Studija za Cistanche kemijskih profila i metabolita

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

Zhe Li, Lkhaasuren Ryenchindorj, Bonan Liu, Ji Shi, Chao Zhang, Yue Hua, Pengpeng Liu, Guoshun Shan & Tianzhu Jia

Sažetak

Pozadina: Prerada kineske materije medice istaknuta je i jedinstvena farmaceutska tehnika u tradicionalnoj kineskoj medicini (TCM) koja se koristi za smanjenje nuspojava i povećanje ili čak promjenu terapeutske učinkovitosti sirovog bilja. Promjene esencijalnih komponenti izazvane optimiziranim postupkom obrade prvenstveno su zaslužne za povećanu učinkovitost ljekovitog bilja. Osnažujući učinak na bubrege Cistancha deserticola (C. deserticola) kuhana u rižinom vinu bio je jači od sirove C. deserticola (CD). Metode: Provedena je usporedna analiza pomoću UPLC-Q-TOF-MSE s informatičkom platformom UNIFI kako bi se utvrdio utjecaj obrade. Provedene su in vitro studije za karakterizaciju sastojaka kao imetabolitiin vivo. Thekemijskikomponente su određene u CD-u i njegovim prerađenim proizvodima. Provedene su multivarijatne statističke analize kako bi se procijenile varijacije među njima, dok je OPLS-DA korišten za usporedbu po parovima. Rezultati: Rezultati ove studije otkrili su značajne varijacije u feniletanoidnim glikozidima (PhG) i iridoidima nakon obrade. U ekstraktima CD-a i njegovim prerađenim produktima otkriveno je ukupno 97 spojeva. PhG s 4'-O-kafeoilnom skupinom u 8-O- -D-glukopiranozilnom dijelu, poput akteozida, cistanozida C, kampneozida II, osmantusida smanjio se nakon obrade, dok su PhG s 6'-O- kafeoilne skupine u 8-O- -D-glukopiranozilnom dijelu, kao što su izoacetozid, izocistanozid C, izokampneozid I, izomartinozid povećan, posebno u CD-NP skupini. Povećao se i intenzitet ehinakozida i cistanozida B čija struktura posjeduje 6'-O- -D-glukopiranozilni dio. U in vivo studiji, 10 komponenti prototipa i 44metabolitiotkriveni su u plazmi štakora, izmetu i urinu. Dobiveni rezultati otkrili su da obrada dovodi do značajnih varijacija ukemijskisastavni dijelovi CD-a i utječu na dispoziciju spojeva in vivo, a metabolički procesi faze II ključne su kaskade svakog spoja, a većinametabolitisu povezani s ehinakozidom ili akteozidom. Zaključci: Ovo je prvo globalno usporedno istraživanje sirovog i obrađenog CD-a. Ovi nalazi doprinose našem razumijevanju utjecaja obrade CD-a i daju važne podatke za buduća ispitivanja učinkovitosti.

Studija za cistanche kemijskih profila i metabolita

Uvod

Kineska materia medica (CMM) obrada pokazala je značajnu primjenjivost u kliničkoj praksi tradicionalne kineske medicine (TCM) i smatra se održivim tretmanom nekoliko stoljeća. Ovo je jedinstvena farmaceutska tehnologija koja je izvedena iz teorije TCM-a. Nakon obrade značajne razlike u izgledu,kemijskiUtvrđeni su sastojci, karakteristike i medicinski značaj svih vrsta TCM-a, što dovodi do pretpostavke da bi obrada mogla poboljšati učinkovitost ili smanjiti toksične učinke TCM-a.

Stotinama godina,Cistanche deserticola(Roucongrong na kineskom, CD) obično se koristi u TKM kliničkoj praksi za nadopunjavanje funkcija bubrega. Također pomaže u vlaženju crijeva što dovodi do opuštanja crijeva [1].Cistancheje prvi put zabilježen u ShenNongBencaoJingu. Obično se nalazi u sušnim i polusušnim staništima diljem Euroazije i Sjeverne Afrike, uključujući Iran, Kinu, Indiju i Mongoliju [2]. Obrada CD-a provedena je kuhanjem na pari s rižinim vinom pod normalnim tlakom, što je metoda pripreme dokumentirana u kineskoj farmakopeji (Jiucongrong na kineskom, u daljnjem tekstu "CD-NP"). A kuhanje CD-a na pari s rižinim vinom pod visokim tlakom je učinkovitija metoda pripreme (u daljnjem tekstu "CD-HP") [3, 4]. Nekoliko je studija pokazalo da se farmakološki učinci CD-a razlikuju od njegovih prerađenih proizvoda [5]. CD može tonizirati bubrežni yang i opustiti crijeva, dok bi nakon kuhanja rižinim vinom učinak obnavljanja bubrežnog yanga bio pojačan. U našoj ranijoj studiji, otkriveno je da CD-NP može poboljšati tonizaciju bubrega i podržati yang, te ublažiti učinak vlaženja crijeva i defekacije [6,7,8]. U kliničkoj praksi prerađeni proizvodi su najčešće korišteni oblik.

Do danas je nekoliko studija analiziralokemijskikomponente CD-a, nakon čega slijedi izolacija i identifikacija više od 100 spojeva [9,10,11], kao što su feniletanoidni glikozidi (PhG), iridoidi, lignani i oligosaharidi kao njegovi glavni kemijski sastojci. Također je objavljeno da postoje mnoge farmakološke aktivnosti PhG uključujući imunomodulatorne, neuroprotektivne, hepatoprotektivne, protuupalne, antioksidativne, itd. [12,13,14]. Iridoidi posjeduju protuupalno djelovanje [15, 16]. Ranije studije također su otkrile da su neke kemijske komponente pokazivale varijacije tijekom obrade [17,18,19,20]. Na temelju ovih izvješća, može se pretpostaviti da će naknadna obrada, varijacije ukemijskisastav dovodi do različitih farmakoloških učinaka, koje je potrebno dodatno istražiti.

