Sažetak

Ovaj izum otkriva aEkstrakt cistanke za poboljšanje mineralne gustoće kostiju (BMD). U ekstraktu,ukupni sadržaj ehinakozida i akteozida (verbaskozid)je>25 tež.%. Ekstrakt se priprema izvođenjemekstrakcija destiliranom vodomodsirovi prah odCistanche tubulosa, nakon čega slijedifiltracija, centrifugiranjefiltrata,koncentracija, tekućina–tekuća ekstrakcija, koncentracija s uklanjanjem nečistoća, razrjeđivanje, naknadno liječenje, a zatimkonačno koncentriranje i sušenjeza dobivanje ekstrakta Cistanche.

 

 

Proces ekstrakcije Cistanche

U ekstraktu Cistanche za poboljšanje mineralne gustoće kostiju prema izumu,ukupni sadržaj ehinakozida i akteozidaje25-30 % težine(bez 25 mas. %), a ekstrakt je također bogatšikiminska kiselinakao ikomponente tipa fenilpropionske kiselineikomponente alkaloidnog tipa, omogućujući mu dastabilno ostvaruju učinak poboljšanja gustoće kostiju.

 

Potraživanja

1. Metoda pripreme

Metoda za pripremu ekstrakta Cistanche za poboljšanje mineralne gustoće kostiju, naznačena time što uključuje sljedeće korake:

drobljenjeCistanche tubulosaza dobivanje sirovog prahaCistanche tubulosa;

dodavanjem destilirane vode u sirovi prahCistanche tubulosaza ekstrakciju, filtriranje, centrifugiranje filtrata i koncentriranje da se dobije koncentrirana otopinaCistanche tubulosa;

ekstrahiranje koncentrirane otopineCistanche tubulosakoncentriranje donje faze ekstrakcije da se uklone nečistoće i razrjeđivanje da se dobije otopina za punjenje;

naknadna obrada otopine za punjenje, nakon čega slijedi koncentracija i sušenje da se dobije ekstrakt Cistanche.

2. Omjer materijala i vode

2. Metoda prema zahtjevu 1, naznačena time što je omjer mase i volumena sirovog praha odCistanche tubulosana destiliranu vodu je1 : (15–25).

3. Temperatura ekstrakcije

2. Metoda prema zahtjevu 1, naznačena time što je temperatura ekstrakcije destiliranom vodom60-100 stupnjeva.

4. Omjer tijekom ekstrakcije tekućina-tekućina

2. Metoda prema zahtjevu 1, naznačena time što se tijekom ekstrakcije koncentrirane otopine, volumenski omjer koncentrirane otopineCistanche tubulosado ekstrakcije otapalo je1 : (1–5).

5. Otapalo za ekstrakciju

5. Metoda prema zahtjevu 4, naznačena time što ekstrakcijsko otapalo sadrži najmanje jedan odpetrol eter, etil acetat, n-heksan ili cikloheksan.

6. Proces naknadne obrade

Metoda prema zahtjevu 1, naznačena time što naknadna obrada otopine za punjenje uključuje: propuštanje otopine za punjenje krozmakroporozna smola, a zatim eluiranjem sekvencijalno sadestilirana vodai anotopina etanola.

7. Elucijski volumeni

7. Metoda prema zahtjevu 6, naznačena time, da je volumni omjer destilirane vode i makroporozne smole(5–10) : 1, a omjer volumena otopine etanola prema makroporoznoj smoli je(3–9) : 1.

8. Ekstrakt

Ekstrakt Cistanche za poboljšanje mineralne gustoće kostiju, naznačen time što je pripravljen prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 1-7.

9. Sadržaj aktivnog markera

9. Ekstrakt Cistanche prema zahtjevu 8, naznačen time, da je ukupni sadržaj ehinakozida i akteozida25-30 % težine, isključujući 25 mas.%.

10. Primjena

10. Upotreba ekstrakta Cistanche u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 8-9 u pripremi proizvoda za poboljšanje mineralne gustoće kostiju, pri čemu je koncentracija ekstrakta Cistanche u proizvodu12,5-25 ug/mL.

 

Tehničko područje

[0001] Ovaj izum se odnosi na područjemedicinske formulacije, a posebno se odnosi na aEkstrakt cistanke za poboljšanje mineralne gustoće kostiju, svojenačin pripreme, iaplikacije.

Pozadina

[0002] Cistanche se odnosi na osušenu mesnatu stabljiku s ljuskastim listovima biljaka OrobanchaceaeCistanche deserticola YC MailiCistanche tubulosa (Schenk) Wight. Cistanche ima više aktivnosti kao što suimunološka regulacija, protuupalno, protiv umora, antioksidans, neuroprotektivni, ipodrška reproduktivnom sustavu.

