Ekstrakt Cistanche Deserticola povećava stvaranje kostiju u osteoblastima
Mar 05, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com
Te-Mao Lia, Hsin-Chih Huangb, Chen-Ming Suc, Tin-Yun Hoa, Chi-Ming Wua, Wen-Chi Chend, Yi-Chin Fonga,ei Chih-Hsin Tangf,c
Sažetak
Ciljevi:Istraživali smo učinakCistanche deserticola Ma. (CD) na formiranje kosti uzgojenim osteoblastima.MetodeTest formiranja mineraliziranih nodula korišten je za ispitivanje in vitro učinaka CD-a na stvaranje kostiju. Ekspresija mRNA alkalne fosfataze (ALP), koštanih morfogenetskih proteina (BMP) -2 i osteopontina (OPN) analizirana je kvantitativnom lančanom reakcijom polimeraze u stvarnom vremenu. Mehanizam djelovanja CD ekstrakta istražen je pomoću Western blottinga. In-vivo antiosteoporotski učinak ekstrakta CD-a procijenjen je na ovarijektomiranim miševima.Ključni pronalasciEkstrakt CD-a nije imao učinka na proliferaciju, migraciju ili zacjeljivanje rana uzgojenih osteoblasta, ali je povećao ALP, BMP-2 i OPN mRNA i mineralizaciju kostiju. Mitogen-aktivirana protein kinaza (MAPK) ili inhibitori nuklearnog faktora (NF)-kB smanjili su stvaranje kosti izazvano CD ekstraktom i ekspresiju ALP, BMP-2 i OPN. Međutim, CD ekstrakt nije utjecao na osteoklastogenezu. Uz to, ekstrakt CD-a spriječio je gubitak koštane mase izazvan ovariektomijom in vivo.ZaključciCD bi mogao biti novo sredstvo za stvaranje kostiju za liječenje osteoporoze.
Uvod
Kost je složeno tkivo sastavljeno od nekoliko tipova stanica koje prolaze kontinuirani proces obnove i popravka koji se naziva 'pregradnja kostiju'. Dvije glavne vrste stanica odgovorne za remodeliranje kosti su osteoklasti, koji resorbiraju kost, i osteoblasti, koji tvore novu kost. Pregradnju kostiju regulira nekoliko sistemskih hormona (npr. paratiroidni hormon, 1, 25-hidroksivitamin D3, spolni hormoni i kalcitonin) i lokalni čimbenici (npr. dušikov oksid, prostaglandini, faktori rasta i citokini).[1]
Osteoporoza nastaje kada su resorpcija i stvaranje kosti nekoordinirani, a višak razgradnje kosti nadmašuje izgradnju kosti.[2] Trenutačni tretmani za osteoporozu uključuju bisfosfonate, kalcitonin i estrogen, koji su inhibitori resorpcije kostiju koji održavaju koštanu masu inhibicijom aktivnosti osteoklasta.[3] Međutim, učinak ovih lijekova u povećanju ili oporavku koštane mase je relativno mali, sigurno ne više od 2 posto godišnje.[3] Stoga postoji potreba za sredstvima za izgradnju kostiju, kao što je teriparatid, koja stimuliraju stvaranje nove kosti i ispravljaju promjene u trabekularnoj mikroarhitekturi koja je karakteristična za utvrđenu osteoporozu.[4,5] Budući da je stvaranje nove kosti prvenstveno funkcija osteoblasti, agensi koji djeluju bilo povećanjem proliferacije stanica osteoblastične loze ili induciranjem diferencijacije osteoblasta mogu poboljšati stvaranje kosti.[5,6]
Iako mehanizmi osteoporoze ostaju nejasni, vjerojatno su povezani sa smanjenom dostupnošću ili učincima čimbenika rasta kostiju, kao što su koštani morfogenetski proteini (BMP).[7] BMP, koji su strukturno povezani s superporodicom transformirajućeg faktora rasta-b, izvorno su identificirani po svojoj sposobnosti da induciraju ektopičnu formaciju kostiju kod glodavaca.[8] BMP igraju važnu ulogu u formiranju kostiju i diferencijaciji koštanih stanica stimulirajući aktivnost alkalne fosfataze (ALP), kao i sintezu proteoglikana, kolagena i osteopontina (OPN).[9] Nedavna studija pronašla je vezu između osteoporoze i specifičnih polimorfizama u BMP-2, ALP i OPN genima, što sugerira da su povezani s razvojem osteoporoze.[10]