U trenutnoj studiji, osjetljiva i učinkovita metoda, tj. tekućinska kromatografija ultravisoke učinkovitosti u kombinaciji s TOF-MSE (UPLC-Q-TOF-MSE) provedena je za komparativnu analizu, a in vitro studije provedene su za kvalitativno analiziranje ekstrakata CD-a, CD-NP-a i CD-HP-a za razjašnjavanje njihovih kemijskih profila. Općenito, egzogenikemikalijes visokom izloženošću u ciljnim organima smatraju se učinkovitim komponentama. Stoga su štakorima CD i njegovi prerađeni proizvodi davani oralno, nakon čega je slijedila njihova karakterizacija. Postojeća studija po prvi put otkriva komparativnu studiju (i in vitro i in vivo) sirovog i prerađenog CD-a. Dobiveni rezultati proširili bi naše razumijevanje o učinku obrade CD-a, što bi moglo biti od pomoći za daljnja istraživanja.

cistanche kemijskih profila i metabolita

Materijali i metode

Materijali

Standardne spojeve ajugola (180120) i 2'-aktilacetozida (M0601AS) osigurao je Chendu Pure Chem-Standard Co., Ltd (Chengdu, Kina). Cistanozid F (MUST-17022620), ehinakozid (D1105AS), cistanozid A (M0906AS) i izoakteozid (M0106AS) osigurala je kompanija Must (Sichuan Kina); akteozid (O0618AS), salidrozid (J0526AS), katalpol (S0728AS), genipozid (A0407AS) i genipozidna kiselina (MB6001-S) nabavljeni su od Dalian Meilun Bio.Co., Ltd (Dalian, Kina). 8-epideoksiloganska kiselina (B31123) dobivena je od Shanghai Yuanye Biological Technology Co., Ltd, Kina. Metanol i acetonitril bili su MS-grade i nabavljeni od Merck KGaA, Darmstadt, Njemačka. Metansku kiselinu (CH2O2) HPLC stupnja osigurao je Merck KGaA (Darmstadt, Njemačka). Voda korištena u postojećoj studiji obrađena je putem Milli-Q sustava (18,2 MΩ, Millipore, Ma, SAD). Rižino vino osigurao je Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, Kina).

Cistanch deserticola prikupljen je iz Neimenggu wangyedicistancheCo. Ltd. Uzorke je identificirao prof. Yanjun Zhai (farmaceutska škola, Sveučilište Liaoning TCM). Uzorci su predani Sveučilištu tradicionalne kineske medicine Liaoning.

Životinje

Muške štakore Sprague–Dawley (SPF stupanj) s 180-220 g ukupne tjelesne težine osigurao je Liaoning Changsheng biotechnology Co. Ltd. (Centar za laboratorijske životinjske resurse provincije Liaoning, broj licence: SCXK-2015-0001). Ovi su štakori bili smješteni u prostoriji za uzgoj s dobro održavanom temperaturom i vlagom, tj. 20-26 stupnjeva, 50-70 posto tijekom jednog tjedna. Prije pokusa štakori su hranjeni uobičajenom laboratorijskom hranom i vodom. Životinje su gladovale preko noći, međutim, voda im je davana ad libitum prije pokusa. Štakori su pogubljeni anestetikom od 10 posto kloralhidrata. Institucionalni odbor za etiku životinja pokrajinske bolnice kineske medicine Liaoning odobrio je sve eksperimentalne protokole (2019.3.25, 2019015).

Priprema CD, CD-NP i CD-HP ekstrakta

CD-NP, CD-HP obrađeni su iz iste serije Cistanch deserticola. Da bi se pripremio CD-NP, suhi komadići CD-a (5 mm debljine, 100 g) su navlaženi rižinim vinom (30 mL) i kuhani na pari na 100 stupnjeva 16 sati, nakon čega je uslijedilo sušenje na 55 stupnjeva u pećnici za sušenje. Dok je CD-HP pripremljen infiltracijom suhih komada CD-a (5 mm debljine, 100 g) s rižinim vinom (30 mL), nakon čega je uslijedilo kuhanje na pari na 1,25 atmosferskog tlaka tijekom 4 sata. a zatim suši u sušionici na 55 stupnjeva.

U mjernu tikvicu od 100 mL, jedan gram praha je prosijan kroz sito #4, nakon čega je dodano 50 posto metanola (50 mL), a zatim je čvrsto poklopljen i promiješan. Ova smjesa je izvagana, a zatim pola sata. maceracija. Nakon maceracije, smjesa je ultrazvukom (snaga 250 W, frekvencija 35 kHz) 40 min, zatim ohlađena i ponovno vagana. Gubitak težine nadopunjen je 50 postotnim metanolom, pravilno promiješanim i ostavljenim da odstoji, nakon čega je uslijedilo filtriranje supernatanta, a zatim je dobiveni filtrat korišten kao testna otopina.

MSE analiza aktivnih komponenti

Priprema standardnih supstanci: tubulozid-A (3.02 mg), ehinakozid (3.00 mg), 2'-acetilakteozid (2,34 mg), akteozid (2,45 mg), izoakteozid (0,61 mg), cistanozid-F (2,14 mg), salidrozid (3,39 mg), genipozid (2,84 mg), ajugol (1,58 mg), katalpol (2,39 mg), genipozidna kiselina (2,56 mg) i 8-epideoksiloganska kiselina (2,34 mg) dodani su u odmjernu tikvicu od 10 mL, dodan je metanol konstantnog volumena u mjerilu, konfiguriran u odgovarajuću koncentracijsku referentnu otopinu. Svaki od 100 μL konfiguriran je u miješanu referentnu otopinu.

Uvjeti MS analize: Vrijednost mase korigirana je prije eksperimenta, a korišten je način negativnih iona. Raspon mase bio je 50–1200 Da, a uzorak je ubrizgan kroz pumpu za ubrizgavanje protoka. Brzina konusa bila je 100 L/h, brzina protoka otapala je postavljena na 800 L/h. Kapilarni i konusni napon su fiksirani na 2500 i 40 V, u skladu s tim. Temperatura izvora iona i plina za otapanje bila je 100 stupnjeva odnosno 400 stupnjeva, a frekvencija prikupljanja signala bila je 0,5 S−1.

cistanche kemijskih profila i metabolita

UPLC-Q-TOF-MSE analiza CD ekstrakta

Kromatografske procjene su provedene u Waters ACQUITY I-CLASS UPLC sustavu (Waters Corporation, Milford, MA, USA). Uključujući kolonu ACQUITY UPLC® BEH C18 (50 × 2,1 mm, 1,7 μm, Waters). Mobilna faza sastojala se od vode koja je imala 0.1 posto mravlje kiseline (A) i acetonitrila koji je sadržavao 0.1 posto mravlje kiseline (B), uvjeti eluiranja bili su sljedeći: 97 posto do 85 posto A (0–5 min), 85 posto do 75 posto A (5–15 min), 75 posto do 65 posto A (15–16 min), 65 posto do 55 posto A (16–18 min) . Brzina protoka bila je 0.3 mL min-1, dok je temperatura prostorije za automatsko uzorkovanje i kolone bila 30 stupnjeva i 8 stupnjeva odvojeno. Volumen injekcije bio je 1,0 μL.

