Cistanche glikozid regulira Bmi1 i potiče proliferaciju mišjih spermatogonijskih matičnih stanica kroz Akt signalni put

Cilj: Istražiti pospješujući učinak i povezane mehanizme Cistanche glikozida na proliferaciju mišjih spermatogonijalnih matičnih stanica. Metoda: MTT test i EdU stanični test proliferacije korišteni su za otkrivanje učinka glikozida Cistanche na sposobnost proliferacije mišjih spermatogonijalnih matičnih stanica; Western blot metoda korištena je za otkrivanje ekspresije Bmi1, p-Akt i Akt proteina glikozidom cistanhe; Eksperiment RT-PCR otkrio je rezultate ekspresije srodnih gena i konačno pokazao uzvodno i nizvodno regulatorni odnos između p-Akt i Bmi1 proteina putem inhibitora i siRNA. Rezultat: U usporedbi s kontrolnom skupinom, 0.5-1 µ M glikozid Cistanche pospješio je proliferaciju mišjih spermatogonijalnih matičnih stanica (P<0.05); Compared with the control group, the expression levels of p-Akt and Bmi1 proteins in the 0.5-1 µ M Cistanche glycoside treated group increased (P<0.05); Akt inhibitors downregulated the levels of p-Akt and Bmi proteins (P<0.05); SiBmi1 had no significant effect on Akt mRNA levels (P>0.05). Zaključak: Cistanche glikozid aktivira Akt signalni put i pojačava ekspresiju Bmi1, potičući proliferaciju mišjih spermatogonijalnih matičnih stanica.

Ključne riječi: Cistanche glikozid; Matične stanice spermatogonija miša; Bmi1; proliferacija stanica

Neplodnost je postala globalni problem koji koči razvoj ljudskog društva [1-2]. Prema epidemiološkim statistikama, oko 15 posto -20 posto parova diljem svijeta pati od bolesti neplodnosti, pri čemu muška disfunkcija uzrokuje više od 50 posto simptoma neplodnosti [3]. Stoga je pronalaženje učinkovitih metoda liječenja muške neplodnosti postalo vruća tema istraživanja u području reproduktivnog zdravlja u zemlji i inozemstvu.

Cistanche dobrobiti za muškarce - Tonificiranje bubrega

Kliknite ovdje za pregled proizvoda Cistanche za bubrežne bolesti

【Tražite više】 E-pošta:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Inhibicijski kompleks polikomb proteina 1 (PRC1) sastavljen od B-stanice specifičnog mjesta integracije Moroni mišje leukemije virusa 1 (Bmi1) može spriječiti prerano starenje i održati sposobnost samoobnavljanja matičnih stanica [4]. Protein kinaza B (Akt) uključena je u proliferaciju i diferencijaciju stanica [5], a aktivirani Akt uključen je u razne važne biološke aktivnosti [6-7].

Cistanche glikozid I (C27H30O11, molekulska težina: 530,52) je hidrolizat Cistanche glikozida izoliran iz tradicionalne kineske medicine Cistanche glikozid, koji ima različite farmakološke i biološke aktivnosti [8-9]. Prema izvješćima, glikozid Cistanche može imati određeni terapeutski učinak na osteoporozu [10]. Međutim, utjecaj Cistanche glikozida I na mušku reproduktivnu funkciju još nije jasan. Spermatogene matične stanice (SSC) najprimitivnija su skupina spermija sa sposobnošću samoobnavljanja i diferencijacije, a igraju nezamjenjivu ulogu u održavanju muške reproduktivne funkcije. Stoga je ova studija koristila mišje SSC kao in vitro model za istraživanje učinka Cistanche glikozida na sposobnost proliferacije mišjih SSC i njihov mehanizam djelovanja.