Cistanche deserticola Ma.(Orobanchaceae; skraćeno CD) je izvorna biljka u Kini i naširoko se koristi u tradicionalnoj medicini kao terapeutsko sredstvo zbog svojih sedativnih, analgetskih i imunostimulirajućih svojstava.[11] Suvremene farmakološke studije pokazale su da CD ekstrakti mogu stimulirati imunitet [12], hvatati slobodne radikale [13] i povećati aktivnost superoksid dismutaze.[14] Protuupalni i antioksidativni agensi imaju potencijal za liječenje osteoporoze povećanjem stvaranja kostiju i/ili suzbijanjem resorpcije kosti [15,16] Međutim, učinak CD-a na funkciju koštanih stanica još nije utvrđen. Ovdje izvješćujemo da ekstrakt CD-a nije utjecao na proliferaciju, migraciju ili aktivnost zacjeljivanja rana uzgojenih osteoblasta, ali je povećao ekspresiju ALP-a, BMP-2 i OPN-a i mineralizaciju kostiju. Osim toga, pokazujemo da signalni putovi mitogen-aktivirane protein kinaze (MAPK) i nuklearnog faktora (NF)-kB mogu biti uključeni u CD-posredovano povećanje ekspresije gena i mineralizacije kostiju. Nasuprot tome, CD ekstrakt nije potisnuo osteoklastogenezu in vitro. Značajno je da je liječenje miševa CD ekstraktom spriječilo gubitak koštane mase induciran ovariektomijom in vivo. Naši podaci, stoga, sugeriraju da se CD može koristiti za poticanje stvaranja kostiju za liječenje osteoporoze.
Cistanche deserticola
Materijali i metode
Ekstrakt i materijali Cistanche deserticola
CD ekstrakt je kupljen od Chuang Song-Zong Pharmaceutical Company (Kaohsiung, Tajvan). Ekstrakcija i izolacija CD-a su praćeni kao što je prethodno opisano (na temelju spektralnih podataka identificirali su kemijski sastav uključujući beta-sitosterol, daukosterol, jantarnu kiselinu, triakontanol, akteozid, betain i polisaharid).[17] Zečja poliklonska protutijela specifična za p-ekstracelularne kinaze regulirane signalom (ERK), ERK, p-p38, p38, pc-Jun N-terminalne kinaze (JNK), JNK, p-p65 i p65 kupljene su od Santa Cruz Biotechnology ( Santa Cruz, SAD). Komplet osteokalcin ELISA kupljen je od Biosource Technology (Nivelles, Belgija). C-terminalni telopeptidi ELISA kompleta kolagena tipa I dobiveni su od Cross Laps (Herlev, Danska). P38 dominantno-negativni mutant osigurao je dr. J. Han (South-Western Medical Center, Dallas, SAD). JNK dominantno-negativni mutant osigurao je dr. M. Karin (Sveučilište Kalifornije, San Diego, SAD). ERK2 dominantno negativni mutant osigurao je dr. M. Cobb (South-Western Medical Center). Svi ostali reagensi nabavljeni su od Sigma-Aldrich (St Louis, SAD).
Kultura stanica
Stanična linija mišjih osteoblasta MC3T3-E1 kupljena je od American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, SAD). Stanice su uzgajane u 95 posto zraka, 5 posto CO2 s a-MEM-om koji je nadopunjen s 20 mm HEPES i 10 posto toplinski inaktiviranog fetalnog telećeg seruma, 2 mm-glutamina, penicilina (100 U/ml) i streptomicina (100 mg /ml).
Mjerenje formiranja mineraliziranih nodula
Formiranje mineraliziranih nodula procijenjeno je kako je opisano.[18] Ukratko, osteoblasti su uzgajani u mediju koji je sadržavao vitamin C (50 mg/ml) i b-glicerofosfat (10 mm) dva tjedna, a medij je mijenjan svaka tri dana. Nakon inkubacije s CD ekstraktom tijekom 12 dana, stanice su isprane dva puta s 20 mm Tris-puferiranom fiziološkom otopinom koja sadrži
0.15 m NaCl (pH 7,4), fiksirano u ledeno hladnom 75 posto (v/v) etanolu 30 minuta i osušeno na zraku. Taloženje kalcija određeno je bojanjem alizarin crvenim S. Ukratko, stanice i matrica fiksirane etanolom bojane su 1 h s 40 mm alizarin crvenim-S (pH 4,2) i opsežno isprane vodom. Vezana mrlja je eluirana s 10 posto (w/v) cetilpiridinijevim kloridom, a alizarin crveno-S u uzorcima je kvantificirano mjerenjem apsorbancije na 550 nm i uspoređeno sa standardnom krivuljom. Jedan mol alizarin crvenog-S selektivno veže približno dva mola kalcija.
