Sažetak

CiljIstražiti učinak snižavanja mokraćne kiseline i procjenu sigurnosti ehinakozida (Ech) ekstrahiranog izCistanche tubulosa. MetodeU testu akutne toksičnosti, KM miševima oralno je davan Ech u maksimalnoj koncentraciji dva puta dnevno za promatranje akutne toksičnosti. Model štakora s hiperurikemijom (HUA) uspostavljen je korištenjem 1,5 g·kg⁻¹ kalijevog oksonata + 0.1 g·kg⁻¹ adenina. Štakori s HUA modelom nasumično su podijeljeni u modelnu skupinu, skupinu s alopurinolom (30 mg·kg⁻¹) i skupine s niskom, srednjom i visokom dozom Ech (50, 75, 100 mg·kg⁻¹), s normalnom kontrolnom skupinom (n=10 po skupini). Lijekovi su primijenjeni intragastrično jednom dnevno tijekom 28 uzastopnih dana. Nakon primjene, štakori su žrtvovani, a serum je sakupljen kako bi se otkrili relevantni biokemijski pokazatelji i razine ksantin oksidaze (XOD); uočene su bubrežne histopatološke promjene. Organi su izvagani kako bi se izračunali koeficijenti organa; otkrivene su razine ekspresije srodnih gena i proteina u bubrežnom tkivu.RezultatiU ispitivanju akutne toksičnosti nisu uočene očite toksične reakcije. Ech je značajno smanjio razine mokraćne kiseline u serumu, značajno poboljšao bubrežnu funkciju i bubrežne tubularne/intersticijske lezije u štakora HUA modela i značajno regulirao razinu transkripcije i ekspresije proteina gena povezanih s transporterom urata u bubrežnom tkivu.ZaključakUčinak Ech-a na snižavanje mokraćne kiseline kod štakora HUA modela može biti povezan sa smanjenjem in vivo proizvodnje mokraćne kiseline, regulacijom bubrežne funkcije i modulacijom ekspresije uratnih prijenosnika, uz povoljnu sigurnost.Ključne riječi: Cistanche tubulosa; Echinacoside; Hiperurikemija; mokraćna kiselina; Transkripcija gena; Ekspresija proteina; Mehanizam djelovanja; Ocjena sigurnosti

 

 

 

Cistanche tubulosa(Schenk) R. Wight je često korištena biljka za tonificiranje bubrega u tradicionalnoj kineskoj medicini (TCM). Kao što je zabilježeno uKineska farmakopeja, nadopunjuje bubrežni yang, nadoknađuje esenciju i krv, a klinički se koristi za impotenciju i neplodnost, nedostatak esencije i krvi, te bolove u struku i koljenima. Feniletanoidni glikozidi su najzastupljenije i biološki najaktivnije komponente uCistanche tubulosa, pokazujući veliki potencijal za razvoj i primjenu. Naš istraživački tim prethodno je putem mrežne farmakologije i preliminarnih pokusa na miševima otkrio da ehinakozid (Ech) izCistanche tubulosaEkstrakt može imati učinak na snižavanje mokraćne kiseline, dok se njegov mehanizam i sigurnost rijetko objavljuju. Ova studija uzima patogenezu hiperurikemije kao ulaznu točku za ispitivanje farmakološkog učinka Ech-a na snižavanje mokraćne kiseline, s ciljem razjašnjenja njegovog mehanizma i procjene njegove sigurnosti.

1 Materijali i metode

1.1 Instrumenti, reagensi i životinje

7100 Automatski biokemijski analizator (Hitachi, Japan); Multiskan GO 1510 čitač mikropločica (Thermo, SAD); BG-Power600i sustav elektroforeze (Beijing Baijing Biotechnology Co., Ltd.); 7500 Fast Real-Time Fluorescent Quantitative PCR System (Applied Biosystems, SAD).

