Identifikacija vrsta i analiza kemijskog sastava divljih biljaka Cistanche iz Kenije

Sažetak:Ova studija koristila je morfologiju biljaka, histologiju i tehnike DNK barkodiranja za identifikaciju divlje vrste Cistanche u Keniji. HPLC metodom određen je udio glavnih aktivnih komponenti, uključujući feniletanoidne glikozide, šećerne alkohole i betain, u divljoj Cistanche iz Kenije. U međuvremenu je obavljena analiza otisaka prstiju. Rezultati su pokazali da je divlja biljka Cistanche prikupljena iz Kenije identificirana kao Cistanche senegalensis (Reut.) Beck. Sadržaj aktivnih sastojaka kao što suehinakozid,cistanozid A, akteozid, izoakteozid, i 2'-acetilakteozida u C. senegalensis iz Kenije bili su niži od onih u domaćem C. tubulosa, ali viši od onih u domaćem C. deserticola. Sadržaj betaina bio je sličan onome u domaćoj C. deserticola, ali ne sadrži glukozu. Svojstva otiska prsta sličnija su onima domaće C. tubulosa. Ova studija pruža osnovu za zaštitu resursa, dubinsko istraživanje i razvoj resursa Cistanche u Keniji.

Ključne riječi: Cistanches Herba; Cistanche senegalensis (Reut.) Beck; Kenija; identifikacija vrste; DNK barkodiranje; određivanje sadržaja

 

 

 

Cistanche deserticolaYC Ma

 

Cistanche, cijenjena biljka u tradicionalnoj kineskoj medicini, odnosi se na osušene, ljuskave, sočne stabljike pustinjskih biljaka kao što suCistanche deserticolaYC MaiCistanche tubulosa(Schenk) Wight, oboje članovi obitelji Orobanchaceae. Poznata po svojoj sposobnosti da tonizira bubrežni yang, hrani esenciju i krv i vlaži crijeva radi ublažavanja zatvora, Cistanche je stoljećima slavljena u kineskim biljnim tekstovima. Njegov najraniji medicinski zapis pojavljuje se u drevnim klasicimaShennongov klasik Materije Medice, gdje je Cistanche klasificirana kao biljka "vrhunskog razreda". Tijekom povijesti, brojni tradicionalni medicinski tekstovi dokumentirali su snažne dobrobiti Cistanche, zaradivši cijenjeni nadimak "Ginseng iz pustinje".

Različiti farmakološki učinci Cistanche pripisuju se nizu bioaktivnih spojeva. Među njima su feniletanoidni glikozidi primarni aktivni sastojci odgovorni za djelovanje Cistanche na tonificiranje bubrega i hranjenje srži. Ovi spojevi - kao što su ehinakozid i akteozid - pokazuju neuroprotektivno djelovanje, djelovanje protiv demencije, starenja i hepatoprotektivno djelovanje. Naime, ehinakozid i akteozid dva su referentna spoja koji se koriste za kontrolu kvalitete Cistanche kako je navedeno u izdanju Kineske farmakopeje iz 2020. Osim toga, laksativni učinak Cistanche uglavnom je posljedica njegovih oligosaharidnih alkoholnih komponenti, uključujući betain, manitol, fruktozu, glukozu i saharozu. Ovih pet komponenti naširoko su prepoznati kao pokazatelji sposobnosti Cistanchea da vlaži crijeva i potiče rad crijeva.

Cistanche tubulosa(Schenk) Wight

U Kini glavne vrste Cistanche uključujuCistanche deserticolaYC Ma,Cistanche tubulosa(Schenk) R. Wight,Cistanche salsa(CA Mey.) G., iCistanche sinensisG. Beck. Ove vrste su porijeklom iz regija kao što su Unutarnja Mongolija, Ningxia, Gansu i Xinjiang. Izvan sjeverozapadne Kine, vrste Cistanche također su rasprostranjene u sušnim i pustinjskim regijama Euroazije i sjeverne i istočne Afrike, uključujući zemlje poput Irana, Afganistana, Kenije, Pakistana i Mongolije.