Kvantitativna lančana reakcija polimeraze u stvarnom vremenu
Ukupna RNA ekstrahirana je iz osteoblasta pomoću TRIzol kompleta (MDBio Inc., Taipei, Tajvan). Reverzna transkripcija provedena je korištenjem 2 mg ukupne RNA i oligo(dT) početnice.[19,20] Kvantitativna lančana reakcija polimeraze u stvarnom vremenu (qPCR) provedena je korištenjem TaqMan® jednostupanjske PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, SAD). Dodana je ukupna cDNA (100 ng po 25-ml reakcije) s početnicama specifičnim za sekvencu i Taqman® probama. Svi primeri ciljnih gena i sonde kupljeni su komercijalno, uključujući b-aktin kao internu kontrolu (Applied Biosystems). qPCR testovi provedeni su u tri primjerka na StepOnePlus sustavu za detekciju sekvenci (Applied Biosystems). Uvjeti ciklusa bili su 10-minutna aktivacija polimeraze na 95 stupnjeva nakon čega je slijedilo 40 ciklusa od 95 stupnjeva tijekom 15 s i 60 stupnjeva tijekom 60 s. Prag je postavljen iznad pozadine kontrole bez uzorka i unutar linearne faze umnožavanja ciljnog gena kako bi se izračunao broj ciklusa u kojem je otkriven transkript (označeno CT).
Western blot analiza
Stanični lizati su pripremljeni kao što je prethodno opisano.[21,22] Proteini su odvojeni pomoću SDS-PAGE i prebačeni na Immobilon polivinil difluoridne membrane (Millipore, Billerica, SAD). Mrlje su blokirane 4-postotnim goveđim serumskim albuminom 1 sat na sobnoj temperaturi, a zatim testirane zečjim anti-ljudskim protutijelima protiv p-65 ili p-p65 (1:1000) 1 h na sobnoj temperaturi. Nakon tri ispiranja, mrlje su inkubirane s peroksidazom konjugiranim magarećim anti-zečjim sekundarnim protutijelom (1:1000) 1 sat na sobnoj temperaturi. Mrlje su vizualizirane pojačanom kemiluminiscencijom pomoću X-OMAT LS filma (Eastman Kodak, Rochester, SAD).
Osteoporoza izazvana ovarijektomijom
Ženke ICR miševa, stare četiri tjedna, 22~28 g, korištene su za ovu studiju. Miševima je ovariektomizirana bilateralno pod anestezijom trikloracetaldehidom (100 mg/kg), a kontrolni miševi su lažno operirani (Sham) za usporedbu. Mineralna gustoća kostiju i sadržaj minerala u kostima mjereni su nakon oralne primjene različitih koncentracija ekstrakata CD-a svaka dva dana tijekom četiri tjedna. Ukupna tjelesna mineralna gustoća kostiju i mineralni sadržaj kostiju određeni su rendgenskim apsorpciometrom s dvostrukom energijom (DEXA; XR-26; Norland, Fort Atkinson, SAD) koristeći način za male subjekte kao što je prethodno opisano.[18, 23] Svi su protokoli bili u skladu s institucionalnim smjernicama i odobreni su od strane Odbora za brigu o životinjama Kineskog medicinskog sveučilišta.