Procjena masene spektrometrije provedena je pomoću Waters XEVO G{{0}}XS QTOF MS (Waters Corporation, Milford, MA, SAD), uključujući ESI izvor. Brzina protoka plinovitog dušika bila je fiksirana na 800 L·h-1 s temperaturom od 400 stupnjeva, temperatura izvora je bila fiksirana na 100 stupnjeva, a konusni plin je postavljen na 50 L h-1. Napon konusa i kapilare podešen je na 40 i 2000 V, u skladu s tim. Energija sudara rampe korištena je u rasponu od 20-30 V. Centroidizirani podaci svih uzoraka dobiveni su od 50 do 1200 Da, s 5-vremenom skeniranja od 0,5 s tijekom vremena analize od 10 min . LockSpray TM korišten je za provjeru točnosti mase. [M–H]− ion leucin enkefalina (200 pg·μL−1 brzina protoka infuzije 10 μL min−1) pri m/z 554,2615 korišten je kao masa za zaključavanje. Softver MassLynx V4.1 (Waters Co., Milford, SAD) korišten je za točnu masu, sastav iona prekursora i izračun fragmenata iona.

Analiza podataka u Masslynx platformi

Nadalje, unutarnja knjižnica koja sadrži naziv spoja, njegovu strukturu i molekularnu formulu (u mol.) postavljena je na temelju literature. Svi spojevi su zabilježeni u posebnom predlošku, izrađenom u Excelu. Osim toga, mol datoteke (Chemdraw Ultra 8.0, Cambridge soft, SAD) i Excel datoteke svih pojedinačnih struktura spojeva također su spremljene na lokalno računalo. Uspostavljeni Excel-list s važnim podacima izravno je uvezen u znanstvenu knjižnicu u UNIFI-ju.

UNIFI 1.8.2, Waters, Manchester, UK korišten je za procjenu strukturnih karakteristika, posebno za karakteristične fragmente i MS fragmentaciju. Minimalna površina vrha od 500 postavljena je za detekciju 2D vrha. Tijekom otkrivanja 3D vršnih vrijednosti, odabran je niski energetski vršni intenzitet od više od 300 odbrojavanja i povišeni energetski vršni intenzitet od više od 80 odbrojavanja. Utvrđeno je da je pogreška mase do ± 10 ppm za poznate spojeve, a tolerancija vremena zadržavanja postavljena je u rasponu od ± 0,1 min. Odabrali smo negativne adukte koji sadrže –H plus HCOOH. Obrada neobrađenih podataka dobivenih od MS-a provedena je putem poboljšanog softvera UNIFI kako bi se brzo odredilokemijskikomponente koje su zadovoljile standarde s vlastitom bazom podataka i internom knjižnicom tradicionalne medicine.

Zatim, za provjerukemijskiStruktura svakog ciljnog spoja, izomeri su se razlikovali po svojim karakterističnim obrascima MS fragmentacije koji su otkriveni u prijavljenim studijama i usporedbom retencijskih vremena referentnih standarda.

Metabolomska analiza temeljena na multivarijantnoj statističkoj analizi

Prije obrade neobrađenih podataka postavljeni su parametri, kao što je masa u rasponu od 150 do 1200 Da, raspon vremena zadržavanja (0 do 20 min), intenzitet praga ( 2000 brojanja), tolerancija mase tj. 5 mDa, dok je prozor mase i vremena zadržavanja bio 0,20 min odnosno 0,05 Da. U sljedećem popisu baze podataka, identifikator iona bili su RT-m/z parovi s obzirom na njihova vremena eluiranja. Iste vrijednosti za RT i m/z u različitim serijama uzoraka smatrane su istim spojem.

Provedena je multivarijatna statistička analiza kako bi se ocijenili učinkoviti biomarkeri koji su znatno pridonijeli varijacijama među različitim skupinama. Tijekom analize korištena je analiza glavnih komponenti (PCA) kako bi se ukazalo na maksimalne razlike i prepoznavanje uzoraka za dobivanje pregleda i klasifikacije. OPLS-DA je alat za modeliranje koji pruža vizualizaciju učitavanja prediktivne komponente OPLS-DA za pomoć pri evaluaciji modela. Varijabla važnosti za projekciju (VIP) korištena je za procjenu evaluacije različitih komponenti, ametabolitiwith VIP values >1.0 i P-vrijednost< 0.05 were="" regarded="" as="" effective="" markers.="" furthermore,="" a="" permutation="" test="" was="" conducted="" for="" providing="" reference="" distributions="" for="" the="" r2/q2="" values="" that="" could="" show="" the="" statistical="">

cistanche kemijskih profila i metabolita

Pokusi na životinjama

Štakori su nasumično kategorizirani u četiri skupine (n = 6 za svaku skupinu), nakon čega je uslijedila oralna primjena različitih ekstrakata: (1) slijepa kontrolna skupina: štakorima je dana normalna fiziološka otopina (2 mL/100 g); (2) CD skupina: štakori su dobili CD ekstrakt (2 mL/100 g); (3) CD-NP skupina: štakori su dobili CD-NP ekstrakt (2 mL/100 g); (4) CD-HP skupina: štakori su dobili CD-HP ekstrakt (2 mL/100 g). Daljnja kategorizacija svih skupina provedena je u tri podskupine za plazmu, urin i feces, prema tome. Dva sata kasnije, svakom štakoru je oralno primijenjena ista i jednaka količina ekstrakata.

Nakon primjene, prikupljanje uzoraka krvi obavljeno je nakon 1.0 h, 2.0 h i 4.0 h u hepariniziranim polietilenskim epruvetama od 1,5 mL (iz orbitalnih vena) , nakon čega slijedi centrifugiranje (pri 4500 okretaja u minuti) svih uzoraka tijekom 15 minuta.

Za uzorke urina i fecesa, štakori su držani u kavezima za metabolizam, a zatim je provedeno prikupljanje uzoraka urina i fecesa 24 sata nakon primjene. Centrifugiranje uzoraka urina obavljeno je na 4500 okretaja u minuti tijekom 15 minuta, dok su uzorci izmeta sušeni u hladu, mljeveni u prah, zatim je uzeto 0,2 g i dodano u 0,5 mL fiziološke otopine. otopine, ultrazvuk 5 minuta i centrifugiranje na 12,000 okretaja u minuti 15 minuta. Svi bio-uzorci su držani na -80 stupnjeva do analize.