Kenija, koja se nalazi u istočnoj Africi i prostire se preko ekvatora, uglavnom se sastoji od visoravni s prosječnom nadmorskom visinom od 1500 metara, ali njezina sjeverna područja su pustinja ili polupustinja. Autohtoni narodi Kenije imaju dugu povijest korištenja ljekovitih biljaka za liječenje. Regija se može pohvaliti bogatstvom ljekovite flore - na primjer, ekstrakti iz kore i korijena stabla četkice za zube (Salvadora PersicaL.) poznati su po svojim protuupalnim i antibakterijskim svojstvima i često se koriste za liječenje zubobolje i infekcija. Kora sandalovine (Osyris lanceolataHochst. & Steud.) koristi se za liječenje proljeva, dok se uvarci Maasai koprive (Urtica massaicaMildbr.) listovi se koriste protiv bolova u želucu. Ova bogata tradicija potaknula je živu kulturu ljekovitog bilja, ali zbog izazova gospodarskog razvoja, upotreba ovih ljekovitih biljaka nije u potpunosti dokumentirana niti sustavno proučavana.

Zanimljivo je da se vrste Cistanche u Africi često smatraju korovom i nisu dobile mnogo pozornosti niti istraživanja. Zapravo, gotovo da nema objavljenih studija o afričkoj cistanči. Odgovarajući na poziv Odjela za regionalni razvoj sušnih i polusušnih zemalja Istočnoafričke zajednice, naš istraživački tim proveo je terensku studiju u Keniji kako bi istražio lokalne resurse Cistanche. Prikupili smo divlje primjerke Cistanche, proveli botaničku identifikaciju i analizirali njihove primarne bioaktivne spojeve. Cilj je bio razumjeti raznolikost vrsta i razvojni potencijal Cistanche u Keniji, te pružiti znanstvenu osnovu za daljnja istraživanja i korištenje ovih vrijednih pustinjskih biljaka.

Cistanche tubulosa sušeni cijeli korijen Prodaja u Kini

Whatsapp za više detalja

 

 

Materijali i metode

Biljni materijali

Uzorke divlje Cistanche iz Kenije prikupili su u kolovozu 2023. profesori Pengfei Tu i Yong Jiang sa Fakulteta farmaceutskih znanosti Pekinškog sveučilišta u Kajiadu, Kenija (01 stupanj 50'01"J; 36 stupanj 47'00"E). Sakupljene su dvije divlje biljke Cistanche i označene K1 i K2, zajedno s korijenjem njihove biljke domaćina (vidi sliku 1). Biljku domaćina identificirao je Kennedy Matheka, znanstveni asistent u Istočnoafričkom herbariju, Nacionalni muzeji Kenije, kaoSericocomopsis hildebrandtiiSchinz, pripada obitelji Amaranthaceae. Uzorci odCistanche deserticolaiCistanche tubulosaprikupljeni su iz grada Turpan i okruga Yutian u autonomnoj regiji Xinjiang Uygur, a autentičnost ih je potvrdio profesor Pengfei Tu kao svježe sočne stabljikeCistanche deserticolaYC Ma iCistanche tubulosa(Schrenk) Wight. Svi primjerci kupona čuvaju se u našem laboratoriju.

instrumenti

Waters Arc HPLC sustav

Quintix125D-1CN elektronička vaga (Sartorius, Peking)

Olympus BX-50 optički mikroskop (Olympus, Japan)

NanoZoomer-SQ panoramski dijapozitiv skener (Hamamatsu Photonics, Japan)

KQ500DE digitalni ultrazvučni čistač (Kunshan Ultrasonic Instruments, Kina)

Mlinac za ekstrakciju DNA MM400 (Retsch, Njemačka)

PCR termalni cikler (Analytik Jena, Njemačka)

DYY-8C aparat za elektroforezu i spremnik (Liuyi Instrument Factory, Peking)

MINI Space 1000 gel sustav za snimanje (Tanon, Šangaj)

Inkubator konstantne temperature (Yiheng, Šangaj)

Reagensi

Ehinakozid (lot: DST191008-038), akteozid (DSTDL006101), izoakteozid (DST210601-060), D-manitol (DSTDG006201) kupljeni su od Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.; tubulozid A (MUST-15040115), 2'-acetilakteozid (MUST-15071504), betain (MUST-23082505), bezvodna D-glukoza (MUST-23030214), fruktoza (MUST-23031403) i saharoza (MUST-23082505) dobiveni su od Chengdu Mansite Biotechnology Co., Ltd. Metanol (HPLC stupanj, Thermo Fisher), acetonitril (HPLC stupanj, OCEANPAK), mravlja kiselina (HPLC stupanj, VOKA reagensi) svi su bili kromatografske čistoće. Komplet za ekstrakciju biljne genomske DNA (DP305, Tiangen Biotech, Kina) i ultračista voda korišteni su za molekularnu analizu.