Feniletanoidni glikozidi (PhGs)-saehinakozidiakteozid (verbaskozid)kao glavni PhG u Cistanche-su važni sastojci.Ehinakoziddokazano je da ima učinak napoboljšanje mineralne gustoće kostiju. Međutim, otkrili smo da je učinak ekstrakata Cistanche na poboljšanje gustoće kostijunije samo u korelaciji sa sadržajem ehinakozida. Jednostavna kontrola sadržaja ehinakozidane može osiguratida će ekstraktstabilnoimaju učinak poboljšanja gustoće kostiju. Stoga je ključno razviti ekstrakt Cistanche i način pripreme koji možestabilnopostići željeni učinak potpore gustoći kostiju.

[0003] Kineska prijava patenta za izumCN102441040Aotkriva metodu pripreme ukupnih feniletanoidnih glikozida iz Cistanche putem pulverizacije, ekstrakcije, adsorpcije makroporozne smole, eluiranja, koncentracije, itd. Pod slabo kiselim uvjetima (pH 2-4), stabilnost Cistanche feniletanoidnih glikozida je značajno poboljšana, a rezultirajući ukupni glikozidi sadrže ehinakozid i akteozid u kombiniranom omjeru > 90%. Međutim, ne provjerava može li proizvodstabilnopoboljšati mineralnu gustoću kostiju.

Kineska prijava patenta za izumCN105111255Aotkriva metodu za ekstrakciju i odvajanje ehinakozida i akteozida iz Cistanche, korištenjem 75% etanola kao ekstrakcijskog otapala, AB-8 makroporozne smole kao materijala za pakiranje i 55% eluacije etanolom, čime se dobiva ekstrakt Cistanche s ehinakozidom > 25%, akteozidom > 10%, i ukupnim PhG-om > 80%. Međutim, možda još uvijek ne jamči astabilanučinak poboljšanja gustoće kostiju.

 

Sažetak izuma

[0004] Razviti ekstrakt Cistanche i metodu pripreme koja možestabilnopodržava poboljšanu mineralnu gustoću kostiju, izum osigurava:

Prvi aspekt: ​​Metoda pripreme

Metoda pripreme ekstrakta Cistanche za poboljšanje mineralne gustoće kostiju, koja uključuje:

drobljenjeCistanche tubulosaza dobivanje sirovog praha;

ekstrahiranje sirovog praha destiliranom vodom, filtriranje, centrifugiranje i koncentriranje da se dobije koncentrirana otopina;

izvođenje ekstrakcije; koncentriranje donje faze za uklanjanje nečistoća; razrjeđivanje da se dobije otopina za punjenje;

naknadna obrada otopine za punjenje, koncentriranje i sušenje kako bi se dobio ekstrakt Cistanche.

[0005] U jednoj izvedbi, sirovi prah se propušta kroz a40-mrežasito.

[0006] U jednoj izvedbi, omjer mase i volumena sirovog praha prema destiliranoj vodi je1 : (15–25).

[0007] U jednoj izvedbi, omjer mase i volumena je1 : 20.

[0008] U jednoj izvedbi, temperatura ekstrakcije je60-100 stupnjeva.

[0009] U jednoj izvedbi, temperatura ekstrakcije je80 stupnjeva.

[0010] U jednoj izvedbi, izvodi se ekstrakcija1–2 puta, 1 sat svaki put.

[0011] U jednoj izvedbi, filtracija se izvodi kroz an80-meshfilter.

[0012] U jednoj izvedbi, brzina centrifugiranja je3000–4000 o/mina vrijeme je3–9 min.

[0013] U jednoj izvedbi, brzina centrifugiranja je3500 o/mina vrijeme je5 min.

[0014] U jednoj izvedbi, nakon centrifugiranja, filtrat se koncentrira na70 stupnjevado18%–28%početnog volumena.

[0015] U jednoj izvedbi, tijekom ekstrakcije koncentrirane otopine, omjer volumena koncentrirane otopine i ekstrakcijskog otapala je1 : (1–5).

[0016] U jednoj izvedbi, omjer je1 : 3.

[0017] U jednoj izvedbi, otapalo za ekstrakciju sadrži najmanje jedan odpetrol eter, etil acetat, n-heksan ili cikloheksan.

[0018] U jednoj izvedbi, ekstrakcija se izvodi uzastopno pomoćupetrol eterslijedietil acetat.