Priprema bioloških uzoraka

Dodavanje uzoraka plazme, urina i fecesa provedeno je s 3 volumena metanola, nakon čega je uslijedilo vrtloženje tijekom 3 minute. Zatim je provedeno centrifugiranje (na 12,000 okretaja u minuti) smjesa tijekom 10 minuta, nakon čega je uslijedio prijenos supernatanta u EP epruvetu, a zatim osušena dušikom na 37 stupnjeva. Nadalje, provedeno je dodavanje 200 μL otopine HCN–H2O (50 posto). Zatim je vortex korišten za miješanje (1 min), nakon čega je uslijedilo centrifugiranje (pri 12,000 okretaja u minuti) tijekom 5 minuta. Supernatant (5 μL) tretiranih uzoraka ubrizgan je u sustav UPLC-Q-TOF-MSE.

Uvjeti tekućinske kromatografije i masene spektrometrije

Analiza zametabolititakođer je izveden instrumentom Waters UPLC preko ESI sučelja. Odvajanja su provedena pomoću stupca Acquity UPLC HSS T3 (100 mm × 2,1 mm, 1,8 µm), mobilna faza bila je 0.1 posto mravlja kiselina (A): Acetonitril (B), uvjeti gradijenta eluacije bili su 0–3 min (99,8 posto → 98 posto A), 3–5 min (98 posto → 95 posto A), 5–8 min (95 posto → 90 posto A), 8 –12 min (90 posto → 85 posto A), 12-17 min (85 posto → 70 posto A), 17-22 min (70 posto → 60 posto A), 22-23 min (60 posto → 58 posto A) , 23-25 ​​min (58 posto A), 25-32 min (58 posto → 45 posto A) i 32-37 min (45 posto → 35 posto A), 0,4 mL min-1 bila je brzina protoka. Temperatura za kolonu i prostoriju za uzorke postavljena je na 40 stupnjeva odnosno 8 stupnjeva. Korišteni su gore navedeni uvjeti masene spektrometrije.

Strategija sustavne analize metabolita u biouzorcima

Za obradu podataka korišten je softver UNIFI (1.8.2). Za identifikaciju učinkovitih metabolita korištena je funkcija Binary Compare. Ocijenjeni metaboliti nisu postojali u ekvivalentnom kontrolnom uzorku ili su postojali pri niskom intenzitetu iona. Prag relativnog intenziteta postavljen je na 3 ili 5, imetabolitikoji su ispunili podcrtane kriterije mogli su se ocijeniti. Uobičajeno i predvidljivometabolitizatim je odredio EIC. Za traženje dvofaznih metabolita primijenjena je NLF funkcija. Na primjer, u softveru UNIFI, parametri se mogu postaviti na 176.0321 za traženje mogućih konjugata glukuronske kiseline. Nakon obrade, neutralni gubitak se može postaviti u metodi ili identificirati. MassFragment je korišten za određivanje ili karakterizaciju otkrivenogmetaboliti' strukture, UNIFI-jeva funkcija spektralne interpretacije glavna je funkcija koja se koristi za analizu sekundarne fragmentacije nadređenih komponenti. Ova se funkcija može koristiti za brzu provjeru je li putanja fragmentacije razumna.

cistanche kemijskih profila i metabolita

Rezultati

Pravilo fragmentacije mase feniletanoidnih glikozida i iridoida

Feniletanoidni glikozidi su glavnikemijskisastavni dijelovi CD-a. Uzete su standardne otopine izoakteozida, cistanozida F, tubulozida A, ehinakozida, akteozida i 2'-aktilakteozida, nakon čega je osigurana drugačija razina energija sudara (tablica 1), a zatim su dobivene odgovarajuće MS2 karte (sl. 1) .

Slika 1 Maseni spektrogram i put cijepanja feniletanoidnih glikozida. A izoakteozid; B cistanozidF; C tubulozidA; D ehinakteozid; E akteozid; F 2'-aktilakteozid

Tablica 1 Energija sudara za standardne tvari

Masena spektrometrijska analiza otkrila je da feniletanoidni glikozidi imaju slične uzorke fragmentacije masenog spektra, putevi cijepanja u načinu negativnih iona uglavnom uključuju: (1) cijepanje esterske veze: gubitak neutralne kafeoilne skupine (C9H3O6, 162,03) i neutralne acetilne skupine (C2H2O). , 42.00); (2) Glikozidno cijepanje: gubitak neutralnih ostataka ramnoze (C6H10O4, 146,05) i neutralnog ostatka glukoze (C6H10O5, 162,05). Iz masene spektrometrije visoke rezolucije mogu se razlikovati kafeoil (162,03) i glukozni ostatak (162,05).

Uzete su standardne otopine iridoida ajugola, katalpola, genipozidne kiseline, genipozida i 8-epideoksiloganske kiseline, nakon čega su dane različite energije sudara i dobivene su odgovarajuće MS2 karte (Slika 2).

Slika 2 Spektrogram mase i put cijepanja iridoidnih glikozida. A Ajugol, B katalpol, C genipozidna kiselina, D genipozid, E 8-epideoksiloganska kiselina

Iridoidni glikozidi imaju slične uzorke fragmentacije spektra mase, putovi cijepanja u načinu negativnih iona uglavnom uključuju (1) glikozidno cijepanje: gubitak neutralnog ostatka glukoze (C6H10O5, 162,05); (2) Gubitak neutralnog CO2 (43,99) i H2O (18,01).

Identifikacija spojeva u CD, CD-NP i CD-HP ekstraktima

UPLC-QTOF-MS E analiza

Provedena je optimizacija kromatografskih uvjeta. Zatim, spojevi odCistancheHerba je procijenjena iu modusu negativnih i pozitivnih iona s visokim i niskim CE. Dobiveni rezultati otkrili su da je kompatibilnost negativnog načina bila veća u odnosu na pozitivni način za ove spojeve. Slika 3 prikazuje kromatogram MS osnovnog vrha iona (BPI) praćen numeriranim vrhovima. Intenzitet svakog detektiranog iona u UPLC-Q-TOF-MSE analizi normaliziran je s obzirom na cijeli broj iona za generiranje matrice podataka koja se sastoji od m/z vrijednosti, normalizirane površine vrha i vremena zadržavanja.