Pustinjski ginseng - Tonizirajući bubreg

1 Materijal i metode

1.1 Kultura stanica

U ovoj studiji korištene su mišje spermatogonijske matične stanice (C18-4). Stanice su došle iz istraživačke grupe profesora He Zupinga i odvojene su, pročišćene i identificirane prema specifikacijama. Mišjim spermatogonijalnim matičnim stanicama dodano je 10 posto fetalnog goveđeg seruma (Gibco) i 1 posto penicilina/streptomicina u DMEM/F12 (Gibco) i uzgojene u mediju (37 stupnjeva, 5 posto CO2)

1.2 MTT eksperiment

Inokulirajte C18-4 s količinom od 5000 stanica po jažici u 96-pločicu za jažice kako biste osigurali jednoliku inokulaciju stanica. Nakon adhezije stanica odaberite potrebne lijekove i koncentracije lijekova za liječenje. Nakon 72 sata ovisnosti o lijeku, 50 µL pripremljenog tiazol plavog (MTT) dodano je u jažicu gdje su stanice inokulirane, a ploče s 96 jažica stavljene su u stanični inkubator na 4-5 sati. Nakon inkubacije, odbacite otopinu kulture iz ploča s 96 jažica, dodajte 150 µL dimetil sulfoksida (DMSO) u svaku jažicu i na kraju izmjerite apsorbanciju koristeći enzimski imunosorbentni test (Biotek) na valnoj duljini od 490 nm.

Cistanche prah - Tonificiranje bubrega

1.3 Proliferacija EdU stanica

Ravnomjerno inokulirajte stanice na {{0}}pločicu s jažicama (6,0 × 103/jažici), nakon što stanice prianjaju na stijenku, dodajte lijekove 24 sata u skladu s eksperimentalnim potrebama, a zatim upotrijebite 100 μ LDMEM/ F12 sadrži 20 µL EdU kao zamjenu za izvorni medij kulture, a zatim se ispituje potencijal proliferacije stanica prema uputama EdU test kita.

1.4 Western blot

Prethodno pohranjeni stanični proteinski uzorak razdvojen je SDS PAGE gelom i zatim prebačen na PVDF membranu nakon elektroforeze. Začepljena je s 5 posto obranim mlijekom 1 sat. Kombinirano je sa specifičnim primarnim antitijelima na 4 stupnja preko noći: zečje anti-mišje p-Akt antitijelo (1 ∶ 2000) (CST), Akt antitijelo (1 ∶ 1000) (CST), GAPDH (1 ∶ 5000) (Abcam), Bmi1 (1 ∶ 5000) (Abcam). Drugog dana, vežite se sa sekundarnim antitijelom kunića na sobnoj temperaturi 1 sat. Odgovarajući proteini detektirani su pomoću kompleta Chemiluminescence Liquid (ECL) (Bio-Rad), a na kraju je promatrana reakcija antigen-antitijelo pomoću ChemiDoc sustava (Bio-Rad).

1.5 RT-PCR

Reagens koji se koristi u procesu ekstrakcije ukupne RNA je TRIzol reagens (Invitrogen), a cDNA se dobiva prema uputama kompleta za reverznu transkripciju prvog lanca cDNA (Vazyme). RT PCR je proveden pomoću TaqMan gen ekspresije Master Mix (Bio-Rad) prema uputama, koristeći ΔΔ Ct metoda izračunava promjenu u relativnim umnošcima ekspresije mRNA, s vrijednošću 2 − ΔΔ Ct. Tablica redoslijeda primera u (Tablica 1)

1.6 transfekcija siRNA

SiRNA Bmi 1 mRNA kupljena je od Ribobio, a popis sekvenci je u tablici 2. Korišten je transfekcijski reagens Lipofectamine 6000 (Invitrogen). Stanice (2,0 × 105/jažici) su uzgajane preko noći u DMEM/F 12 s dodatkom 10 posto fetalnog goveđeg seruma na 6-ploči s jažicama. Prema smjernicama proizvođača, Lipofectamine 6000 temeljito je pomiješan s kontrolnom siRNA, odnosno Bmi1 siRNA, i transfektiran 5 sati u mediju kulture bez fetalnog goveđeg seruma. Nakon ispiranja s PBS-om, originalni medij kulture zamijenjen je s 10 posto fetalnog goveđeg seruma DMEM/F12. Nakon 24 sata, stanice su sakupljene kako bi se otkrile promjene ekspresije različitih odgovarajućih proteina i gena.