[0019] U jednoj izvedbi, "koncentracija s uklanjanjem nečistoća" znači koncentriranje donje faze ekstrakcije u pastu, otapanje u300 mL 50 wt% vodenog etanolaza uklanjanje nečistoća i prilagođavanje1,0–1,5 g sirove biljke po mlkao rješenje za opterećenje.

[0020] U jednoj izvedbi, koncentracija otopine za punjenje je1,0–1,5 g sirove biljke/mL vode.

[0021] U jednoj izvedbi, naknadna obrada uključuje propuštanje otopine za punjenjemakroporozna smola, a zatim eluiranjem sekvencijalno sadestilirana vodai anotopina etanola.

[0022] U jednoj izvedbi, brzina protoka punjenja kroz makroporoznu smolu je1–5 ml/min.

[0023] U jednoj izvedbi, smola jeAB-8 makroporozna smolas volumenom smole od0.93 L.

[0024] U jednoj izvedbi, omjer volumena destilirane vode i smole je(5–10) : 1, a omjer volumena otopine etanola i smole je(3–9) : 1.

[0025] U jednoj izvedbi, omjer volumena destilirane vode i smole je7 : 1, a omjer otopine etanola i smole je6 : 1.

[0026] U jednoj izvedbi, otopina etanola je80% (težinski) vodeni etanol.

Drugi aspekt: ​​Ekstrakt

[0027] Izum dalje osigurava ekstrakt Cistanche pripremljen gore navedenom metodom.

[0028] U jednoj izvedbi, ukupni sadržaj ehinakozida i akteozida je25-30 % težine, isključujući 25 tež.%.

Treći aspekt: ​​Koristite

Izum dalje osigurava upotrebu ekstrakta Cistanche u pripremi proizvoda za poboljšanje mineralne gustoće kostiju, gdje je koncentracija ekstrakta u proizvodu12,5-25 ug/mL.

 

Prednosti / Korisni učinci

[0030] U usporedbi s stanjem tehnike, izum ima sljedeće korisne učinke:

Ekstrakt Cistanche sadrži25-30 % težineukupni ehinakozid i akteozid, a bogat ješikiminska kiselina, komponente tipa fenilpropionske kiseline, alkaloidi, imasne kiseline, omogućujući mu dastabilnopodržavaju poboljšanje mineralne gustoće kostiju.

Unutar12,5-25 ug/mLraspon koncentracije, ekstrakt potiče proliferacijuMC3T3-E1stanice s izvrsnim proliferativnim učinkom.

Ekstrakt pokazuje isti trend vezan uz dozu u poticanju stanične proliferacije iALP aktivnost, i može stabilno promicati proliferaciju i diferencijaciju. U poticanju mineralizacije osteoblasta pokazuje bolji učinak od pozitivne kontrole17 -estradiol.

Ekstrakt stimulira faktore transkripcije specifične za osteoblastePokrenix2iOsx, pojačava diferencijaciju osteoblasta i potiče ekspresiju osteogenih markeraOPNiOCN, čime se potiče stvaranje kostiju. Također se povećavaBmp2 mRNAekspresije kako bi se pojačala diferencijacija osteoblasta i stvaranje nove kosti aktiviranjemBMP/Smad put; nadalje, reguliranjemLrp5 mRNA, Lrp6 mRNA, iWnt3 mRNA, aktivira seWnt/-catenin signalizacija, utječe na ekspresiju faktora transkripcije nizvodno i potiče diferencijaciju osteoblasta i stvaranje kostiju.

Metodom priprave dobiva se ekstrakt koji sadrži feniletanoidne glikozide (ehinakozid i akteozid), šikimsku i fenilpropionsku kiselinu, alkaloide i masne kiseline. Ove komponente zajedno omogućuju ekstraktu da pokaže dosljednu ovisnost o dozi u proliferaciji, diferencijaciji i mineralizaciji, omogućujući stabilne učinke podrške gustoći kostiju.