Priprema, bojenje i promatranje sukulentnih dijelova stabljike

Slijedeći metodu iz reference [10], svježe sukulentne stabljike Cistanche izrezane su na odgovarajuće veličine i sačuvane u FAA fiksativu (70% etanol: ledena octena kiselina: formaldehid=90:5:5). Nakon ispiranja tekućom vodom kako bi se uklonio zaostali fiksativ, tkiva su omekšana fluorovodičnom kiselinom, obojena safraninom, dehidrirana, utopljena u parafin i izrezana. Nakon postavljanja stakalca su pečena, parafin otopljen, a sekcije obojene 95%-tnom otopinom etanola Fast Green, zatim zapečaćene neutralnom smolom. Morfologija tkiva promatrana je pod mikroskopom, a dobro oblikovani dijelovi skenirani su pomoću panoramskog skenera kako bi se dobile slike visoke rezolucije.

Ekstrakcija DNA, PCR amplifikacija i sekvenciranje

Ukupna DNK iz uzoraka Cistanche i korijena biljke domaćina ekstrahirana je korištenjem kompleta za ekstrakciju genomske DNK biljke (Tiangen), prema protokolu proizvođača. Koncentracije DNA i omjeri OD260/OD280 izmjereni su mikrovolumenskim UV spektrofotometrom za procjenu kvalitete prije nastavka.

PCR amplifikacija ciljala je unutarnju transkribiranu regiju razmaknice 2 (ITS2) ribosomske DNA i kloroplastnog psbA-trnH gena za molekularnu identifikaciju [11]. Nizovi primera bili su sljedeći:

ITS2 naprijed: 5'-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3'

ITS2 naličje: 5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'

psbA-trnH naprijed: 5'-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3'

psbA-trnH naličje: 5'-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3'

PCR reakcije (25 µL) uključivale su 12,5 µL 2× Taq Master Mix, 1 µL prednjeg i obrnutog početnica (2,5 µmol·L⁻¹), 2 µL DNA šablona i 8,5 µL ddH₂O. ITS2 pojačanje: 94 stupnja 5 min; zatim 35–40 ciklusa od 94 stupnja 30 s, 56 stupnjeva 30 s, 72 stupnja 45 s; konačno produženje na 72 stupnja 10 min. psbA-trnH pojačanje: 95 stupnjeva 4 min; 35 ciklusa od 94 stupnja 30 s, 55 stupnjeva 1 min, 72 stupnja 1 min; konačno produženje na 72 stupnja 10 min. PCR proizvodi analizirani su gel elektroforezom, a ciljne trake podvrgnute su Sangerovom dvosmjernom sekvenciranju. Kromatogrami sekvenci analizirani su korištenjem CodonCode Aligner (v3.7.1, CodonCode Co., SAD) kako bi se dobile ciljne sekvence DNK, koje su identificirane pomoću kineskog Materia Medica DNA barcode sustava i BLAST analize u bazi podataka GenBank. Filogenetska stabla konstruirana su pomoću softvera MEGA X za identifikaciju vrsta.

Kvantitativno određivanje pet feniletanoidnih glikozida

Sadržaj pet feniletanoidnih glikozida određen je prema prethodno utvrđenim metodama [13]. Priprema referentnih otopina: točno izvažite ehinakozid, tubulozid A, akteozid, izoakteozid i 2'-acetilakteozid i otopite u 50% metanolu kako biste pripremili miješanu standardnu ​​otopinu unaprijed određene koncentracije. Kromatografski uvjeti: kolona Phenomenex Luna C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm); mobilna faza A: acetonitril–metanol (6:1, v:v); mobilna faza B: 0,1% pufer mravlja kiselina; elucija gradijenta: 0–5 min, 10%–18% A; 5–15 min, 18%–24% A; 15-20 min, 24%-26% A; 20-28 min, 26%-30% A; 28–35 min, 30%–35% A. Brzina protoka: 1,0 mL·min⁻¹; temperatura stupca: 30 stupnjeva; valna duljina detekcije: 330 nm. Metoda: ubrizgajte 10 μL standardne otopine i otopine uzorka u HPLC za analizu.

Kvantitativno određivanje betaina, manitola, fruktoze, glukoze i saharoze

Ove komponente su kvantificirane prema prethodnim metodama [14]. Referentne otopine: točno izvagati betain, manitol, fruktozu, glukozu i saharozu, otopiti u vodi kako bi se pripremila miješana standardna otopina. Otopine uzoraka: razrijedite otopinu uzorka Cistanche (pripremljenu kao gore) s 50% metanolom do 1/5 izvorne koncentracije, dobro promiješajte i filtrirajte kroz mikroporoznu membranu od 0,22 μm. Kromatografski uvjeti: stupac Shodex ASHAIPAK NH2P-50 4E (250 mm × 4,6 mm, 5 μm); mobilna faza: acetonitril–voda (77:23); brzina protoka: 0,7 mL·min⁻¹; temperatura stupca: 25 stupnjeva; detekcija s evaporativnim detektorom raspršenja svjetlosti (ELSD): temperatura drift cijevi 100 stupnjeva, protok plina nosača 3 L·min⁻¹. Kvantifikacija je provedena ubrizgavanjem 5 μL i 10 μL standardne otopine i 5 μL otopine uzorka, te izračunavanjem sadržaja pomoću vanjske standardne logaritamske jednadžbe u dvije točke.