Slika 3 Osnovni vršni intenzitet (BPI) uzoraka. 1.CD, 2. CD-NP, 3. CD-HP

Ocjenjivanje komponenti s CD-a i njegovih prerađevina na platformi UNIFI

Ukupno 97 spojeva identificirano je s -SEM (n = 6) načinom iz CD-a i njegovog prerađenog proizvoda (Tablica 2), uključujući feniletanoidne glikozide (PhG), iridoide, lignane i oligosaharide. Komponente 95, 91 i 94 otkrivene su u CD, CD-NP i CD-HP, prema tome. Među njima su 64 feniletanoida, 13 iridoida, a utvrđeno je još 20 drugih vrsta spojeva. Postojala je sličnost ukemijskisastav CD-a i njegovog prerađenog proizvoda, međutim, utvrđeno je da se količina komponenti razlikuje za CD i njegov prerađeni proizvod.

Tablica 2 Procjena spojeva dobivenih iz CD-a i njegovih prerađenih proizvoda pomoću UPLC-Q-TOF-MSE

Varijacije ukemijskikomponente prerađenih proizvoda

Softver Simca-P 13.0 korišten je za analizu multivarijantne matrice podataka. Prije PCA, sve su varijable bile srednje centrirane i pareto skalirane, nakon čega je slijedila identifikacija potencijalnih diskriminantnih varijabli. U dijagramu PCA rezultata, svaka točka je pokazala pojedinačni uzorak. Uzorci koji su pokazali sličnost u svojimkemijskikomponente su bile razbacane jedna uz drugu, dok su one koje su pokazivale varijacije u svojim komponentama bile podijeljene. Kao što se vidi u PCA (slika 4), skupina CD-HP je odvojena od skupina CD i CD-NP.

Slika 4 PCA CD-a i njegovih različitih prerađenih proizvoda

To distinguish CD from CD-HP and CD-NP, OPLS-DA, permutation test, S-plot, and VIP value were developed. (Figs. 5, 6, 7) The obtained results revealed that many components were key characteristic components of each product. The screening condition was the VIP >1 i P< 0.05. from="" the="" date="" of="" the="" s-plot,="" the="" characteristic="" components="" were="" evaluated,="" which="" were="" commonly="" existing="" in="" the="" three="">

Slika 5 OPLS-DA/test permutacije/S-grafikon/toplinska karta koja pokazuje intenzitete potencijalnih biomarkera između CD-NP i CD-HP spojeva 9, 10, 14, 32, 59, 60, 68, 70, 74, 75, 80, 81, 82 i 84 su diferencijalne komponente CD-NP, dok su spojevi 11, 15, 16, 45, 48, 66 i 72 diferencijalne komponente CD-HP.

Slika 6 OPLS-DA /permutacijski test/ S-grafikon/toplinske karte koje pokazuju intenzitete učinkovitih biomarkera između CD i CD-NP spojeva 13, 15, 16, 37, 49, 63, 66, 72, 74, 75 i 85 su diferencijalne komponente CD-a, dok su spojevi 10, 11, 32, 59, 60, 68, 70, 71, 80, 81 i 82 diferencijalne komponente CD-NP.

Slika 7 OPLS-DA/permutacijski test/S-grafikon/toplinske karte koje otkrivaju intenzitete učinkovitih biomarkera između CD i CD-HP spojeva 9, 14, 16, 59, 63, 66, 72, 74, 75, 80, 82 , 84, 85 i 94 su diferencijalne komponente CD-a, a 11, 15, 45, 49, 50, 60 i 71 su diferencijalne komponente CD-HP-a.

Na slici 8 pronašli smo intenzitet akteozida (54), cistanozida C (74), kampneozida II (43), osmantusida (75) i 2'-aktilakteozida (80) koji imaju 4'-O-kafeoilnu skupinu u 8-O- -D-glukopiranozilni dio (vidi sliku 9) smanjio se nakon obrade rižinim vinom, dok je intenzitet izoacetozida (60), izocistanozida (71), izokampneozida I (69) , izomartinozid (86) koji ima 6'-O-kafeoilnu skupinu (vidi sliku 9) povećan, posebno za CD-NP skupinu. Iako tubulozid B (72) ima 6'-O-kafeoilnu skupinu, isto kao i izoakteozid, intenzitet se smanjio zbog njegove 2'-aktilne skupine. Povećao se intenzitet ehinakozida (38) i cistanozida B koji imaju 6'-O- -D-glukopiranozilnu skupinu, ali se smanjio i intenzitet tubulozida A (55) zbog njegove 2'-aktilne skupine.

Slika 8. Intenzitet uglavnom PhG u CD-u i njegovim prerađenim proizvodima

Slika 9KemijskiStrukture uglavnom PhG-ova u CD-u i njegovim prerađenim proizvodima.

Naš istraživački tim također je proučavao toplinsku stabilnost akteozida i izoakteozida i otkrio da je akteozid nestabilan u vodi, metanolu i otopini vina od žute riže te da se može pretvoriti u izoakteozid djelomično pod uvjetima zagrijavanja. Ali termostabilnost izoakteozida bila je bolja, posebno u otopini žutog rižinog vina. Slika 10 prikazuje moguće promjene PhG-ova u CD-u tijekom obrade:

Slika 10 Moguća reakcija za PhG tijekom obrade

Identifikacija metabolita u štakora

Iz podataka masene spektrometrije visoke rezolucije, točna molekularna težina i elementarni sastav zametabolitia protomolekulski spojevi su analizirani i uspoređeni. Kako su iste vrste spojeva u TCM-u pokazale sličnost u metaboličkim modifikacijama, korelacije fitokemijskih sastojaka in vitro mogu se proširiti na njihove metabolite in vivo. U međuvremenu, na temelju konvencionalnih puteva biotransformacije, izveden je zaključak o razumnoj promjeni molekularne težine. Konačno,metabolitiidentificirani su analizom MSE spektra mase metabolita i putanje fragmentacije proto-spojeva u spektru mase [21, 22]. U usporedbi sa slijepim uzorkom, njegove komponente identificirane su in vivo na temelju informacija dobivenih kromatogramom spektra mase, mogućnosti metaboličke reakcije, karakteristika strukture spoja i pravila fragmentacije njegovog spektra mase. Pogledajte tablicu 3.

Tablica 3 IdentificiranoMetabolitiu plazmi, urinu i izmetu vodenog ekstrakta u CD-u i njegovim prerađenim proizvodima

Identifikacija metabolita povezanih s feniletanol glikozidima

Za obradu je korištena UNIFI platforma. Slika 11 prikazuje TIC kromatografiju urina, fecesa i plazme za CD i njegove prerađene proizvode. U usporedbi sa slijepim uzorcima, kod štakora su identificirana ukupno 54 metabolita, uključujući 10 prototipnih komponenti i 44metaboliti, u kojima je 24, 49 i 6 bilo u izmetu, urinu i plazmi, prema tome.