 

Kratak opis crteža

[0035] Slika . 1: Učinak ekstrakta (Primjer 1) na proliferaciju stanica MC3T3-E1
Slika . 2: Učinak ekstrakta (Primjer 2) na proliferaciju stanica MC3T3-E1
Slika. 3: Učinak ekstrakta (Primjer 3) na proliferaciju stanica MC3T3-E1
Slika . 4: Učinak ekstrakta (Primjer 1) na aktivnost ALP
Slika . 5: Učinak ekstrakta (Primjer 2) na aktivnost ALP
Slika. 6: Učinak ekstrakta (Primjer 3) na aktivnost ALP
Slika. 7: Fotografije bojenja alizarin crvenim mineralizacije osteoblasta (Primjer 2)
Slika. 8: Kvantitativni rezultati mineralizacije osteoblasta (Primjer 2)
Slika. 9–12: Učinci primjera 2 na ekspresiju mRNA Runx2, Osx, Opn, Ocn
Slika . 13: Učinak primjera 2 na ekspresiju Bmp2 mRNA (BMP/Smad)
Slika. 14–16: Učinci primjera 2 na ekspresiju mRNA Lrp5, Wnt3, Lrp6 (Wnt/-katenin)
Slika. 17–18: Učinci primjera 2 na ekspresiju proteina Osx i RUNX2

 

Detaljan opis/utjelovljenja

Primjer 1

[0036] Metoda pripreme uključuje:

drobljenjeCistanche tubulosa, prolazeći kroz sito od 40 mesh da se dobije200 gsirovi prah;

vađenje sadestilirane vode u 5× mas(kako je opisano), vađenje na75 stupnjevaza2 puta, 1 h svaki, koncentrirajući se na70 stupnjevado omjera koncentracije od1 : 2.2dobiti koncentriranu otopinu;

dodavanje apsolutnog etanola u koncentriranu otopinu za stupnjevano taloženje etanola s konačnom masenom koncentracijom etanola od20%, 40%, 60%, 80%, taloženje na5 stupnjeva 24 sata, prikupljanje supernatanta nakon80 tež.%taloženje etanola;

koncentriranje i sušenje na70 stupnjevaza dobivanje ekstrakta Cistanche, s prinosom od20.75%.

Primjer 2

[0037] Metoda pripreme uključuje:

drobljenjeCistanche tubulosadobiti240 gsirovi prah;

ekstrakciju destiliranom vodom, filtriranje, centrifugiranje i koncentriranje da se dobije koncentrirana otopina;

ekstrakcija koncentrirane otopine; koncentriranje donje faze za uklanjanje nečistoća; razrjeđivanje da se dobije otopina za punjenje;

naknadna obrada otopine za punjenje; koncentriranje i sušenje na70 stupnjevaza dobivanje ekstrakta, s prinosom od19.69%.

Sirovi prah prolazi kroz sito od 40 mesh.
[0039] Omjer mase i volumena sirovog praha prema destiliranoj vodi je1 : 20.
[0040] Temperatura ekstrakcije je80 stupnjeva.
[0041] Izvodi se ekstrakcija1–2 puta, 1 h svaki.
[0042] Filtriranje je kroz an80-meshfilter.
[0043] Centrifugiranje je3500 o/min za 5 min.
Koncentracija nakon centrifugiranja: koncentrirati na70 stupnjevado20%početnog volumena.
[0045] Tijekom ekstrakcije, omjer volumena koncentrirane otopine i otapala je1 : 3.
Ekstrakcija se izvodi sekvencijalno spetrol eterietil acetat.
[0047] Donja faza je koncentrirana u pastu i otopljena u njoj300 mL 50 wt% vodenog etanolaza uklanjanje nečistoća.
[0048] Koncentracija otopine za punjenje:1,0 g sirove biljke/mL vode.
[0049] Naknadna obrada: proći kroz makroporoznu smolu, eluirati destiliranom vodom zatim otopinom etanola.
[0050] Brzina protoka kroz smolu:3 mL/min.
[0051] Smola:AB-8, volumen smole0.93 L.
[0052] Omjer volumena destilirane vode i smole:7 : 1. Omjer otopine etanola i smole:6 : 1.
[0053] Otopina etanola:80% (w/w)vodeni etanol.

 

Kliknite za više detalja o tvornici cistanche

Primjer 3

[0053] Metoda pripreme uključuje:

drobljenjeCistanche tubulosa, prolazeći kroz sito od 40 mesh da se dobije120 gsirovi prah;

vađenje sa12× masaod50 tež.% vodenog etanola, vađenje na70 stupnjeva, 2 puta, 1 h svaki, koncentrirajući se na70 stupnjevau omjeru od1 : 2.5dobiti koncentriranu otopinu;

dodavanje vode za podešavanje koncentracije0,2 g sirove biljke/mL vode, centrifugiranje na3500 o/min za 5 min, uzimajući supernatant kao otopinu za punjenje;

prolazak kroz makroporoznu smolu; sekvencijalno eluiranje destiliranom vodom i otopinom etanola; prikupljanje etanolskog eluiranja i koncentriranje/sušenje na70 stupnjevada se dobije ekstrakt s prinosom od24.30%.

