Polisaharidi Cistanche Deserticola poboljšavaju starenje crijeva inhibiranjem aktivacije inflamasoma NLRP3

 

 

Starenje dovodi do postupnog pada brojnih fizioloških funkcija i povećava rizik od bolesti povezanih sa starenjem [1]. Istraživanja su pokazala da starenje ima značajan utjecaj na strukturu i funkciju crijeva [2]. Kao temeljni organ za probavu, metabolizam i imunološku obranu, starenje crijeva može uzrokovati malapsorpciju hranjivih tvari, metaboličke poremećaje i oslabljenu imunološku funkciju [3-4], čime se povećava osjetljivost na gastrointestinalne bolesti [5]. Kronična upala obilježje je starenja crijeva, no njezini molekularni mehanizmi još nisu u potpunosti razjašnjeni. Trenutno sredstva protiv starenja uglavnom uključuju beta-nikotinamid mononukleotid (NMN), rapamicin, dasatinib plus kvercetin i druge [3]. Među njima, NMN je ključni prekursor esencijalnog koenzima NAD+, a brojne studije su potvrdile da značajno odgađa starenje crijeva kod prirodno starih miševa; široko je prepoznat na terenu kao učinkovita intervencija [4-5]. Stoga je istraživanje relevantnih mehanizama i strategija intervencije od velike važnosti.

Cistanche oralni liker za bolesti povezane sa starenjem

Kontaktirajte sada i upoznajte uzgajivače cistanche u Kini

Usluga podrške Wecistanche-najvećeg izvoznika cistanche u Kini:
E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com

 

 

 

 

Upala 3 (NLRP3) obitelji receptora oligomerizacijske domene koja se veže na nukleotide je ključni regulator urođenog imuniteta i igra važnu ulogu u bolestima povezanim sa starenjem. Za njegovu aktivaciju potrebna su dva signala. Prvi signal: molekularni obrasci povezani s patogenom (PAMP) i molekularni obrasci povezani s oštećenjem (DAMP) induciraju ekspresiju NLRP3 i prekursora interleukina-1 (pro-IL-1). Drugi signal (kao što je efluks kalija i oštećenje mitohondrija) pokreće sklapanje inflamasoma, aktivira kaspazu-1 i cijepa pro-IL-1 i pro-IL-18 kako bi se proizveli zreli IL-1 i IL-18, potičući tako upalu [6]. Tijekom starenja, crijevna homeostaza je poremećena, što dovodi do oslobađanja proupalnih čimbenika kao što je lipopolisaharid (LPS), koji ustrajno aktivira inflamasom NLRP3, stvarajući kroničnu upalu niskog stupnja. Ovo dodatno pogoršava oštećenje crijevne barijere i disbiozu, mijenja ekspresiju proteina uskog spoja, povećava propusnost crijeva i ubrzava starenje crijeva [7-10].

Cistanche deserticola, cijenjena tradicionalna kineska ljekovita i prehrambena homologna biljka poznata kao "pustinjski ginseng", tonizira bubrežni yang, hrani esenciju i krv i vlaži crijeva za ublažavanje zatvora. Njegovi aktivni polisaharidi pokazuju svojstva protiv starenja, antioksidansa i zaštite crijeva [11-12]. U smislu zaštite crijeva, polisaharidi Cistanche deserticola (CDP) mogu modulirati ravnotežu crijevne mikrobiote inhibicijom aktivacije puta Toll-like receptora 4 (TLR4)/nuklearnog faktora kapa B (NF-κB), čime se smanjuju razine LPS-a i popravlja funkcija crijevne barijere [13-14]. CDP također može poboljšati funkciju mitohondrija putem aktivacije puta protein kinaze (AMPK)/sirtuin 1 (SIRT1) aktivirane AMP-om, odgoditi staničnu starenje, regulirati metabolizam lipida i ublažiti lipotoksično oštećenje u crijevnim epitelnim stanicama [15].

Iako su dokazani intestinalni zaštitni učinci CDP-a, ostaje nejasno poboljšavaju li oni starenje crijeva potiskivanjem inflamasomskog puta NLRP3. Ova studija ima za cilj istražiti mehanizam kojim CDP inhibiraju aktivaciju inflamasoma NLRP3 napoboljšati starenje crijeva.

Materijali

 

1.1 Pokusne životinje

Pedeset zdravih muških C57BL/6J miševa (10 u dobi od 2 mjeseca; 40 u dobi od 20 mjeseci) kupljeno je od Beijing Speifu Biotechnology Co., Ltd. Licenca za proizvodnju: SYXK (Peking) 2023-0011. Životinje su bile smještene u barijernom okruženju u Eksperimentalnom pogonu za životinje Pokrajinske bolnice tradicionalne kineske medicine Hebei pod sljedećim uvjetima: temperatura 22 ± 2 stupnja, relativna vlažnost 50% ± 10% i ciklus od 12 sati svjetlosti/12 sati tame. Svi miševi su se aklimatizirali 1 tjedan. Ovu studiju odobrio je Institucionalni odbor za skrb i korištenje životinja provincijske bolnice tradicionalne kineske medicine Hebei (IACUC-HPHCM-2025001).