Cistanche tubulosa extract (Ech, self-prepared, chromatographic purity >98%); kalijev oksonat, adenin (Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.); kreatinin (CREA), mokraćna kiselina (UA), urea (UREA), adenozin deaminaza (ADA), alanin transaminaza (ALT), aspartat transaminaza (AST), setovi za analizu alkalne fosfataze (ALP) (Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd.); Komplet za ispitivanje aktivnosti XOD (Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.); antitijela URAT1, GLUT9, OAT1, OAT3 (Jiangsu Qinke Biotechnology); kozji anti-zečji IgG/HRP konjugat (Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd., serija: 245440113); DEPC (Amresco, SAD); M5 HiClear DL2000 DNA marker (Beijing Juhemai Biotechnology Co., Ltd.); TRIzol™ reagens (Thermo Fisher Scientific, SAD); 5× All-In-One RT MasterMix, EvaGreen Express 2× qPCR MasterMix-Low ROX (Aibimeng Biotechnology Co., Ltd.).

Četrdeset KM miševa SPF stupnja (mužjaci i ženke, 18–22 g) i 90 muških SD štakora SPF stupnja (150–180 g) osigurao je Centar za eksperimentalne životinje Medicinskog sveučilišta Xinjiang (licenca za proizvodnju br. SCXK Xin 2023-0001).

1.2 Metode i rezultati

1.2.1 Ispitivanje akutne toksičnosti

Pokuse na životinjama odobrio je Etički odbor Instituta za istraživanje lijekova Xinjiang (br. odobrenja IACUC-(Zhun)-2024-008, IACUC-(Zhun)-2024-009). Četrdeset KM miševa SPF stupnja nasumično je podijeljeno u kontrolnu skupinu i skupinu za liječenje (n=20, mužjaci i ženke) nakon karantene i aklimatizacije. Miševi su izgladnjeli preko noći sa slobodnim pristupom vodi prije primjene. PremaSmjernice za ispitivanje toksičnosti jedne doze tradicionalnih kineskih lijekova i prirodnih proizvodapripremljena je otopina maksimalne koncentracije (250 mg·mL⁻¹) koja može proći kroz iglu za mjerenje 12. KM miševima oralno je davano 40 mL·kg⁻¹ dva puta dnevno u intervalu od 4 sata, s kumulativnom dozom od 20 g·kg⁻¹. Opća stanja, boja dlake, aktivnost, hod, mentalno stanje, izmet i urin pomno su promatrani zbog simptoma toksičnosti, vremena početka, trajanja i oporavka. U liječenoj skupini nisu primijećene nuspojave toksičnih reakcija (npr. ograničena aktivnost, prostracija, bezvoljnost, smrt). Boja dlake, aktivnost, hod, mentalno stanje, izmet i urin ostali su normalni tijekom razdoblja promatranja. Tjelesna težina i unos hrane nisu pokazali značajne razlike između liječene i kontrolne skupine. Gruba obdukcija na kraju promatranja nije otkrila abnormalnosti u volumenu, boji ili teksturi organa.

 

Slika 1 Učinci Echo tjelesne težine (AB) i unosa hrane (C, D) kod miševa

 

1.2.2 Uspostava, grupiranje i administracija modela

Šezdeset mužjaka SD štakora (150-180 g) aklimatizirano je i podijeljeno u normalnu kontrolnu skupinu (n=10) i modelnu skupinu (n=50). Grupi za modeliranje intragastrično je primijenjeno 100 mg·kg⁻¹ adenina + 1.5 g·kg⁻¹ kalijevog oksonata (suspendiran u 0,5% CMC-Na) u dozi od 10 mL·kg⁻¹ jednom dnevno tijekom 14 dana; kontrolna skupina je primila 0,5% CMC-Na. Nakon modeliranja, prikupljena je krv iz orbite da se detektuju UREA, CREA i serumska mokraćna kiselina (SUA). Model se smatrao uspješnim kada su UREA, CREA i SUA bile značajno povišene. Štakori s uspješnim modelom HUA podijeljeni su u modelnu skupinu, skupinu alopurinola (30 mg·kg⁻¹) i skupine s niskom, srednjom i visokom dozom Ech (50, 75, 100 mg·kg⁻¹) (n=10 po skupini). Kako bi se održala stabilna hiperurikemija, svim skupinama osim kontrolne skupine intragastrično je primijenjeno 100 mg·kg⁻¹ adenin + 500 mg·kg⁻¹ kalijevog oksonata (0,5% CMC-Na suspenzija) svako jutro, i odgovarajući lijekovi svakog poslijepodneva tijekom 14 dana. Zatim su zaustavljena sredstva za modeliranje, dok je primjena lijeka nastavljena još 14 dana.