[0054] Smola:HPD750, volumen smole0.93 L.
[0055] Omjer destilirane vode i smole:3 : 1. Omjer otopine etanola i smole:4 : 1.
[0056] Otopina etanola:30% (w/w)vodeni etanol.

 

Testiranje performansi

1.1 Test stanične proliferacije

[0057] Osteoblasti su glavne funkcionalne stanice odgovorne za formiranje kostiju, uključujući proliferaciju pre-osteoblasta, proizvodnju koštanog matriksa i konačnu diferencijaciju. TheMC3T3-E1stanična linija se obično koristi za proučavanje osteogene aktivnosti. Diferencijacija osteoblasta uključuje proliferaciju, diferencijaciju i mineralizaciju - što se očituje kao povećani broj pre-osteoblasta, sazrijevanje u osteoblaste i stvaranje novog koštanog matriksa.

alkalna fosfataza (ALP)je protein povezan s fenotipom osteoblasta koji se može otkriti tijekom stanične proliferacije i sazrijevanja matriksa i često je korišten rani marker diferencijacije osteoblasta.

Stoga, procjenom proliferacije MC3T3-E1 i aktivnosti ALP-a, uspoređena je aktivnost ekstrakata pripremljenih u primjerima 1-3 koji potiču osteogenezu.

MC3T3-E1 stanice su oživljene i pasirane. Nakon stabilizacije, stanice su digestirane, centrifugirane i sakupljene. Gustoća stanica je podešena tako da je svakih 100 µL sadržavalo 5×1035 x 10^35×103 stanica i nasađeno je u ploču s 96 jažica. Nakon uzgoja preko noći, medij je zamijenjen potpunim medijem koji je sadržavao ekstrakte iz primjera 1-3 u koncentracijama od6,25, 12,5, 25 i 50 ug/mL, ili sadrži0,1 M estradiola(pozitivna kontrola), ili sam medij (slijepa kontrola), i kultiviran za48 h. Pod uvjetima zaštićenim od svjetlosti, dodana je matična otopina MTT (10%–20% volumena jažice), inkubirana4 hu CO₂ inkubatoru, medij uklonjen i200 µL DMSOdodano za otapanje formazana. Vrijednosti OD izmjerene su na490 nm.

Rezultati: Slika. 1 (Primjer 1), Slika. 2 (Primjer 2), Slika. 3 (Primjer 3).

[0058] Stopa stanične proliferacije (%)=OD(Primjer 1–3)−OD(Prazno)OD(Prazno)×100%\\frac{OD(\\text{Primjer 1–3}) - OD(\\text{Prazno})}{OD(\\text{Prazno})} \\puta 100\\%OD(Prazno)OD(Primjer 1–3)−OD (prazno)​×100%

[0059] Kao što je prikazano na slici. 1-3, pozitivna kontrola je pospješila proliferaciju MC3T3-E1. Primjer 1 pospješuje proliferaciju pri 6,25, 12,5 i 25 ug/mL; stopa proliferacije pri 12,5 ug/mL bila je 1,4x veća od pozitivne kontrole, ali bez značajne razlike (P > 0,05). Primjer 2 pospješuje proliferaciju pri 6,25, 12,5, 25 i 50 ug/mL; pri 12,5, 25 i 50 ug/mL njegovi su učinci bili superiorniji od pozitivne kontrole (P <0,01 ili P <0,001), sa stopama proliferacije 2,55×, 3,46× i 2,59× pozitivne kontrole. Primjer 3 pospješuje proliferaciju pri 6,25, 12,5, 25 i 50 ug/mL; pri 12,5, 25 i 50 ug/mL bio je bolji od pozitivne kontrole (P <0,01 ili P <0,001), sa stopama proliferacije 1,40×, 1,76× i 0,93× pozitivne kontrole. Ovo ukazuje da je Primjer 2 imao najbolji učinak na poticanje proliferacije MC3T3-E1.

1.2 Test aktivnosti ALP

[0060] Aktivnost ALP-a je mjerena pomoću kompleta za ispitivanje ALP-a. Osnovna koncentracija p-nitrofenola bila je 10 mM, a koncentracije standardne krivulje bile su 0, 0,02, 0,04, 0,08, 0,12, 0,16, 0,2 i 0,25 mM, pripremljene gradijentnim razrjeđivanjem s puferom za detekciju.

Za svaku jažicu uzorka u ploči s 96 jažica dodano je 49 µL pufera za detekciju, 1 µL proteina ekstrahiranog iz tretiranih MC3T3-E1 stanica (iz odjeljka 1.1) i 50 µL kromogenog supstrata (dodan posljednji). Reakcija je trajala 30 minuta u inkubatoru zaštićenom od svjetlosti, prekinuta je dodavanjem 100 µL stop otopine, a apsorbancija je izmjerena na405 nm. Aktivnost ALP izračunata je iz standardne krivulje.