Slika 11 Kromatografija TIC-a. A Uzorak urina u skupini BC; B Uzorak urina u skupini CD; C Uzorak urina u skupini CD-NP; D Uzorak urina u skupini CD-HP; E Uzorak fecesa u skupini BC; F Uzorak fecesa u skupini CD; G Uzorak fecesa u skupini CD-NP; H Uzorak fecesa u skupini CD-HP; I uzorak plazme u skupini BC; J Uzorak plazme u skupini CD; K Uzorak plazme u skupini CD-NP; M Uzorak plazme u CD-HP skupini

Na temelju točne mase, kaskade fragmentacije i predvidljivih neutralnih gubitaka biotransformacijom, ukupno 35 feniletanoidnih glikozida povezanihmetabolitiprovizorno su ocijenjeni. Povezani metaboliti feniletanoidnih glikozida imaju slične uzorke fragmentacije spektra mase, poput tipičnog dekafeoilnog fragmenta m/z 461.1605, zatim se dalje hidroliziraju glikozidnim i esterskim vezama in vivo i metaboliziraju u hidroksitirozol (HT) (m/ z 153,0504, C8H10O3, 4,73 min) i kavenu kiselinu (CA) (m/z 179,0389, C9H7O4, 0,77 min), vidi sliku 12A.

M11 je označen [M–H]− na m/z 153,0504 s formulom tj. C8H10O3 i identificiran kao HT. M16 je prikazao [M–H]− na m/z 329,0851, što je bilo 176 Da povišeno od onoga za HT, otkrivajući da bi mogao biti glukuronidirani metabolit HT. [M–H]- za M26 bio je na m/z 343,1037, 14 Da više nego za HT-glukuronid. Stoga je M26 identificiran kao HT-metilirani glukuronid. M17 je identificiran kao HT-sulfat na temelju [M–H]− na m/z 233,0112, 80 Da iznad HT, koji se može dalje metilirati, a zatim je proizveo M22, koji je pokazao m/z 247,0278, što ukazuje da je HT-metilirani sulfatiranimetabolit. M7 (m/z 167,0335) i M5 (m/z 167,0762) smatrani su produktima oksidacije, odnosno metiliranim HT (Slika 12B).

M1 je pokazao [M–H]− na m/z 179,0389, razjašnjena molekularna formula bila je C9H7O4 i identificirana kao kafeinska kiselina (CA). M25 je otkrio [M–H]− na m/z 355,0704, koji su bili 176 Da povišeni od CA, pokazuje da bi mogao biti glukuronidiranimetabolitod CA. M27 je imao m/z 258,994, što je bilo 80 Da više od one za CA, pa smo ga razjasnili kao CA sulfat, i mogao je proizvesti M35 (m/z 273,0064). Kako M4 daje [M–H]− na m/z 193,0524, 14 Da više od CA, identificiran je kao CA metilirani metabolit. M39 je bila CA dehidroksilacijametabolit, s m/z 163,04, i mogao bi se sulfatirati u M32 (m/z 242,9951).

M33 (m/z 181.0491, C9H10O4, 9,06 min) bio je produkt redukcije CA, to jest 3,4-dihidroksibenzenpropionske kiseline, koja se može metilirati u M19 (m/z 195,0623, C10H1204, 0,93 min). M33 se može dehidroksidirati u M43, to jest 3-HPP (m/z 165,0558, C9H10O3, 11,29 min), i M31 (m/z 341,0942, C15H17O9, 8,90 min) i M29 (m/z 245,0125, C9H10O6S, 8,52 min) bili su glukuronidirani i sulfatirani produkti (slika 12C).

Za feniletanoidne glikozide povezanemetaboliti, ključne metaboličke kaskade bile su metaboličke reakcije faze II, tj. glukuronidacija, metilacija i sulfatacija. Predložene metaboličke kaskade feniletanoida prikazane su na slici 13.

Slika 12 Maseni spektar nekihmetabolitiu CD-ima

Slika 13 Mogući metabolički put feniletanoida

Identifikacija metabolita povezanih s iridoidima

Analizom elementarnog sastavametaboliti, MSE fragmentacije i povezane literature, provizorno je procijenjeno ukupno 19 metabolita povezanih s iridoidom. Iridoidni glikozidi su hidrolizirani glikozidnim vezama da bi se formirali odgovarajući aglikoni. M/z 185,117 bio je za M8, 162 Da manji od ajugola, koji je dobiven gubitkom ostatka glukoze.

M40 (m/z 199,0641, Rt 10,91 min) bio je deglikozilirani produkt katalpola. M45 m/z 169,0487, Rt 12,15 min) bio je manji od 30 Da od deglikoziliranog katalpolametabolit, a identificiran je kao uklanjanje molekule CH2O metabolita. M34 (m/z 151,0352, Rt 9,08 min), bio je daljnji gubitak H2Ometabolit.

M44 (m/z 211,0665, Rt 11,31 min) bio je deglikozilirani metabolit genipozida, a M37 (m/z 197,0833, Rt 15,03 min) bio je deglikozilacija 8-epideoksiloganske kiseline. Metaboličke reakcije za iridoide mogu se otkriti kao faza I metabolizma deglikozilacije (Slika 12D).

Usporedba metaboličkog profila u plazmi, urinu i fecesu između CD-a i njegovih prerađenih proizvoda

Uspoređena su 2 prototipa u plazmi, 7 u urinu i 3 u fecesu. Bilo je 7 prototipova apsorbiranih u CD, 7 prototipova apsorbiranih u CD-NP i 8 prototipova u CD-HP. M21 je detektiran samo u grupi CD-NP u fecesu, a M38 i M51 su detektirani samo u grupama urina CD-HP. U usporedbi s metabolitima, identičnimetabolitiu plazmi, urinu i fecesu bili su 4, 42, odnosno 21. Bilo je 34 metabolita apsorbiranih u CD skupini, 39 u CD-NP i 40 u CD-HP skupini. M5, M7, M40 i M52 otkriveni su samo u CD-NP skupinama, dok su M24, M41 i M48 samo otkriveni u CD-HP skupinama.

Uočene su varijacije u apsorpciji, kao iu metabolizmu aktivnih spojeva u različitim prerađenim produktima CD-a. Iz slike 14, otkrili smo da je intenzitet konjugacije HT-sulfata (M17) bio najveći u urinu, a zatim 3-HPP konjugacije sulfata (M29), metilirane HT konjugacije sulfata (M22), dehidroksiliranog CA sulfata konjugacija (M32) i 3,4-dihidroksi benzenpropionska kiselina sulfatna konjugacija (M19). Sadržaj metaboličkih produkata u prerađenoj skupini bio je veći nego u CD skupini, posebice za M22, M29, M27, M16, M19, M1, M2. Njihovi prekursorski spojevi, poput hidroksitirozola, imaju antitumorska, protuupalna, antibakterijska, antivirusna i antifungalna svojstva [23]. Kafeinska kiselina ima protuupalno, antikancerogeno i antivirusno djelovanje [24]. Bio je u skladu s kliničkom uporabom CD-a i njegovih prerađenih proizvoda.

