Kloniranje gena, funkcionalna identifikacija, struktura i analiza ekspresije saharoza sintaze iz Cistanche Tubulosa Ⅲ

4 Analiza ekspresije CtSus u različitim dijelovima Cistanche tubulosa iu sustavu stanične kulture pod stresom od suše

4.1 Analiza ekspresije CtSus u različitim dijelovima Cistanche tubulosa

In vitro pokusi transformacije cijele stanice i pokusi enzimske katalitičke reakcije potvrdili su da protein kodiran CtSus genom ima sposobnost katalizirati sintezu UDP-glukoze. Kako bi se dalje istražila korelacija između ovog gena i biosinteze glikozidnih spojeva u Cistanche tubulosa, razina ekspresije ovog gena u različitim dijelovimaCistanche tubulosaje analiziran.

PRODAJE SE KVALITETNA CISTANCHE SIROVINA

Služba podrške Wecistanche-Kontaktirajte nas za informacije o popustu:

E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/telefon:+86 15292862950

Ehinakozidje najreprezentativniji glikozidni spoj u Cistanche tubulosa, a njegov sadržaj može doseći više od 30% suhe mase biljke Cistanche tubulosa [23]. Istraživačka skupina prethodno je mjerila sadržaj ehinakozida u različitim dijelovima biljaka Cistanche tubulosa, a specifična učinkovitost bila je: sadržajechinacoside in different tissues was haustorium>underground part>>nadzemni dio; među njima je sadržaj ehinakozida u haustoriju bio najveći. Kvantitativni PCR fluorescencije u stvarnom vremenu proveden je korištenjem cDNA iz različitih dijelova Cistanche tubulosa kao predložaka, a rezultati su analizirani pomoću 2–ΔΔCT metodom, te je provedena diferencijalna analiza. Rezultati su prikazani na slici 4A. Razina ekspresije gena CtSus u haustoriju bila je najveća, 1,5 puta veća od one u nadzemnom dijelu, a razina ekspresije u podzemnom dijelu bila je značajno viša od one u nadzemnom dijelu, što je u skladu s obrascem nakupljanja feniletanol glikozida. predstavljen ehinakozidom u različitim dijelovimaCistanche tubulosa.

Slika 4 Relativne razine ekspresije CtSus u različitim dijelovima C. tubulosa i u suspenzijskim stanicama tretiranim s PEG6000. A: Relativna razina ekspresije CtSus u različitim dijelovima C. tubulosa; B: Relativna razina ekspresije CtSus u suspenzijskim stanicama C. tubulosa tretiranim s PEG6000 u različitim vremenskim točkama n=3, 𝑥̅± s.*P ＜ 0,05,***P ＜ 0,001

VISOKOKVALITETNE CISTANCHE SIROVINE

4.2 Analiza ekspresije CtSus u suspenzijskim stanicama Cistanche deserticola u uvjetima stresa od suše

To su pokazala preliminarna istraživanja projektastres od suše izazvan PEG6000možeznačajno povećatithenakupljanje feniletanol glikozidau suspenzijskim ćelijama Cistanche. Od 3 do 9 dana nakon indukcije sadržaj echinaceasida značajno se povećao. Od 12. do 15. dana,brzina rasta echinaceasidesadržaj se usporio i dostigao maksimalnu vrijednost 15. dana. Zatim, kako se vrijeme kulture produljivalo, sadržaj echinaceasida se značajno povećao. Sadržaj fruktozida se postupno smanjivao [24]. Na temelju ovog istraživanja, ovaj je rad koristio cDNA netretiranih suspenzijskih stanica Cistanche deserticola i PEG6000-inducirane suspenzijske stanice Cistanche deserticola kao predloške za provođenje kvantitativne PCR detekcije fluorescencije u stvarnom vremenu za ispitivanje CtSus gena u suspenziji Cistanche deserticola stanica u uvjetima stresa od suše. promjene u razinama ekspresije. Rezultati su prikazani na slici 4B. U stanicama suspenzije Cistanche deserticola induciranih s PEG6000, ekspresija CtSus je značajno porasla 6. dan nakon indukcije, da bi dosegla najvišu vrijednost 9. dana, a zatim se vratila na istu razinu kao i kontrola. grupe iste razine. Gornji rezultati pokazuju da stres od suše može značajno povećati ekspresiju CtSus gena u suspenzijskoj staničnoj liniji Cistanche deserticola, što je u skladu s obrascem nakupljanja ehinaceasida pod stresom od suše. Međutim, vršna ekspresija CtSus gena javlja se ranije od vrhunca sadržaja ehinaceazida, jer je aktivni glikozilni donor sintetiziran CtSus katalizom važan prekursor potreban za reakciju višestupanjske glikozilacije u daljnjem biosintetskom putu ehinaceazida. , stoga se nagađa da će nakon što budu podvrgnuti stresu od suše, organizmi preferencijalno mobilizirati gene povezane s primarnim metabolizmom kako bi postigli akumulaciju aktivnih donora, a zatim postići akumulaciju važnih sekundarnih metabolita.