Rezultati: Slika. 4 (Primjer 1), Slika. 5 (Primjer 2), Slika. 6 (Primjer 3).

[0061] Aktivnost ALP (U/L)=(relativna molarna koncentracija proteina) × 1000 × 100 / 30
(1000 za pretvorbu molarne jedinice; 100 za ukupni reakcijski volumen; 30 za vrijeme reakcije od 30 minuta)

ALP je rani marker diferencijacije MC3T3-E1. Slika . 4–6 pokazuje da je pozitivna kontrola povećala aktivnost ALP. Primjer 1 nije promovirao aktivnost ALP. Primjer 2 povećao je aktivnost ALP na 12,5, 25 i 50 ug/mL; kod 25 i 50 ug/mL razlike u odnosu na slijepu probu bile su značajne (P <0,01). Primjer 3 povećao je aktivnost ALP-a na 12,5 i 25 ug/mL (P <0,001), ali s porastom koncentracije, pojačanje se smanjilo. Ovo ukazuje da su samo Primjeri 2 i 3 povećali aktivnost ALP i podržali diferencijaciju.

[0062] Sveukupno, samo je Primjer 2 pokazao pozitivnu korelaciju doze iu proliferaciji MC3T3-E1 i u aktivnosti ALP na 12,5 i 25 ug/mL. Primjer 3 pokazao je korelaciju pozitivnu dozu za proliferaciju, ali korelaciju negativnu dozu za ALP. Usporedno, primjer 2 je prikladniji za poboljšanje mineralne gustoće kostiju.

1.3 Mineralizacija (bojanje alizarin crveno) primjera 2

[0063] Budući da je Primjer 2 pokazao najbolju aktivnost i korelaciju doze u usporedbi s Primjerima 1 i 3, eksperimenti mineralizacije su provedeni kako bi se dodatno procijenio njegov učinak.

[0064] MC3T3-E1 stanice su tretirane nakon 72 h kulture s ekstraktom Primjera 2 na12,5, 25 i 50 ug/mL, inkubirana na 37 stupnjeva14 days(na temelju stvaranja kvržica kalcija), sa srednjim promjenama svaka 2 dana. Provedeno je bojanje alizarin crvenim: medij je uklonjen, stanice fiksirane s 10% neutralnim formalinom (300 μL/jažici) 30 minuta, isprane, obojene 0,1% alizarin crvenim (300 μL/jažici) 30 minuta (sobna temperatura, zaštićeno od svjetlosti) i isprane sve dok crvena boja ne prestane. Slike su snimljene. Zatim je dodana 10% otopina cetilpiridinijeva klorida (400 μL/jažici) i mućkana 1 h da se otope kalcificirani noduli. Otopljena otopina je prebačena na ploču s 96 jažica (100 μL/jažici) i OD je izmjeren na562 nmizračunati stopu mineralizacije. Fotografije: Fig. 7; kvantitativni rezultati: Slika. 8.

[0065] Stopa mineralizacije (%)=OD(Primjer 2)−OD(Prazno)OD(Prazno)×100%\\frac{OD(\\text{Primjer 2}) - OD(\\text{Prazno})}{OD(\\text{Prazno})} \\puta 100\\%OD(Prazno)OD(Primjer 2)−OD (prazno)×100%

[0066] Slika . 7 pokazuje da se broj nodula kalcija povećava sekvencijalno s koncentracijom u odnosu na slijepu probu. Slika. 8 pokazuje da je Primjer 2 poticao mineralizaciju na način ovisan o koncentraciji pri 12,5, 25 i 50 ug/mL, s najjačim učinkom pri 50 ug/mL, značajno bolje od pozitivne kontrole (P <0,001). Budući da mineralizirani noduli predstavljaju konačnu fazu diferencijacije osteoblasta, ovi rezultati dodatno potvrđuju učinak podržavanja gustoće kosti iz Primjera 2 i pokazuju njegovu stabilnu aktivnost. Primjer 2 bio je bolji od estradiola, što ukazuje na potencijalnu vrijednost proizvoda za zdravlje kostiju.