Rasprava

CD je TCM, a njegove glavne bioaktivne komponente, uključujući PhG, iridoide, polisaharide, dokumentirane su raznim istraživačkim studijama. U kliničkoj praksi TCM-a, prerađeni proizvodi CD-a naširoko su korišteni u odnosu na sirove. Thekemijskisastav će se mijenjati tijekom obrade, što može dovesti do promjena u ljekovitim učincima (slika 14).

Slika 14 Intenzitet glavnogmetabolitiu mokraći

PhG su vrsta fenolnih spojeva karakteriziranih -glukopiranozidnom strukturom koja nosi hidroksifeniletilni dio kao aglikon. Ovi spojevi često sadrže kavenu kiselinu i ramnozu vezane na glukozni ostatak putem esterskih ili glikozidnih veza. U trenutnoj studiji provedene su kvalitativne analize CD-a, CD-NP-a i CD-HP-a te je identificirano ukupno 97 spojeva, uključujući feniletanoidne glikozide (PhG), iridoide itd. Dobiveni rezultati pokazali su varijacije ukemijskisastav prije i poslije obrade. Intenzitet PhG-ova koji imaju 4'-O-kafeoilnu skupinu u 8-O- -D-glukopiranozilnom dijelu, poput akteozida, cistanozida C, kampneozida II, osmantusida smanjio se nakon obrade, dok su PhG-ovi s 6 Povećana je '-O-kafeoilna skupina u 8-O- -D-glukopiranozilnom dijelu, kao što su izoacetozid, izocistanozid, izokampneozid I, izomartinozid, posebno u skupini CD-NP. Povećao se i intenzitet ehinakozida i cistanozida B čija struktura posjeduje 6'-O- -D-glukopiranozilni dio. PhG-ovi koji imaju 2'-aktilnu skupinu često se smanjuju zbog reakcije hidroze tijekom procesa, poput tubulozida B, 2-acetilakteozida.

Istraga ometabolitiApsorpcija in vivo provedena je nakon oralne primjene CD-a i njegovih prerađenih proizvoda. Metabolički procesi faze II bili su ključne kaskade, a većina metabolita bili su sulfatni, glukuronidni i metilirani konjugati. Feniletanol glikozidi imaju nisku oralnu apsorpciju i iskorištenost. Teško se apsorbiraju u krv i djeluju kao preci koji igraju svoju ulogu nakon metaboličke aktivacije in vivo. Feniletanoidi proizvedeni u feniletanolaglikon, kao što su hidroksitirozin (HT) i kafeinska kiselina (CA) i njen derivat 3-hidroksifenilpropionska kiselina (3-HPP), ti se metaboliti mogu lakše apsorbirati u plazmu i imati bolji ljekoviti učinak posljedica.

Većinametabolitipronađeni su u nižim koncentracijama ili nisu otkriveni u plazmi štakora, međutim, viša koncentracija primijećena je u urinu, što ukazuje da bi se metaboliti lako eliminirali putem urina. Kao što je prikazano u tablici 3, isti spojevi su određeni u različitim skupinama, dok su značajne varijacije pronađene u koncentracijamametabolitišto bi moglo biti povezano s nejednakom učinkovitošću CD-a i njegovih prerađenih proizvoda. HT-sulfatna konjugacija (M17) ima najveći intenzitet u urinu, zatim 3-HPP sulfatna konjugacija (M29), metilirana HT sulfatna konjugacija (M22), dehidroksilirana CA sulfatna konjugacija (M32) i 3,{{ 7}}dihidroksi benzenpropionska kiselina sulfatna konjugacija (M19). Sadržaj metaboličkih produkata u prerađenoj skupini bio je veći nego u CD skupini, posebice za M22, M29, M27, M16, M19, M1, M2.

Općenito, komponente koje imaju visoku izloženost u ciljnim organima mogle bi biti učinkovite. Dovoljna količina feniletanoida i njihovih derivata procijenjena je i određena in vitro. Akteozid je karakterističan spoj, čiji se sadržaj smanjio nakon obrade rižinim vinom, a sadržaj izoakteozida, izocistanozida C, izokampneozida I se povećao u skladu s tim. Produkti razgradnje PhG-a, poput derivata CA i HT-a, mogu se procijeniti u bio-uzorcima, a obrada rižinog vina može poboljšati apsorpcijumetabolitiin vivo.

Zaključak

U ovoj studiji otkriveno je 97 spojeva u ekstraktima CD-a i njegovim prerađenim proizvodima. Razgradnja nekoliko glikozida odvijala se pod povišenom temperaturom i kao rezultat su sintetizirani neki novi izomeri i kompleksi. U studiji in vivo, komponente prototipa (10) imetaboliti(44) određeni su ili provizorno procijenjeni u plazmi štakora, izmetu i urinu. Metabolički procesi faze II bili su ključne kaskade, većinametabolitibili su povezani s ehinakozidom ili akteozidom, poput HT, CA i njihovih derivata 3-hidroksifenilpropionske kiseline 3-HPP. Ti se metaboliti mogu lakše apsorbirati u plazmu i imati bolji ljekoviti učinak. Dobiveni rezultati su pokazali da jekemijskisastav CD-a bio je različit i utjecao je na dispoziciju spoja in vitro i in vivo.

Dostupnost podataka i materijala

Skupovi podataka korišteni i/ili analizirani tijekom trenutne studije dostupni su od odgovarajućeg autora na razuman zahtjev.

Kratice

PhGs: Feniletanoidni glikozidi

CD:Cistanche deserticola

CMM: kineska Materia Medica

TCM: Tradicionalna kineska medicina

CD-NP:Cistanche deserticolaObrađeno kuhanjem na pari s rižinim vinom pod normalnim tlakom

CD-HP:Cistanche deserticolaObrađeno kuhanjem na pari s rižinim vinom pod visokim pritiskom

UPLC-Q-TOF-MSE: Tekućinska kromatografija ultravisoke učinkovitosti u kombinaciji s TOF-MSE

PCA: Analiza glavnih komponenti

VIP: Promjenjiva važnost za projekciju

CA: kafeinska kiselina

HA: Hidroksitirozol

Studija za cistanche kemijskih profila i metabolita

Reference

1. Povjerenstvo za kinesku farmakopeju. Farmakopeja Narodne Republike Kine, sv. I. Peking: China Medical Science Press; 2020. str. 140.