1.2.3 Određivanje SUA i mokraćne kiseline (UUA) u štakora

Nakon zadnje primjene, štakori su izgladnjeli preko noći sa slobodnim pristupom vodi. Urin je sakupljen, centrifugiran (3×10³ r·min⁻¹, 10 min), razrijeđen 1:9 fiziološkom otopinom i testiran na UUA pomoću biokemijskog analizatora. Krv je sakupljena pod anestezijom, a serum je odvojen (3×10³ r·min⁻¹, 10 min) za detekciju SUA. U usporedbi s kontrolnom skupinom, model skupina pokazala je značajno povećan SUA (P<0.05) and decreased UUA (P<0.01). The allopurinol group and low-, medium-, and high-dose Ech groups had significantly reduced SUA (P<0.05); the allopurinol group and medium-/high-dose Ech groups had significantly increased UUA (P<0.05 or P<0.01).

 

Slika 2 Učinak Ech na SUA(A) i UUA(B) u štakora modela hiperuricemije

 

1.2.4 Određivanje serumskih razina ADA i XOD u štakora

ADA u serumu mjeren je biokemijskim analizatorom; Aktivnost XOD detektirana je enzimski imunoanalizom (apsorpcija na 290 nm). U usporedbi s normalnom skupinom, skupina modela imala je značajno povišene ADA i XOD (P<0.01). Compared with the model group, the allopurinol group and all Ech dose groups had significantly reduced ADA (P<0.01); the allopurinol group and high-dose Ech group had significantly reduced XOD (P<0.01).

1.2.5 Određivanje razine UREE, CREA, ALT, AST, ALP u serumu

U usporedbi s normalnom skupinom, model skupina imala je značajno povišene UREA i CREA (P<0.05 or P<0.01). Compared with the model group, the allopurinol group had significantly reduced UREA (P<0.01); all Ech dose groups had significantly reduced UREA and CREA (P<0.05 or P<0.01); medium-/high-dose Ech groups had significantly reduced ALT (P<0.01); low-dose Ech group had significantly increased ALP (P<0.01).

1.2.6 Određivanje koeficijenta bubrežnog organa u štakora

Koeficijent organa=masa organa (mg)/tjelesna težina (g). U usporedbi s normalnom skupinom, modelna skupina imala je značajno smanjenu tjelesnu težinu natašte (P<0.01) and increased kidney and adrenal gland coefficients (P<0.05 or P<0.01). Compared with the model group, all Ech dose groups had significantly increased body weight (P<0.05); the allopurinol group and all Ech dose groups had significantly reduced kidney coefficients (P<0.01).

 

Tablica 1 Učinci Ech-a na razine UREA-e, CREA-e, ALT-a, AST-a i ALP-a kod štakora modela hiperurikemije (xˉ±s, n=10)

 

Skupina	Doza/mg·kg⁻¹	UREA / mmol·L⁻¹	CREA / μmol·L⁻¹	ALT / U·L⁻¹	AST / U·L⁻¹	ALP / U·L⁻¹
Kontrolirati	–	8.00 ± 0.71	34.11 ± 3.33	51.22 ± 3.80	109.11 ± 11.62	206.00 ± 42.20
Model	–	23.20 ± 6.05**	100.10 ± 43.59*	62.00 ± 9.64	109.10 ± 7.92	173.10 ± 27.30
alopurinol	30	10.70 ± 1.95##	55.20 ± 13.27	52.70 ± 12.79	117.50 ± 21.71	198.40 ± 52.66
Ech	50	11.20 ± 3.33##	44.80 ± 21.01#	55.70 ± 12.59	106.10 ± 13.80	242.11 ± 55.04##
	75	9.90 ± 1.45##	41.20 ± 4.54#	46.50 ± 5.72##	102.10 ± 16.11	183.70 ± 22.31
	100	8.90 ± 1.10##	35.20 ± 2.74#	46.50 ± 5.72##	106.00 ± 15.19	195.20 ± 33.96

Bilješka:U usporedbi s kontrolnom skupinom: *P<0.05, **P<0.01; compared with model group: #P<0.05, ##P<0.01

 

Tablica 2 Učinci Ech na organske koeficijente u štakora modela hiperurikemije (xˉ±s, n=10)