 

1.2 Instrumenti i reagensi

 

Kriostat (Thermo Fisher; CryoStar NX50)

Laserski skenirajući konfokalni mikroskop (Nikon; AX)

PCR sustav u stvarnom vremenu (Thermo Fisher; 7500)

Multimodni čitač ploča (Tecan; Spark)

Beta-nikotinamid mononukleotid (Bontac, Kina; kat. BT05N120A005)

SA- -kit za bojenje (Solarbio, Peking; Cat. 250003003)

Komplet miša LPS ELISA (CUSABIO/Huamei, Wuhan; kat. CSB-E13066m)

TransZol Up Plus RNA komplet (TransGen Biotech, Peking; kat. ER501-01-V2)

MonAmp ChemoHS qPCR mješavina (Monad; kat. MQ00501S)

Lgr5 poliklonsko protutijelo (Wuhan Sanying; Cat. 30007-1-AP)

ZO-1 monoklonsko antitijelo, NLRP3 monoklonsko antitijelo, kaspaza-1 monoklonsko antitijelo, ASC monoklonsko antitijelo, GAPDH monoklonsko antitijelo, Ki67 monoklonsko antitijelo (Abcam; kat. ab307799, ab263899, ab179515, ab309497, ab8245, ab15580)

Metode

 

2.1 Priprema polisaharida Cistanche deserticola

Cistanche materijal (50 g) ekstrahiran je dva puta dekokcijom s 8-strukim volumenima vode, svaki put 1 sat. Filtrati su spojeni i ohlađeni na sobnu temperaturu. Dodan je bezvodni etanol do konačne koncentracije od 80% za taloženje. Nakon centrifugiranja, supernatant je odbačen. Talog je otopljen u vodi, dijaliziran, zatim liofiliziran da se dobije uzorak.

 

2.2 Grupiranje i administracija životinja

Nakon privikavanja, četrdeset 20-mjesečnih miševa C57BL/6J nasumično je raspoređeno u: skupinu prirodnog starenja, skupinu s niskom dozom CDP (2,5 g·kg−1), skupinu s visokom dozom CDP (5,0 g·kg−1) i NMN skupinu (200 mg·kg−1). Dodatnih deset 2-mjesečnih SPF C57BL/6J miševa poslužilo je kao mlada kontrolna skupina. Niska i visoka doza CDP-a dane su oralnom sondom od 2,5 g·kg−1 odnosno 5,0 g·kg−1. Korištenjem pretvorbe tjelesne površine i faktora pretvorbe čovjeka u miša od 12 [16], to odgovara otprilike 1× i 2× kliničkoj ekvivalentnoj dozi za odrasle. Skupina NMN primila je NMN 200 mg·kg−1 gavažom. Mlade kontrolne skupine i skupine prirodnog starenja primile su jednake količine fiziološke otopine (10 mL·kg−1). Tretmani su primjenjivani kontinuirano 2 mjeseca.

 

2.3 Priprema smrznutih dijelova

Miševi su anestezirani intraperitonealnom injekcijom natrijevog pentobarbitala (30 mg·kg-1) i eutanazirani. Trbuh je brzo otvoren, mezenterij je odvojen, a tkivo ileuma je sakupljeno i presječeno na 5 µm za smrznute rezove [17].

 

2.4 SA- -gal test za aktivnost intestinalne -galaktozidaze

Bojanje je provedeno prema uputama SA- -gal kita. Nakon inkubacije, otopina za bojenje je uklonjena i sekcije su isprane s PBS. Slike su prikupljene pomoću invertnog mikroskopa.

 

2.5 PCR u stvarnom vremenu za sekretorni fenotip povezan sa starenjem (SASP)

Ukupna RNA iz tkiva ileuma ekstrahirana je korištenjem TransZol Up Plus kompleta. Obrnuta transkripcija izvedena je GoScript sustavom pod sljedećim uvjetima: 42 stupnja 15 minuta, 70 stupnjeva 15 minuta, 4 stupnja 10 minuta. PCR u stvarnom vremenu proveden je pomoću MonAmp ChemoHS qPCR Mix sa sljedećim ciklusima: 95 stupnjeva 10 min; zatim 40 ciklusa od 95 stupnjeva 15 s, 60 stupnjeva 1 min. Krivulja taljenja: 95 stupnjeva 15 s, 60 stupnjeva 15 s, 95 stupnjeva 15 s. GAPDH je služio kao interna referenca, a relativna kvantifikacija korištena je 2^-ΔΔCt metoda. Primeri su kupljeni od Promege. Nizovi primera prikazani su u tablici 1.