VISOKOKVALITETNE CISTANCHE SIROVINE

5 Studija trodimenzionalne strukture proteina CtSus i analiza ključnih aktivnih mjesta

Na temelju funkcije CtSus u kataliziranju proizvodnje glikozil donora UDP-glukoze, strukturna osnova katalitičke aktivnosti CtSus je dalje proučavana. Za predviđanje sekundarne strukture proteina korišten je online alat SOPMA. Rezultati su pokazali da sekundarna struktura CtSus sadrži 55,28% -heliksa, 25,47% nasumičnih zavojnica, 12,80% produženih niti i 6,46% -zavoja (Slika 5A), što ukazuje da su -heliksi najvažnije sekundarne strukturne jedinice u CtSus proteinu, nakon čega slijede nasumične zavojnice, koje također čine veliki udio proteina. Produžene niti i zavoji raspoređeni su po cijelom proteinu. Prema postojećim studijama, saharoza sintaza obično postoji u obliku tetramera koji se smatra njezinim aktivnim oblikom. Stoga je ovaj rad dalje koristio AlphaFold2 za predviđanje strukture CtSus proteina i dobio njegovu trodimenzionalnu strukturu proteinskih tetramera. Usporedba baze podataka PDB (Protein Data Bank) pokazala je da sličnost sekvence između Arabidopsis thaliana saharoza sintaze AtSus1 (PDBID 3S28) i CtSus može doseći 77,93%. Predviđena struktura CtSus uspoređena je s trodimenzionalnom strukturom AtSus1, a vrijednost srednjeg kvadratnog odstupanja (RMSD) nakon superpozicije proteina bila je 1,11 Å, što ukazuje da su prostorne strukture njih dvije vrlo konzistentne (Slika 5B).

Prijavljena struktura kristalnog kompleksa protein-ligand Arabidopsis AtSus1 s UDP-om i fruktozom (PDBID3S29) korištena je kao predložak [16] za analizu načina vezanja CtSus-a s UDP-om i fruktozom. Rezultati molekularnog spajanja prikazani su na slici 5C. Može se uočiti da su džepovi za vezanje supstrata AtSus1 i CtSus vrlo slični u pogledu tipa aminokiselina, prostorne distribucije i konfiguracije, a preklapanje je visoko, što dokazuje da je sekvenca saharoza sintaze visoko očuvana u biljkama. Konformacije dvaju liganda, UDP i fruktoze, u džepu za vezanje proteinskog supstrata prikazane su na slici 5D. Najpovoljnija konformacija UDP-a i CtSusa za molekularno spajanje ima dobro preklapanje s konformacijom UDP-a u kristalnom kompleksu AtSus1-UDP, što dokazuje točnost rezultata molekularnog spajanja. Interakcija između UDP-a i ključnih aminokiselinskih ostataka u džepu za vezanje proteinskog supstrata prikazana je na slici 5E. UDP i CtSus uglavnom su međusobno povezani vodikovim vezama i hidrofobnim interakcijama. Ključni aminokiselinski ostaci u džepu za vezanje supstrata uključuju: eu294, Gly301, Met576, Arg578, Lys583, Gln646, Asn652, Leu677, Thr678 i Glu681.

Reference

[1] Pjesma ZH, Lei L, Tu PF. Napredak u istraživanju farmakološke aktivnosti u biljkama CistancheHoffing. et Link [J]. Chin Tradit Herb Drugs (中草药), 2003, 34: 113-115.

[2] Liu WJ, Liu Y, Song QQ, et al. Chemome usporedba između kultivirane i divlje Cistanchetubulosa pomoću ¹H-NMR spektroskopije [J]. China J Chin Mater Med (中国中药杂志), 2018, 43:3506-3512.

[3] Song Y, Zeng K, Jiang Y, et al. Cistanches Herba, od ugrožene vrste do velikog brenda kineske medicine [J]. Med Res Rev, 2021, 41: 1539-1577.

[4] Liu Y, Wang H, Yang M, et al. Polisaharidi Cistanche deserticola štite stanice PC12 od ozljeda izazvanih OGD/RP [J]. Biomed Pharmacother, 2018, 99: 671-680.

[5] Yin Y, Huang J, Gu X, et al. Evolucija enzima interkonverzije biljnih nukleotida i šećera [J].PLoS One, 2011., 6: e27995.

[6] Bar-Peled M, O'Neill MA. Formiranje šećera biljnih nukleotida, interkonverzija i spašavanje recikliranjem šećera [J]. Annu Rev Plant Biol, 2011., 62: 127-155.

[7] Guo H, Li L, Wang PG. Biokemijska karakterizacija UDP-GlcNAc/Glc4-epimeraze iz Escherichia coli O86:B7 [J]. Biokemija, 2006, 45: 13760-13768.

[8] Dong S, Chesnokova ON, Turnbough CL Jr, et al. Identifikacija UDP-N-acetilglukozamin4-epimeraze uključene u glikozilaciju proteina egzosporija u Bacillus anthracis [J]. J Bacteriol, 2009, 191: 7094-7101.

[9] Li LN, Kong JQ. Identifikacija gena saharoza sintaze u Ornithogalumcaudatumu na cijelom transkriptomu [J]. RSC Adv, 2016, 6: 18778-18792.

[10] Schmölzer K, Gutmann A, Diricks M, et al. Saharoza sintaza: jedinstvena glikoziltransferaza za razvoj procesa biokatalitičke glikozilacije [J]. Biotechnol Adv, 2016, 34: 88-111.

[11]Cardini CE, Leloir LF, Chiriboga J. Biosinteza saharoze [J]. J Biol Chem, 1955, 214: 149-155.[12]Stein O, Granot