilnosti raka i malignosti (Liou i Storz, 2010.). Paradoksalno, ova neravnoteža u staničnoj redoks homeostazi čini stanice raka osjetljivijima na staničnu smrt izazvanu ROS-om (Jaganjac i sur., 2008; Nogueira i Hay, 2013). Antiproliferativni učinak CTE-a prijavljen u ovoj studiji može biti posredovan raznim izvanstaničnim i unutarstaničnim mehanizmima poznatih i nepoznatih spojeva unutar ekstrakta, ciljajući na više puteva koji igraju bitnu ulogu u apoptozi. Kako bismo razlikovali različite načine stanične smrti, istražili smo potencijalni mehanizam odgovoran za uočenu citotoksičnost izazvanu CTE-om.

Naši podaci pokazuju da CTE povećava unutarstaničnu proizvodnju ROS-a i posljedično ROS-om izazvanu staničnu smrt. Redox stanje stanice također igra ključnu ulogu u regulaciji apoptoze, a mitohondrijski transportni lanac elektrona jedno je od glavnih mjesta stanične generacije ROS (Trachootham et al., 2008.). Nadalje, unutarstanični ROS mogao bi uzrokovati staničnu apoptozu putem putova ovisnih i neovisnih o mitohondrijima (Sinha et al., 2013.). Doista, naši podaci također pokazuju da CTE inducira eksternalizaciju fosfatidilserina, uobičajeni učinak u apoptozi, kako u primarnim tako i u metastatskim staničnim linijama raka, što sugerira da je mehanizam CTE-inducirane smrti posredovan apoptozom, a ne nekrozom. Aktivacija apoptoze u stanicama raka je korektivna strategija i mnogi lijekovi protiv raka mogu imati apoptotske učinke u stanicama raka.

Spojevi ili ekstrakti s pro-apoptotskim djelovanjem u stanicama raka stoga su potencijalno korisni u istraživanju lijekova protiv raka (Wong, 2011.). Kako bismo utvrdili je li pro-apoptotski učinak izazvan CTE-om posredovan mitohondrijima induciranim ROS mehanizmom, izmjerili smo proizvodnju superoksida pomoću fluorescentne sonde usmjerene na mitohondrije u stanicama tretiranim s CTE-om. Naši podaci jasno pokazuju da CTE stimulira proizvodnju mitohondrijskog superoksida što sugerira da je antikancerogena aktivnost Cistanche tubulosa barem djelomično posredovana ROS mehanizmom izazvanim mitohondrijima.

Cistancheimaprotiv rakaijetrazaštitaučinci

ZAKLJUČCI

Zaključno, naši podaci sugeriraju da bi vodeni ekstrakt pustinjske biljke Cistanche tubulosa mogao predstavljati obećavajućeg kandidata za pristup protiv raka u kombinaciji s drugim konvencionalnim terapijama za prevenciju i liječenje raka debelog crijeva. Također smo pokazali da je toksičnost biljnog ekstrakta protiv stanica raka posredovana povećanom intracelularnom proizvodnjom ROS i, barem djelomično, apoptozom ovisnom o mitohondrijima. U tijeku su daljnja istraživanja kako bi se izolirali i karakterizirali pojedinačni biološki aktivni sastojci odgovorni za djelovanje protiv raka.

Potrebna su dodatna istraživanja kako bi se procijenila potencijalna upotreba ovog ekstrakta kao učinkovitog kemopreventivnog sredstva i razumjeli mehanizmi djelovanja na stanice raka debelog crijeva na molekularnoj razini. Potrebne su daljnje pretkliničke i kliničke studije kako bi se potvrdili uočeni korisni učinci Cistanche tubulosa na zdravlje za prevenciju raka.

ZAHVALA

Financijska potpora i sponzorstvo

Ovu studiju je podržao Antidopinški laboratorij Katar.

Sukob interesa:

Autori izjavljuju da nema sukoba interesa.

REFERENCE

Balunas MJ, Kinghorn, AD. Otkrivanje lijekova iz ljekovitog bilja. Life Sci. 2005;78:431-41.

Brenner H, Kloor M, Pox CP. Rak debelog crijeva. Lancet 2014;383,1490-502.

Cindrić M, Cipak A, Zapletal E, Jaganjac M, Milković L, Waeg G, Stolc S, Žarković N, Suzana Borović S. Stobadine attenuates impairment of an intestinal barrier model created by 4-hydroxynonenal. Toxicol In Vitro. 2013;27:426-32.