Procjena sličnosti otisaka prstiju

Otopine uzoraka pripremljene su kako je gore opisano, a HPLC uvjeti i metode bili su isti kao za kvantifikaciju feniletanoidnog glikozida. Kromatografski podaci uvezeni su u "Sustav za procjenu sličnosti kromatografskih otisaka prstiju tradicionalne kineske medicine (izdanje 2012.)". Kromatogram uzorka K1 korišten je kao referenca, s pet pikova feniletanoidnog glikozida označenih za korekciju u više točaka, generiranje preklapanja i referentnih kromatograma i izračunavanje sličnosti otiska prsta.

 

 

Rezultati i analiza

1. Morfološka identifikacija Cistanche

Divlji primjerci Cistanche prikupljeni u Keniji pokazuju karakteristične morfološke karakteristike. Cvat je klasast, s jednom braktejom dugojajoličasto-lancetastog oblika i dvije male brakteje s obje strane gole. Čaška je cjevasta, s pet tupih režnjeva na vrhu. Vjenčić je cjevasto zvonast, duljine 3-4 cm, oko 2,5 puta duži od čaške, s pet režnjeva na vrhu i uvijenim rubovima. Vjenčić je žute boje (slika 1A, B), a sušenjem postaje smeđi. Niti su duge otprilike 3 cm, s nekoliko finih dlačica na dnu. Vrh je nešto duži od prašnika, a stigma je gotovo sferična, glatka i gola. Prašnika ima četiri, s dugojajolikim prašnicima koji su gusto obrasli dugim vunastim dlakama; baza prašnika je naglo zašiljena. Ova značajka je u skladu s opisimaCistanche deserticolaiCistanche salsau "Kineskoj flori"; nasuprot tome, baza prašnika odCistanche tubulosaje tup i zaobljen, što ga jasno razlikuje od ostalih vrsta u istom rodu [7].

Osim toga, biljka domaćin,Sericocomopsis hildebrandtiiSchinz je jako razgranat grm. Njegove mlade grane gusto su obrasle blijedožutim ili bijelim vunastim dlakama. Listovi su široko lopatičasto jajasti s uskom bazom (slika 1D, E). Cvatovi su gusto skupljeni uz peteljku koja je zajedno s osi cvata prekrivena sivkastobijelim ili blijedosivim ili bijelim vunastim dlakama.

Sočna stabljika divlje cistanke je plosnato-valjkasta, blijedožute ili smećkaste površine gusto prekrivena igličastim mesnatim ljuskama poredanim u nizove. Tekstura je čvrsta, ali blago fleksibilna (Slika 2A). Poprečni presjek stabljike sukulenta je blijedožut ili smećkast, s razasutim blijedosmeđim vaskularnim snopovima vidljivim golim okom (Slika 2B). Pod mikroskopom vaskularni snopovi izgledaju jajoliki ili fuziformni, sastavljeni od ksilema i floema, često prisutni kao pojedinačni raštrkani snopovi ili grupirani u parovima ili trijima, s floemom usmjerenim u različitim smjerovima (Slika 2C, D). Prema izdanju Kineske farmakopeje iz 2025., presjekCistanche deserticolaje smećkast, sa svijetlo smeđim točkastim vaskularnim snopovima raspoređenim u valoviti prsten, često tvoreći prstenasti snop savijen iznutra; nasuprot tome,Cistanche tubulosaprikazuje raštrkane vaskularne snopove nalik na točkice, što je ključno razlikovno obilježje za identifikaciju ove dvije vrste Cistancheovih rezova [1]. Divlji Cistanche iz Kenije također pokazuje raštrkane točkaste vaskularne snopove na poprečnom presjeku, u skladu s karakteristikamaCistanche tubulosa.

 

 

Slika 2 Izgled i karakteristike poprečnog presjeka divlje biljke Cistanche (K2) u Keniji. O: Izgled stabljike; B: Presjek mesnate stabljike; C: Parafinski presjek mesnate stabljike (safranin brzo zeleno bojenje); D: Uvećani prikaz vaskularnog snopa u parafinskom presjeku