Tablica 1 RT PCR amplificirane sekvence primera

Tablica 2 siRNA Bmi1 sekvenca

1.7 Statistička analiza

Svi podaci analizirani su pomoću softvera SPSS 16.0 i GraphPad Prism 8. Na temelju razlika u srednjim vrijednostima između dvije ili više skupina, za usporedbu su odabrani Studentov t-test i jednosmjerni ANOVA test. Razlika od P<0.05 was considered statistically significant.

2 rezultata

2.1 Učinci glikozida Cistanche na matične stanice spermatogonija

Kako bismo utvrdili ima li Epimedium glikozid I proliferativni učinak na mišje spermatogonijske matične stanice, otkrili smo kroz MTT pokuse da Cistanche glikozid I može potaknuti proliferaciju mišjih spermatogonijalnih matičnih stanica pri koncentracijama {{0}}.5 i 1 µM (Slika 1A). Zatim, kako bismo dodatno potvrdili proliferativni učinak Cistanche glikozida I na mišje spermatogonijske matične stanice, dodatno smo potvrdili putem EdU pokusa proliferacije stanica da Cistanche glikozid I također može potaknuti proliferaciju mišjih spermatogonijskih matičnih stanica u koncentracijama od 0,5 i 1 µM (Slika 1B).

Pustinjska živa cistanča - Tonificirajući bubreg

2.2 Cistanche glikozid pojačava ekspresiju Bmi1

Prethodne laboratorijske studije pokazale su da je Bmi1 visoko izražen u tkivu testisa u usporedbi s drugim tkivima organa, a uglavnom je izražen u jezgri mišjih spermatogonijalnih matičnih stanica. Nedavne studije pokazale su da je Bmi1 od velike važnosti u održavanju proliferacije spermatogonijalnih matičnih stanica [12]. Stoga nagađamo da Cistanche glikozid I ima regulatorni učinak na Bmi1, čime potiče proliferaciju mišjih spermatogonijskih matičnih stanica. Rezultati Western blota pokazali su da je glikozid Cistanche I značajno povećao ekspresiju proteina Bmi1 (Slika 2).

2.3 Cistanche glikozid aktivira Akt signalni put

Prema izvješćima, fosforilirani Akt usko je povezan s proliferacijom i diferencijacijom stanica [13]. Stoga smo istražili učinak icariina I na Akt fosforilaciju. Otkrili smo da su glikozidi Cistanche značajno povećali ekspresiju fosforilacije Akt pri koncentracijama od 0.5 i 1 µM (Slika 3).

2.4 Inhibicija Akt smanjenje Bmi1

Prema prethodnim izvješćima o istraživanju [14], odabrali smo inhibitor Akt (MK-2206) u koncentraciji od 10 (µM) i otkrili da inhibiranje p-Akt značajno inhibira Bmi1. Ovaj rezultat ukazuje da ekspresiju Bmi1 regulira Akt (Slika 4)

Slika 1: Učinak Cistanche glikozida I na mišje spermatogonijalne matične stanice

A. MTT test korišten je za otkrivanje učinka tretmana Cistanche glikozidom I tijekom 3 dana na održivost mišjih spermatogonijalnih matičnih stanica; B. Eksperiment proliferacije EdU stanica korišten je za otkrivanje proliferacije mišjih spermatogonijalnih matičnih stanica nakon 3 dana tretmana s glikozidima Cistanche, kao i tablica statističke analize; *P<0.05, * * P<0.01 compared to the control group, n=3.

Slika 2: Učinak Cistanche glikozida I na Bmi1 protein

Western blot test korišten je za otkrivanje učinka tretmana glikozidom I Cistanche deserticola na ekspresiju Bmi1 u mišjim spermatogonijalnim matičnim stanicama nakon 24 sata, a predstavljena je i statistička karta* P<0.05, compared to the control group, n=3.

Slika 3: Učinak Cistanche glikozida I na Akt signalni put

Western blot test korišten je za otkrivanje ekspresije Akt i Akt fosforilacije u mišjim spermatogonijalnim matičnim stanicama nakon 24 sata tretmana s Cistanche Cistanche glikozidom I, a predstavljena je i statistička karta** P<0.01, compared to the control group, n=3.

Slika 4: Učinak Akt inhibitora na Bmi1. Western blot eksperiment korišten je za otkrivanje ekspresije fosforiliranog Akt i Bmi1 u mišjim spermatogonijalnim matičnim stanicama nakon 24 sata tretmana Akt inhibitorom, a predstavljen je statistički dijagram* P<0.05 * * P<0.01, compared to the control group, n=3.