 

Skupina	Doza/mg·kg⁻¹	Tjelesna težina natašte / g	Koeficijent jetre	Bubrežni koeficijent	Koeficijent nadbubrežne žlijezde	Koeficijent slezene	Koeficijent timusa
Kontrolirati	–	403.6 ± 28.0	26.92 ± 3.15	6.57 ± 0.55	0.14 ± 0.04	1.88 ± 0.26	1.07 ± 0.15
Model	–	352.5 ± 38.5**	26.60 ± 1.78	11.52 ± 1.67**	0.18 ± 0.03*	2.12 ± 0.23	1.03 ± 0.17
alopurinol	30	367.5 ± 26.3	25.76 ± 1.14	7.93 ± 0.51##	0.16 ± 0.03	1.93 ± 0.35	1.08 ± 0.27
Ech	50	392.3 ± 28.3#	27.04 ± 2.14	8.06 ± 0.54##	0.16 ± 0.04	2.09 ± 0.24	1.09 ± 0.19
	75	388.4 ± 34.8#	26.78 ± 2.37	7.80 ± 0.78##	0.16 ± 0.02	2.00 ± 0.20	0.99 ± 0.25
	100	386.3 ± 41.4#	25.91 ± 1.46	7.58 ± 0.33##	0.18 ± 0.03	2.09 ± 0.28	1.17 ± 0.31

Bilješka:U usporedbi s kontrolnom skupinom: *P<0.05, **P<0.01; compared with model group: #P<0.05, ##P<0.01

 

 

 

1.2.7 Histopatološko promatranje bubrega štakora (HE bojenje)

Tkiva bubrega su fiksirana, dehidrirana, ugrađena, presječena (4 μm), obojena HE i zapečaćena. Skupina modela pokazala je lupanje epitelnih stanica bubrežnih tubula, nekrotičnu i upalnu infiltraciju stanica te žarišnu upalnu infiltraciju u bubrežnom intersticiju. Skupina liječena alopurinolom pokazala je blage lezije; Grupe koje su tretirane Ech-om pokazale su smanjeno odbacivanje epitelnih stanica, nekrozu i upalnu infiltraciju.

 

 

Slika 4. Bojenje slike tkiva bubrega kontrolne skupine (A), modelne skupine (B), alopurinolne skupine (C, D), niskog (E) i visokog
(F) skupine doza Ech (×400)

 

1.2.8 Ekspresija proteina URAT1, GLUT9, OAT1, OAT3 u bubregu štakora

Imunohistokemija je provedena kako bi se otkrila ekspresija proteina (integrirana optička gustoća, IOD). U usporedbi s normalnom skupinom, modelna skupina imala je značajno povišenu reguliranost URAT1 i GLUT9 (P<0.01) and downregulated OAT1 and OAT3 (P<0.05). Compared with the model group, the allopurinol group and all Ech dose groups had significantly downregulated URAT1 and GLUT9 (P<0.05, P<0.01) and upregulated OAT1 (P<0.05, P<0.01); the allopurinol group and medium-/high-dose Ech groups had significantly upregulated OAT3 (P<0.05, P<0.01).

 

Slika 5 Učinci EchonURAT1/IOD vrijednosti (A), GLUT9/IOD vrijednosti (B), OAT1/IOD vrijednosti (C) i OAT3/IOD vrijednosti (D) u
bubrežno tkivo hiperurikemije model štakora

 

Slika 6 Učinci Ech na bubrežnu ekspresiju URAT1 u štakora modela hiperurikemije

(Kontrolna skupina (A), modelna skupina (B), alopurinolna skupina (C) i 50, 75, 100 mg·kg⁻¹ Ech skupine (D–F); IHC ×400)

 

Slika 7 Učinci Ech-a na bubrežnu ekspresiju GLUT9 u štakora modela hiperurikemije

(Kontrolna skupina (A), modelna skupina (B), alopurinolna skupina (C) i 50, 75, 100 mg·kg⁻¹ Ech skupine (D–F); IHC ×400)

Slika 8 Učinci Ech na bubrežnu ekspresiju OAT3 kod štakora modela hiperurikemije

(Kontrolna skupina (A), modelna skupina (B), alopurinolna skupina (C) i 50, 75, 100 mg·kg⁻¹ Ech skupine (D–F); IHC ×400)