Ekspresija gena i mehanizam puta (primjer 2)

[0067] Ekstrakt iz primjera 2 (12,5, 25, 50 ug/mL) primijenjen je na MC3T3-E1 stanice tijekom 3 dana. Ekstrakcija RNA, kvantifikacija, reverzna transkripcija (sustav od 20 μL; unos 800 ng RNA) i qRT-PCR provedeni su kako bi se kvantificirale relativne razine ekspresijeRunx2 mRNA, Osx mRNA, Opn mRNA i Ocn mRNA. Rezultati: Slika. 9–12.

[0068] Runx2 i Osx su ključni nizvodni regulatori u BMP signalizaciji, inducirajući diferencijaciju osteoblasta. Runx2 je važan u ranoj fazi predanosti, dok Osx funkcionira u diferencijaciji terminala. OPN i OCN su važni pokazatelji aktivnosti osteoblasta i mineralizacije tkiva. Slika . 9–12 pokazuje da je Primjer 2 povećao relativnu ekspresiju ovih markera, podupirući pojačanu diferencijaciju osteoblasta i stvaranje kostiju.

[0069] Primjer 2 pojačanBmp2 mRNA(Slika. 13), što ukazuje na aktivacijuBMP/Smad put, koji podržava diferencijaciju osteoblasta i stvaranje nove kosti.

[0071] Primjer 2 povećao je relativnu ekspresijuLrp5 mRNA, Lrp6 mRNA i Wnt3 mRNA(Slika. 14–16), podržavajući aktivacijuWnt/-catenin signalizacija, koji je usko povezan s proliferacijom osteoblasta, diferencijacijom i stvaranjem kostiju.

Ekspresija proteina (Primjer 2)

[0073] Western blot analiza je pokazala da se Primjer 2 povećaoOsxiRUNX2ekspresija proteina (Slika . 17–18), što ukazuje na regulaciju na transkripcijskoj i translacijskoj razini za promicanje diferencijacije osteoblasta.

[0075] Ovi testovi aktivnosti pokazuju da je Primjer 2 pružio najbolji učinak poticanja proliferacije i bio je jedini s dosljednom korelacijom doze i za proliferaciju i za ALP. Primjer 2 je također bio superiorniji od estradiola u poticanju proliferacije i mineralizacije MC3T3-E1, s usporedivim učincima diferencijacije, što ukazuje na optimalni potencijal potpore gustoći kostiju.

 

Ispitivanje kemijskog sastava

6.1 Sadržaj feniletanoidnih glikozida

[0076] S obzirom na "Cistanche" metodu ispitivanja u kineskoj farmakopeji, mjeren je sadržaj ehinakozida i akteozida u primjerima 1-3 (rezultati prikazani u tablici 1). Na temelju ehinakozida, akteozida i ukupnog PhG-a, trend je bio dosljedan: Primjer 3 > Primjer 1 > Primjer 2, a akteozid u Primjeru 3 bio je 3,85× odnosno 4,27× veći od primjera 1 i 2. Kombinacija rezultata aktivnosti i sadržaja pokazuje da sami ehinakozid i akteozid ne određuju izravno osteogene učinke.

 

Tablica 1. Sadržaj ehinakozida i akteozida u ekstraktima Cistanche (%)

Uzorak (Primjer)	Ehinakozid (%)	Akteozid/verbaskozid (%)	Ukupno (%)
Primjer 1	28.68	1.63	30.31
Primjer 2	26.27	1.47	27.74
Primjer 3	30.39	6.27	36.66

 

6.2 Ostale komponente (UPLC/Q-TOF/MS)

[0078] UPLC/Q-TOF/MS korišten je za usporedbu kemijskih komponenti između Primjera 1-3. Vrijednosti odgovora prikazane su u tablici 2.

[0079] Osim ehinakozida i akteozida, Primjer 2 je sadržavao dodatnešikiminska kiselina i komponente tipa fenilpropionske kiseline, i takođeralkaloidi. U usporedbi s primjerima 1 i 3, primjer 2 je imao 11 komponenti povezanih s fenilpropionskom/šikimskom kiselinom s najvećim odgovorima, uključujući:

Tablica 2. UPLC/Q-TOF/MS vrijednosti odgovora ključnih komponenti u ekstraktima Cistanche (Primjeri 1-3)

注:原表为"响应值(vrijednost odgovora)";我保留为纯数值,不加单位(与图表一致).表内分为2组:Derivati ​​šikiminske i fenilpropionske kiseline(莽草酸及苯丙酸类)与 Alkaloidi(生物碱).