2.5 Tišina Bmi1 ne utječe na ekspresiju Akt

Kako bismo dodatno potvrdili uzvodno-nizvodni odnos između Bmi1 i Akt, utišali smo Bmi1 i promatrali promjene u staničnoj ekspresiji Akt. Prvo, siRNA različitih sekvenci Bmi1 transficirane su u mišje stanice kako bi se istražila njihova učinkovitost transfekcije. Rezultati RT PCR eksperimenta pokazali su da siBmi1-1, siBmi1-2 i siBmi1-3 značajno smanjuju ekspresiju Bmi1, sa siBmi1-2 i siBmi1-3 bolje učinke (Slika 5A). Western blot dodatno je potvrdio da i siBmi1-2 i siBmi1-3 mogu značajno smanjiti razine Bmi1 proteina (Slika 5B), pa smo odabrali siBmi1-2 i siBmi1-3 za naknadna istraživanja. Zanimljivo, RT-PCR je pokazao da utišavanje Bmi1 nije utjecalo na ekspresiju Akt (Slika 5C). Gore navedeni rezultati pokazuju da se Akt nalazi uzvodno od Bmi1.

Slika 5: Utjecaj utišavanja Bmi1 na Akt

A. RT-PCR analiza učinaka tri utišane sekvence na ekspresiju Bmi1 gena; B. Western blot eksperiment korišten je za otkrivanje učinka tri različite sekvence siRNA na utišavanje proteina Bmi1 u usporedbi sa siCtrl-om, te je izvršena statistička analiza; C. RT-PCR analiza učinka utišavanja Bmi1 na Akt gen** P<0.01, * * * P<0.001 compared to the control group, n=3.

3 Rasprava

Neplodnost ozbiljno koči održivi razvoj ljudskog društva, a muška neplodnost čini 50 posto pacijenata s neplodnošću. Kontinuiranim razvojem medicinske tehnologije, klinička razina liječenja muške neplodnosti značajno je poboljšana. Međutim, postojeće metode kirurškog liječenja, kao što je potpomognuta reproduktivna tehnologija, imaju nedostatke poput visoke cijene i niske stope uspjeha te imaju mali raspon korisnika. Prikladni su za pacijente koji imaju potpunu azoospermiju tijekom vađenja mikrospermija iz testisa, imaju jasne genetske bolesti i ne žele se liječiti iz različitih razloga [16]. Stoga su i domaći i međunarodni napori uloženi u razvoj sigurnijih i pouzdanijih metoda liječenja muške neplodnosti, a terapija lijekovima postala je žarište istraživanja u području muške neplodnosti [17]. Postojeća klinička praksa pokazala je da tradicionalna kineska medicina u Kini ima dobru učinkovitost i sigurnost u liječenju muške neplodnosti [18].