 

2.6 Imunofluorescentno bojenje za ekspresiju ZO-1

Ilealno tkivo je fiksirano u 4% paraformaldehidu i parafinski presječeno na 5 µm. Sekcije su permeabilizirane s 0,3% Triton X-100 tijekom 15 minuta i blokirane s 10% kozjim serumom tijekom 1 sata na sobnoj temperaturi. Primarno antitijelo protiv ZO-1 (1:200) primijenjeno je preko noći na 4 stupnja. Nakon ispiranja PBS-om, Cy3-konjugirano sekundarno protutijelo (1:500) inkubirano je 1 sat na sobnoj temperaturi u mraku. Jezgre su obojene DAPI 5 minuta. Stakalca su montirana s antifade medijem i snimljena konfokalnom mikroskopijom. Intenzitet fluorescencije je kvantificiran pomoću softvera Image-Pro.

2.7 Imunohistokemija za ekspresiju Ki67 i Lgr5

Ilealni odsječci su inkubirani s primarnim antitijelima Ki67 (1:1000) i Lgr5 (1:200) preko noći na 4 stupnja prema protokolu IHC kita, zatim s odgovarajućim sekundarnim antitijelima. DAB je korišten za kromogeni razvoj. Rezultati su promatrani svjetlosnim mikroskopom. Srednja optička gustoća je kvantificirana pomoću softvera Image-Pro.

 

2.8 ELISA za razine LPS

Standardi i uzorci (100 μL po jažici) dodani su na ploču i inkubirani na sobnoj temperaturi 1,5 h. Zatim je dodana otopina streptavidina konjugirana s HRP-om (100 μL po jažici) i inkubirana 30 minuta. Supstrat je dodan pod uvjetima zaštićenim od svjetla i reagirao je 30 minuta. Reakcija je prekinuta otopinom za zaustavljanje, a apsorbancija je izmjerena na 450 nm.

 

2.9 Western blot za NLRP3, kaspazu-1 i ASC

Otprilike 30 mg tkiva ileuma samljeveno je u tekućem dušiku. Dodan je pufer za lizu RIPA koji sadrži inhibitore proteaze/fosfataze; lizati su inkubirani na ledu 30 minuta i centrifugirani na 12,000 x g, 4 stupnja 15 minuta da se sakupe supernatanti. Koncentracija proteina određena je BCA testom i podešena na 2 ug/μL. Jednake količine proteina (20-40 ug) odvojene su SDS-PAGE i prebačene na PVDF membrane. Membrane su blokirane s 5% nemasnog mlijeka 1 h na sobnoj temperaturi, inkubirane s primarnim protutijelima (NLRP3 1:1000, kaspaza-1 1:500, ASC 1:1000) preko noći na 4 stupnja, zatim s HRP-konjugiranim sekundarnim protutijelima (1:5000) 1 h na sobnoj temperaturi. Nakon TBST ispiranja, razvijeni su signali. Intenziteti trake su normalizirani na GAPDH.

 

2.10 Statistička analiza

Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± standardna devijacija. Statistička analiza i crtanje grafikona provedeni su pomoću programa SPSS 26.0 i GraphPad Prism 8.0.2. Jednosmjerna ANOVA korištena je za procjenu razlika među skupinama, nakon čega je slijedio Tukeyev post hoc test. Statistička značajnost postavljena je na P < 0,05.

 

Praktične napomene za čitatelje zainteresirane za motilitet crijeva i razvoj suplemenata

 

Funkcionalni fokus Cistanche deserticola: Tradicionalno se koristi za vlaženje crijeva i ublažavanje zatvora; suvremena podrška podacima, podrška barijerama, modulacija upale (TLR4/NF-κB) i funkcija mitohondrija putem AMPK/SIRT1.

Ovdje istražen potencijalni mehanizam protiv starenja crijeva: supresija aktivacije inflamasoma NLRP3; smanjenje upale niskog stupnja uzrokovane LPS-om; očuvanje tijesnih spojeva (npr. ZO-1); održavanje epitelne proliferacije/markera stabljike (Ki67, Lgr5).

Tipične eksperimentalne oralne doze kod miševa: 2,5–5,0 g·kg−1 CDP-a tijekom 2 mjeseca; NMN 200 mg·kg-1 kao pozitivna kontrola.

Oprez pri prijevodu: Doze za miševe nisu izravne preporuke za ljude. Studija koristi skaliranje površine tijela; ljudsko-ekvivalentna formulacija i sigurnost, testiranje identiteta i GMP proizvodnja neophodni su prije razvoja proizvoda.