Slika 9 Učinci Ech na bubrežnu ekspresiju OAT1 kod štakora modela hiperurikemije

(Kontrolna skupina (A), modelna skupina (B), alopurinolna skupina (C) i 50, 75, 100 mg·kg⁻¹ Ech skupine (D–F); IHC ×400)

 

 

1.2.9 Ekspresija mRNA URAT1, GLUT9, OAT1, OAT3 u bubregu štakora

Ukupna RNA je ekstrahirana i obrnuto transkribirana; qPCR je proveden metodom 2⁻ΔΔCt. U usporedbi s normalnom skupinom, modelna skupina imala je značajno povišenu mRNA URAT1 i GLUT9 (P<0.05) and downregulated OAT1 and OAT3 mRNA (P<0.05). Compared with the model group, the allopurinol group and all Ech dose groups had significantly downregulated URAT1 mRNA (P<0.05); the allopurinol group and low-/medium-dose Ech groups had significantly downregulated GLUT9 mRNA (P<0.05); the allopurinol group and all Ech dose groups had significantly upregulated OAT1 and OAT3 mRNA (P<0.05).

 

Tablica 3 Primer sekvence

 

Ime bukvara	Redoslijed (5′ do 3′)	Veličina proizvoda
URAT1-	F: GTTCCCATGGCCTCCAGATTR: CATATGCATGCCACACAGCC	121 bp
GLUT9	F: TCTGCCTTGGCTGAGTATTGAR: ATGTGTCCCCCACATCATTGT	2147 bp
OAT1	F: TGTGAAGCCCTTCCGTTCTCR: TGTGAAGCCCTTCCGTTCTC	218 bp
OAT3	F: TACCTGCATGTGACCTTGCTGR: GAGACACTTCTCAGGCTTCCC	171 bp
-Aktin	F: CCCATCTATGAGGGTTACGCR: TTTAATGTCACGCACGATTTC	150 bp

 

1.2.10 Statistička analiza

Podaci su analizirani pomoću SPSS 20.0, izraženi kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (x̄±s). Jednosmjerna ANOVA korištena je za grupne usporedbe, a LSD ili Tamhaneov T2 za post-hoc testove. P<0.05 was considered statistically significant.

Slika 5 Učinci EchonURAT1/IOD vrijednosti (A), GLUT9/IOD vrijednosti (B), OAT1/IOD vrijednosti (C) i OAT3/IOD vrijednosti (D) u bubrežnom tkivu štakora modela hiperurikemije

 

2 Rasprava

Perzistentna hiperurikemija uzrokuje oštećenje bubrega izazvano mokraćnom kiselinom i mijenja biomarkere bubrežne funkcije. Ovo je istraživanje uspostavilo HUA model štakora korištenjem adenina u kombinaciji s kalijevim oksonatom, s UREA-om, CREA-om i SUA-om kao ključnim pokazateljima. Rezultati su pokazali da Ech izCistanche tubulosapoboljšana bubrežna funkcija i smanjena SUA u HUA modelu štakora, ispoljavajući terapijske učinke. Hiperurikemija nastaje zbog prekomjerne proizvodnje mokraćne kiseline i poremećenog izlučivanja. Jetreni XOD i ADA ključni su enzimi u sintezi mokraćne kiseline; prekomjerna proizvodnja je glavni uzrok HUA. Otprilike dvije trećine dnevne mokraćne kiseline izlučuje se putem bubrega, što čini disfunkciju bubrežnog izlučivanja primarnim pokretačem. URAT1 i GLUT9 posreduju u reapsorpciji mokraćne kiseline, dok OAT1 i OAT3 olakšavaju izlučivanje mokraćne kiseline - svi su ključni ciljevi za razvoj lijekova za snižavanje mokraćne kiseline. Ech je značajno smanjio jetrenu ADA i XOD, smanjio bubrežni URAT1/GLUT9 (protein i mRNA) i pojačao OAT1/OAT3 (protein i mRNA), što ukazuje da njegov učinak snižavanja mokraćne kiseline djeluje kroz smanjenje sinteze i regulaciju prijenosnika. U ispitivanju akutne toksičnosti kod miševa nije primijećena smrtnost ili očita akutna toksičnost. Ech je poboljšao bubrežnu funkciju i snizio jetreni ALT u HUA štakora bez utjecaja na AST ili organske koeficijente, potvrđujući povoljnu sigurnost. Zaključno, Ech ima značajne učinke na snižavanje mokraćne kiseline kod HUA štakora induciranih adenin-kalijevim oksonatom potiskivanjem sinteze mokraćne kiseline posredovane ADA/XOD, štiteći funkciju bubrega i uravnotežujući ekspresiju transportera urata, uz pouzdanu sigurnost za potencijalnu kliničku primjenu.