Djelotvornost Cistanche deserticola - Tonificiranje bubrega

Cistanche glikozid je vruća tema u liječenju muške neplodnosti u tradicionalnoj kineskoj medicini posljednjih godina. Njegova glavna komponenta, glikozid Cistanche, ima različite farmakološke aktivnosti, uključujući jačanje imunološke funkcije [19], poboljšanje muške reproduktivne funkcije [20], antioksidanse [21] i anti-osteoporozu [22]. Kako bi se dodatno razjasnio mehanizam djelovanja Cistanche glikozida nakon što uđe u ljudsko tijelo, ova je studija odabrala Cistanche glikozid, hidrolizat Cistanche glikozida, kao predmet istraživanja za istraživanje specifičnog mehanizma kojim hidrolizat ispoljava svoj farmakološki učinak. Prvo, otkrili smo da Cistanche glikozid I može pospješiti proliferaciju mišjih spermatogonijalnih matičnih stanica. Vrijedno je napomenuti da glikozid Cistanche I nije promicao proliferaciju matičnih stanica spermatogonija miša na način ovisan o koncentraciji, što ukazuje da glikozid Cistanche I ima raspon doze siguran. Zatim smo otkrili da je glikozid Cistanche I značajno povećao razinu ekspresije proteina Bmi1 koji je usko povezan s muškom reproduktivnom funkcijom. Nedavno su istraživači otkrili da nedostatak Bmi1 može ozbiljno utjecati na reproduktivnu funkciju muških miševa, što se uglavnom očituje u oligospermiji i povećanju testisa [23]. U međuvremenu, druga studija naše istraživačke grupe također je potvrdila da inhibicija Bmi1 može ozbiljno utjecati na sposobnost proliferacije matičnih stanica spermatogonija. Stoga nagađamo da glikozid I Cistanche koji potiče proliferaciju mišjih spermatogonijalnih matičnih stanica može biti povezan s regulacijom ekspresije Bmi1. Prema izvješćima, p-Akt je usko povezan s proliferacijom i diferencijacijom stanica [14]. Stoga smo testirali promjene u p-Akt proteinu uzrokovane Cistanche glikozidom I i otkrili da Cistanche glikozid I također pojačava p-Akt. Konačno, istražili smo uzvodno i nizvodno odnos između Akt i Bmi1. Vrijedno je napomenuti da postoje razlike u rezultatima istraživanja uzvodnog i nizvodnog odnosa između Bmi1 i Akt dobivenih u različitim laboratorijima [24-25]. Rezultati ove studije pokazuju da Akt-specifični inhibitori reguliraju Bmi1 naniže, dok utišavanje Bmi1 ne utječe na razine Akt mRNA, što ukazuje da bi Akt mogao biti uzvodno od Bmi1, koji regulira Akt. U studiji o učinku utišavanja Bmi1 na Akt, istraživali smo ga samo na razini mRNA. Kako je Bmi1 inhibitor transkripcije, nagađamo da bi mogla postojati interakcija između proteina Bmi1 i proteina Akt. Međutim, trenutačno nema potpunih dokaza koji potvrđuju uzvodno i nizvodno odnos između Akt i Bmi1. Stoga ćemo to u budućnosti dopunjavati i poboljšavati.

Učinci Cistanche-Tonifying bubrega

Ukratko, ova je studija po prvi put otkrila da glikozid Cistanche I ima učinak promicanja proliferacije matičnih stanica spermatogonija, otkrivajući novi mehanizam glikozida Cistanche I koji potiče proliferaciju matičnih stanica spermatogonija na staničnoj razini, obogaćujući teorijsku osnovu za primjenu Cistanche glikozida u kliničkom liječenju muške neplodnosti.

referenca

［1］ Dutta S, Biswas A, Sengupta P. Pretilost, endokrini poremećaj i muška neplodnost ［J］. Asian Pac J Reprod, 2019, 8(5): 195.

［2］ Zhang F, Liu M, Gao J. Promjene u kodirajućim genima sinaptonemalnog kompleksa i ljudska neplodnost ［J］. Int J Biol Sci, 2022, 18(5): 1933-1943.

［3］ Serrano R, Garcia-Marin LJ, Bragado MJ. Fosfoproteom sperme: razotkrivanje muške neplodnosti［J］. Biologija (Basel), 2022, 11(5): 659.

［4］ Yang D, Liu HQ, Yang Z, et al. BMI1 u srcu: Nove funkcije izvan tumorigeneze［J］. EBioMedicine, 2021, 63: 103193.

［5］ Abeyrathna P, Su Y. Kritična uloga Akta u kardiovaskularnoj funkciji ［J］. Vascul Pharmacol, 2015, 74: 38-48.

［6］ Peltier J, O'Neill A, Schaffer DV. PI3K/Akt i CREB reguliraju proliferaciju i diferencijaciju odraslih neuralnih hipokampalnih progenitora ［J］. Dev Neurobiol, 2007, 67(10): 1348-1361.

［7］ Rafalski VA, Brunet A. Energetski metabolizam u sudbini odraslih neuralnih matičnih stanica ［J］. Prog Neurobiol, 2011, 93: 182–203.