A. Šikiminska kiselina i derivati ​​fenilpropionske kiseline

Spoj	Primjer 1	Primjer 2	Primjer 3
Izodanfenolna kiselina B (异丹酚酸B)	1,514,590.932	5,985,000.378	5,279,315.212
p-hidroksifenilpropionska kiselina (对羟基苯丙酸)	2,897,237.374	6,144,507.902	1,139,582.918
Šikiminska kiselina (莽草酸)	6,539,932.014	8,883,034.928	7,442,038.152
(2R)-2-[(E)-3-[3-[(1R)-1-karboksi-2-(3,4-dihidroksifenil)etoksi]karbonil-2-(3,4-dihidroksifenil)-7-hidroksi-2,3-dihidrobenzofuran-4-il]prop-2-enoil]oksi-3-(3,4-dihidroksifenil)propanska kiselina	1,514,590.932	5,985,000.378	5,279,315.212
Benzoilaceton (苯甲酰丙酮)	4,235,952.540	4,526,539.189	4,297,281.060
Epipinorezinol 4′-O- -D-glukozid (表丁香树脂酚 4′-O- -D-葡萄糖苷)	2,758,386.748	4,338,477.068	1,182,637.856
Yangmei Changshan glikozid* (杨梅常山苷)	713,259.014	9,202,359.822	841,791.016
Jionozid A1 (焦地黄苯乙醇苷A1)	2,184,856.679	3,736,929.302	3,098,713.743
3,4-dimetilbenzojeva kiselina (3,4-2甲基苯甲酸)	585,269.7562	1,386,349.28	1,400,433.204
Robustaside D	1,693,753.421	3,272,248.064	4,236,657.164
7-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihidroksi-6-[[(2S,3R,4S,5R)-3,4,5-trihidroksitetrahidropiran-2-il]oksimetil]tetrahidropiran-2-il]oksikromen-2-on	4,489,728.765	1,167,879.841	824,633.4

 

---

B. Alkaloidi

Spoj	Primjer 1	Primjer 2	Primjer 3
Verticine (野百合碱)	1,306,481.28	524,919.97	4,057,704.757
Dihidrokoptizin (氢化可他宁碱)	6,406,217.365	9,533,850.521	4,649,410.535
timin (胸腺嘧啶)	2,658,397.084	2,715,160.269	554,956.4602
Gelsemine (钩吻碱)	3,698,263.919	1,554,195.385	5,144,366.562
Yohimbine (育亨宾)	3,929,806.438	1,286,932.427	9,431,924.132

izodanfenolna kiselina B,

p-hidroksifenilpropionska kiselina,

(2R)-2-[(E)-3-[3-[(1R)-1-karboksi-2-(3,4-dihidroksifenil)etoksi]karbonil-2-(3,4-dihidroksifenil)-7-hidroksi-2,3-dihidrobenzofuran-4-il]prop-2-enoil]oksi-3-(3,4-dihidroksifenil)propanska kiselina,

benzoilaceton,

epipinorezinol 4′-O- -D-glukozid,

glikozid sličan miricetinu (kako je naveden),

jionosid A1,

3,4-dimetilbenzojeva kiselina,

robustazid D,

7-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihidroksi-6-[[(2S,3R,4S,5R)-3,4,5-trihidroksitetrahidropiran-2-il]oksimetil]tetrahidropiran-2-il]oksikromen-2-on.

Također sadrži 5 alkaloida, uključujući:

Verticine,

dihidrokoptizin (kako je navedeno),

timin,

alkaloid srodan gelseminu (kako je navedeno),

johimbin.

[0080] Na temelju usporednih rezultata proliferacije/aktivnosti ALP-a, testova feniletanoidnog glikozida i kemijskog profiliranja, može se zaključiti da feniletanoidni glikozidi (ehinakozid i akteozid), shikiminska/fenilpropionska kiselina, alkaloidi i terpenoidi zajedno čine specifični sastav ekstrakta iz Primjera 2, proizvodeći konzistentan ovisnost o dozi (12,5–25 ug/mL) kroz proliferaciju, diferencijaciju i mineralizaciju, omogućujući stabilne učinke potpore gustoći kostiju.

[0081] Tablica 2: vrijednosti odgovora komponenti.
[0082] Izum, putem postupka iz primjera 2, daje ekstrakt Cistanche s ukupnim ehinakozidom + akteozidom > 25% i obogaćenim shikiminskom/fenilpropionskom kiselinom i alkaloidima, što omogućuje stabilne učinke na gustoću kostiju. Unutar 12,5-25 ug/mL, potiče proliferaciju, diferencijaciju i mineralizaciju MC3T3-E1 na način povećanja doze s dosljednom korelacijom doze, podupirući bolje i stabilnije rezultate zdravlja kostiju i omogućujući upotrebu u proizvodima koji se odnose na poboljšanje mineralne gustoće kostiju.