Cragg GM, Newman DJ. Biljke kao izvor antikancerogenih sredstava.J Ethnopharmacol. 2005;100:72-9.da

Rocha AB, Lopes RM, Schwartsmann G. Prirodni proizvodi u terapiji protiv raka. CurrOpinPharmacol. 2001;1:364-9.

Jaganjac M, Matijevic T, Cindric M, Cipak A, Mrakovcic L, Gubisch W, Zarkovic N. Induction of CMV-1 promoter by 4-hydroxy-2-nominal in human embryonic kidney stations. Acta Biochim Pol. 2010;57:179-83.

Jaganjac M, Poljak-Blazi M, Žarković K, Schaur RJ, Žarković N. Uključenost granulocita u spontanu regresiju Walker 256 carcinoma. Rak Lett. 2008;260:180-6.

Jiang Y, Tu PF. Analiza kemijskih sastojaka vrsta Cistanche. J Chromatogr A. 2009;1216:1970-9.Liou GY, Storz P. Reaktivne vrste kisika kod raka. Free Radic Res. 2010;44:479-96.

Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Matsuda H, Yoshikawa M, Yuan D, Muraoka O. Acilirani feniletanoidni oligoglikozidi s hepatoprotektivnim djelovanjem iz pustinjske biljke Cistanche tubulosa. Bioorg Med Chem. 2010;18:1882-90.

Nogueira V, Hay N. Molekularni putovi: homeostaza reaktivnih kisikovih vrsta u stanicama raka i implikacije za terapiju raka. Clin Cancer Res. 2013;19:4309-14.

Poljak-Blazi M, Jaganjac M, Sabol I, Mihaljević B, Matovina M, Grace M. Učinak feri iona na stvaranje reaktivnih kisikovih vrsta, rast staničnih linija raka vrata maternice i ekspresiju onkogena E6/E7. Toxicol In Vitro. 2011;25:160-6.

Saibu GM, Katerere DR, Rees DJG, Meyer M. In vitro citotoksični i pro-apoptotski učinci vodenih ekstrakata lišća i lukovica Tulbaghia violacea. J Ethnopharmacol. 2015;164:203-9.

Sinha K, Das J, Pal PB, Sil PC. Oksidativni stres: putevi apoptoze ovisni i neovisni o mitohondrijima. Arch Toxicol.2013; 87:1157-80.

Trachootham D, Lu W, Ogasawara MA, Nilsa RD, Huang P. Redoks regulacija preživljavanja stanica. Antioksid-redoks signal. 2008;10:1343-74.

Weidner C, Rousseau M, Plauth A, Wowro SJ, Fischer C, Abdel-Aziz H, Sauer S. Ekstrakt melise officinalis inducira apoptozu i inhibira proliferaciju u stanicama raka debelog crijeva stvaranjem reaktivnih vrsta kisika. Fitomedicina. 2015;22:262-70.

Wong RS. Apoptoza u raku: od patogeneze do liječenja. J Exp Clin Cancer Res. 2011;30:87.

Wu SH, Chou FP, Chyau CC, Chen JH, Tu SF, Lin HH. Antikancerogeni učinci ekstrakta Wasabia japonica u Hep3B stanicama raka jetre putem akumulacije ROS, oštećenja DNA i p73-posredovane apoptoze. J Funct Foods. 2015;14:445-55.

Xiong WT, Gu L, Wang C, Sun HX, Liu X. Antihiperglikemijski i hipolipidemijski učinci Cistanche tubulosa kod DB/DB miševa s dijabetesom tipa 2. J Ethnopharmacol. 2013;150:935-45

Xu R, Sun S, Zhu W, Xu C, Liu Y, Shen L, Shi Y, Chen J. Značajke infracrvenog makrootiska prsta u više koraka ekstrakata etanola iz različitih vrsta Cistanche u Kini u kombinaciji s HPLC otiskom prsta. J Mol Struct. 2014;1069:236-244.

Yang Y, Karakhanova S, Werner J, Bazhin AV. Reaktivne vrste kisika u biologiji raka i terapiji protiv raka. Curr Med Chem. 2013;20:3677-92.

Yoshikawa M, Matsuda H, Morikawa T, Xie H, Nakamura S, Muraoka O. Phenylethanoid oligoglycosides and acylated oligosugars with vazorelaxant activity from Cistanche tubulosa. Bioorg Med Chem. 2006;14:7468-75.