［8］Liu Zichen, Xu Ying, Chen Shizhong Farmakokinetika i tkivna distribucija Cistanche glikozida I u štakora [J] Kineski farmaceutski časopis, 2008. (11): 848-851

［9］Zi Hui, Li Keqiang, Shang Deyang, et al Usporedba metabolizma i tkivne distribucije Cistanche glikozida u monomernim i složenim spojevima u modelu štakora osteoporoze [J] Kineski časopis za eksperimentalne recepte, 2015., 21 (6): {{ 4}}

［10］Zi Hui, Fan Ying, Jiang Ning, et al. Eksperimentalna studija o promicanju osteogene diferencijacije mezenhimalnih matičnih stanica koštane srži štakora putem BMP/Runx2/Osx signalnog puta pomoću Cistanche glikozida I i Cistanche glikozida II [J] Chinese Journal of Osteoporoza, 2019, 25 (05): 690-695

［11］ Zhou S, Dong J, Xiong M, et al. UHRF1 stupa u interakciju sa snRNA i regulira alternativno spajanje u matičnim stanicama spermatogonija miša［J］. Izvješća o matičnim stanicama, 2022., 17(8): 1859-1873.

［12］ Yu J, Shen C, Lin M, et al. BMI1 promiče održavanje spermatogonijalnih matičnih stanica epigenetskom potiskivanjem Wnt10b/-katenin signalizacije ［J］. Int J Biol Sci, 2022, 18(7): 2807-2820.

［13］ Chen Z, Li L, Wu W, et al. Vježbanje štiti proliferativne mišićne satelitske stanice od iscrpljenosti preko Igfbp7-Akt-mTOR osi ［J］. Teranostika, 2020., 10(14): 6448-6466.

［14］ Ma Y, Sender S, Sekora A, et al. Inhibitorni odgovor na inhibitore puta PI3K/AKT MK-2206 i buparlisib povezan je s genetskim razlikama u staničnim linijama duktalnog adenokarcinoma gušterače ［J］. Int J Mol Sci, 2022, 23(8): 4295.

［15］ Carson SA, Kallen AN. Dijagnostika i liječenje neplodnosti: Pregled ［J］. JAMA, 2021, 326(1): 65-76.

［16］ Bosch E, De Vos M, Humaidan P. Budućnost krioprezervacije u potpomognutim reproduktivnim tehnologijama ［J］. Front Endocrinol (Lausanne), 2020, 11: 67.

［17］ Wang M, Wang Q, Du Y, et al. Vitamini u kombinaciji s tradicionalnom kineskom medicinom za mušku neplodnost: sustavni pregled i metaanaliza ［J］. Andrologija, 2020, 8(5): 1038-1050.

［18］ Zhang Z, Yang J, Kong T, et al. Elementi sindroma tradicionalne kineske medicine muške neplodnosti otkriveni analizom modela latentnog stabla ［J］. J Tradit Chin Med, 2018., 38(6): 926-935.

［19］Ji Xin Napredak istraživanja o imunomodulatornom učinku Cistanche glikozida [J] Hebei Pharmaceutical, 2016., 38 (05): 753-756

［20］Li Kangmei, Li Mingxing, Chen Minqi i dr. Napredak istraživanja o učincima Cistanche glikozida na reproduktivni sustav [J] Western Traditional Chinese Medicine, 2022., 35 (04): 143-146

［21］Zhang Pan, Shi Juan, Liu Li, et al Studija o antioksidativnoj aktivnosti Cistanche glikozida i njihovih derivata [J] China Food Additives, 2016., (02): 85-88

［22］Zhang Hao, Zheng Yuling, Ding Hui Napredak istraživanja o povezanim putovima glikozida cistanhe u liječenju osteoporoze [J] Časopis Sveučilišta tradicionalne kineske medicine Tianjin, 2022., 41 (04): 531-538

［23］ Dai X, Zhang Q, Yu Z, et al. Miševi s manjkom Bmi1 pokazuju mušku neplodnost［J］. Int J Biol Sci, 2018, 14(3): 358-368.

［24］ Yang W, Wu Z, Yang K, et al. BMI1 potiče srčanu fibrozu kod zatajenja srca izazvanog ishemijom putem signalnog puta PTEN-PI3K/Akt-mTOR［J］. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2019, 316(1): H61-H69.

［25］ Su Z, Yang Z, Xu Y, et al. Apoptoza, autofagija, nekroptoza i metastaze raka［J］. Mol Cancer, 2015, 14: 48.