2. Li Z, Lin H, Gu L, Gao J, Tzeng CM. HerbaCistanche(Rou Cong-Rong): jedan od najboljih farmaceutskih darova tradicionalne kineske medicine. Front Pharmacol. 2016;7:41.

3. Liu BN, Shi J, Zhang C, Li Z, Hua Y, Liu PP, Jia TZ. Učinci različitih metoda sušenja za FreshCistanche deserticolana sadržaj njegovih komponenti. J Chin Med Mater. 2020;10:2414–8.

4. Liu BN, Shi J, Jia TZ, Lv TT, Li Z. Optimizacija procesa parenja pod visokim tlakom za Cistanches Herba. Chin Trad Patent Med. 2019;11:2576-80.

5. Fan YN, Huang YQ, Jia TZ, Wang J, La-Sika, Shi J. UčinciCistanchesherba prije i poslije obrade na djelovanje protiv starenja i imunološku funkciju kod starenja štakora izazvanog D-galaktozom. Chin Arch Trad Chin Med, 2017.; 11: 2882-2885.

6. Gao YJ, Jiang Y, Dai F, Han ZL, Liu HY, Bao Z, Zhang TM, Tu PF. Studija laksativnih sastojaka u Cistanche deserticola YC Ma. Modern Chin Med. 2015;17(4):307–10.

7. Liu BN, Shi J, Li Z, Zhang C, Liu P, Yao W, Jia T. Studija neuroendokrino-imunološke funkcijeCistanche deserticolai Njegovi proizvodi od rižinog vina na pari u modelu štakora induciranog glukokortikoidima. Evid Based Complement Alternat Med. 2020;22:5321976.

8. Guo Y, Wang L, Li Q, Zhao C, He P, Ma X. Poboljšanje funkcije oživljavanja bubrega u mišjem modelu pomoću biljke Cistanches herba brzo osušene na srednje visokoj temperaturi. J Med Food. 2019;22(12):1246–53.

9. Wang T, Zhang X, Xie W.Cistanche deserticolaYC Ma, "Pustinjski ginseng": recenzija. Am J Chin Med. 2012;40(6):1123–41.

10. Fu Z, Fan X, Wang X, Gao X. Cistanches Herba: Pregled njegovih kemijskih, farmakoloških i farmakokinetičkih svojstava. J Ethnopharmacol. 2018;219:233–47.

11. Lei H, Wang X, Zhang Y, Cheng T, Mi R, Xu X, Zu X, Zhang W. HerbaCistanche(Rou Cong Rong): pregled njegove fitokemije i farmakologije. Chem Pharm Bull. 2020;68(8):694–712.

12. Geng X, Tian X, Tu P, Pu X. Neuroprotektivni učinci ehinakozida u mišjem MPTP modelu Parkinsonove bolesti. Eur J Pharmacol. 2007;564:66-74.

13. Deng M, Zhao JY, Ju XD, Tu PF, Jiang Y, Li ZB. Zaštitni učinak tubulozida B na apoptozu izazvanu TNF alfa u neuronskim stanicama. Acta Pharmacol Sin. 2004;25(10):1276–84.

14. Nan ZD, Zhao MB, Zeng KW, Tian SH, Wang WN, Jiang Y, Tu PF. Protuupalni iridoidi iz stabljikaCistanche deserticolauzgojen u pustinji Tarim. Chin J Nat Med. 2016;14(1):61–5.

15. Nan ZD, Zeng KW, Shi SP, Zhao MB, Jiang Y, Tu PF. Feniletanoidni glikozidi s protuupalnim djelovanjem iz stabljika Cistanche deserticola uzgojenih u pustinji Tarim. Fitoterapija. 2013;89:167–74.

16. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Yuan D, Yoshikawa M, Hayakawa T, Muraoka O. Iridoidni i aciklički monoterpenski glikozidi, kankanozidi L, M, N, O i P izCistanchetubuloza. Chem Pharm Bull. 2010;58(10):1403–7.

17. Li SL, Song JZ, Qiao CF, et al. Nova strategija za brzo istraživanje potencijalakemijskimarkeri za razlikovanje sirovog i prerađenog Radix Rehmanniae pomoću UHPLC-TOF-MS s multivarijatnom statističkom analizom. J Pharm Biomed Anal. 2010;51(4):812–23.

18. Peng F, Chen J, Wang X, Xu CQ, Liu TN, Xu R. Promjene u razinama feniletanoidnih glikozida, antioksidativnoj aktivnosti i drugim kvalitetnim svojstvima uCistanche deserticolakriške obradom parom. Chem Pharm Bull. 2016;64:1024-30.

19. Ma ZG, Tan YX. Promjene sadržaja šest feniletanoidnih glikozida tijekom kuhanja na pari s vinom u Desertliving Cistanche. Chin Trad Patent Med. 2011;33(11):1951–4.

20. Peng F, Xu R, Wang X, Xu C, Liu T, Chen J. Učinak procesa parenja na kvalitetu nakon žetvecistanche deserticolaza medicinsku upotrebu tijekom sušenja na suncu. Biol Pharm Bull. 2016;39(12):2066–70.

21. Cui Q, Pan Y, Zhang W, Zhang Y, Ren S, Wang D, Wang Z, Liu X, Xiao W.Metabolitiprehrambenih akteozida: profili, izolacija, identifikacija i hepatoprotektivni kapaciteti. J Agric Food Chem. 2018;66(11):2660–8.

22. Cui Q, Pan Y, Bai X, Zhang W, Chen L, Liu X. Sustavna karakterizacijametabolitiod ehinakozida i akteozida izCistanchetubulosa u plazmi, žuči, urinu i izmetu štakora na temelju UPLC-ESI-Q-TOF-MS. Biomed Chromatogr. 2016;30(9):1406–15.

23. Bertelli M, Kiani AK, Paolacci S, Manara E, Kurti D, Dhuli K, Bushati V, Miertus J, Pangallo D, Baglivo M, Beccari T, Michelini S. Hydroxytyrosol: prirodni spoj s obećavajućim farmakološkim aktivnostima. J Biotechnol. 2020;309:29-33.

24. Touaibia M, Jean-François J, Doiron J. Caffeic Acid, svestrani farmakofor: pregled. Mini Rev Med Chem. 2011;11(8):695–713.