Reference

Zhang MH, Du JW, Zhang T, et al. Mehanizam Bixie Fenqing Wan u intervenciji štakora s hiperurikemijom reguliranjem ekspresije transportera urata [J]. Kineski časopis za eksperimentalne tradicionalne medicinske formule, 2023., 29(3): 1–8.

Niu YF, Zhou YF, Lin H, et al. Inhibicija 3,5,2',4'-tetrahidroksihalkona na proizvodnju mokraćne kiseline u hiperurikemijskih miševa izazvanih hipoksantinom [J]. Biološko-farmaceutski glasnik, 2018., 41(1): 99–105.

Frédéric L. Gout: ažuriranje [J]. Journal of Bone and Joint Surgery, 2019, 86(1): 103–115.

Takeo N, Kouhei O, Sho S, et al. Funkcionalna suradnja URAT1 (SLC22A12) i URATv1 (SLC2A9) u bubrežnoj reapsorpciji urata [J]. Nephrology Dialysis Transplantation, 2013, 28(3): 603–611.

Lee SY, Cho SS, Han KM, et al. Korejski crveni ginseng poboljšava razinu mokraćne kiseline u serumu snižavanjem URAT1 i povećanjem OAT1 i OAT3[J]. Biological & Pharmaceutical Bulletin, 2024, 47(11): 1876–1882.

Falah K, Zhang P, Nigam AK, et al. In vivo regulacija prirodnih proizvoda malih molekula, antioksidansa i hranjivih tvari pomoću OAT1 i OAT3[J]. Nutrijenti, 2024, 16(14): 2242.

 

Visokog sadržajaCistancheIzvor opskrbe biljkama za snižavanje mokraćne kiseline

Za institucije, praktičare i pojedince na koje se fokusiramobiljne terapije za smanjenje mokraćne kiselinei liječenje hiperurikemije,visoke čistoćeCistanche tubulosaekstraktje pouzdana prirodna sirovina s provjerenom učinkovitošću.

Osnovne prednosti izvora opskrbe

Visoko standardizirane aktivne komponente

Ehinakozid (Ech): veći ili jednak 10%–40%

Akteozid: veći ili jednak 4%–16%

Ukupni feniletanoidni glikozidi: veći od ili jednak 40%–85% (zadovoljava specifikacije za prehrambene i ekstraktne kvalitete za istraživanje i razvoj i razvoj proizvoda)

 

Baza i tvornica Cistanche

Kontaktirajte odmah

 

Služba podrške Wecistanche-Za više detalja o suradnji
E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com

 

Potvrđeni mehanizam za snižavanje mokraćne kiseline

Inhibira XOD/ADA za smanjenje sinteze mokraćne kiseline

Regulira URAT1/GLUT9/OAT1/OAT3 za poticanje izlučivanja mokraćne kiseline

Štiti funkciju bubrega i ublažava oštećenje bubrega povezano s hiperurikemijom

Sigurno i dobro se podnosi

Test akutne toksičnosti: Nema očitih nuspojava pri visokim dozama

Nema značajnog oštećenja jetre, bubrega ili glavnih organa

U skladu sa zahtjevima hrane i dodataka prehrani

Autoritativna veza za opskrbu

https://www.xjcistanche.com/cistanche-extract-product/herbal-cistanche-dietary-supplement-capsules.html

 

Ovaj izvor pruža standardiziraneCistanche tubulosaekstrakti, kapsule, tablete, oralne tekućine i prilagođene usluge obrade, podržavajući razvoj biljnih proizvoda za snižavanje mokraćne kiseline, klinička istraživanja i formulaciju dodataka prehrani.