Statistička analiza
Statistička analiza provedena je korištenjem softvera Prism 4.01. (GraphPad Software Inc., San Diego, SAD). Dane vrijednosti su srednje vrijednosti ± SEM. Statistička analiza između dva uzorka provedena je Studentovim t-testom. Statističke usporedbe više od dvije skupine provedene su korištenjem jednosmjerne analize varijance s Bonfer-Ronijevim posthoc testom. U svim slučajevima P < 0,05="" smatralo="" se="">
Ekstrakt Cistanche deserticola
Rezultati
Ekstrakt Cistanche deserticola povećava mineralizaciju kostiju osteoblastima
Dodavanje ekstrakta CD-a tijekom 24 ili 48 sati nije utjecalo na proliferaciju stanica mišjeg osteoblasta MC3T3-E1 u MTT testu (podaci nisu prikazani). Budući da je diferencijacija osteoblasta složen proces koji uključuje staničnu proliferaciju i migraciju, također smo testirali migracijsku sposobnost stanica MC3T3-E1 nakon tretmana CD ekstraktom. Koristeći Transwell i testove zacjeljivanja rana, otkrili smo da CD ekstrakt nije utjecao na migraciju osteoblasta (podaci nisu prikazani). Stvaranje mineraliziranih nodula jedan je od markera sazrijevanja osteoblasta. Bojanje alizarin crvenim S pokazalo je da su mineralizirani noduli nastali kada su osteoblasti kultivirani dva tjedna u mediju koji je sadržavao vitamin C (50 mg/ml) i b-glicerofosfat (10 mm), a to se povećalo na način ovisan o koncentraciji dodatkom CD-a (slika 1a). Stoga je ekstrakt CD-a inducirao stvaranje koštanih nodula kultiviranim osteoblastima, ali ne i njihovu proliferaciju ili migraciju. Također smo ispitali ulogu ekstrakta CD-a u osteoklastogenezi izazvanoj RANKL-om, ali nismo pronašli nikakav učinak (podaci nisu prikazani).
Ekstrakt Cistanche deserticola povećava ekspresiju alkalne fosfataze, koštanog morfogenetskog proteina-2 i osteopontina u kultiviranim osteoblastima
Diferencirani osteoblasti pokazuju povećanu aktivnost ALP, što je u korelaciji s visokim razinama ekspresije enzima.[18] Utvrdili smo da je liječenje CD ekstraktom tijekom 72 sata značajno povećalo aktivnost ALP osteoblasta (Slika 1b). S obzirom na ključnu ulogu BMP-2, ALP i OPN u diferencijaciji osteoblasta, testirali smo ima li ekstrakt CD-a učinak na diferencijaciju osteoblasta reguliranjem ekspresije BMP-2, ALP i OPN. Tretiranje stanica CD ekstraktom povećalo je ekspresiju mRNA ALP, BMP-2 i OPN na način ovisan o koncentraciji (Slika 1c), pokazujući da je CD ekstrakt inducirao diferencijaciju osteoblasta regulacijom ALP, BMP-2 , i OPN izraz.
Ekstrakt Cistanche deserticola povećava formiranje koštanih nodula kroz put protein kinaze aktiviran mitogenom
Zabilježeno je da MAPK igra važnu ulogu u formiranju kosti [24,25] pa smo zatim ispitali je li ovaj signalni put uključen u mineralizaciju kosti izazvanu ekstraktom CD-a. Prethodni tretman stanica inhibitorom ERK U0126, inhibitorom p38 SB203580 ili inhibitorom JNK SP600125 smanjio je mineralizaciju kostiju povećanu ekstraktom CD-a (slike 2a, 3a i 4a). Nadalje, inhibitori su također blokirali ekspresiju ALP, BMP-2 i OPN izazvanu ekstraktom CD-a (slike 2b-4c). Transfekcija stanica s ERK2, p38 ili JNK mutantom smanjila je povećanje CD ekstrakta u ekspresiji mRNA ALP, BMP-2 i OPN (slike 2c, 3c i 4c). Zatim smo izravno ispitali ERK, p38 i JNK aktivaciju nakon tretmana CD ekstraktom. Inkubacija stanica s ekstraktom CD-a izazvala je fosforilaciju ERK, p38 i JNK (slike 2d, 3d i 4d). Prema tome, ERK, p38 i JNK posreduju u povećanom formiranju kosti izazvanom CD tretmanom osteoblasta.
Ekstrakt Cistanche deserticola povećava stvaranje koštanih nodula putem nuklearnog faktora-kB
Kao što je prethodno spomenuto, aktivacija NF-kB je neophodna za formiranje kosti.[26,27] Sljedeći smo tretman osteoblasta s NF-kB inhibitorima pirolidin ditiokarbamatom (PDTC) i N-tozil-L-fenilalanin klorometil ketonom (TPCK) kupljeni od Calbiochem (Darmstadt, Njemačka) kako bi se utvrdilo je li aktivacija NF-kB uključena u mineralizaciju kosti izazvanu ekstraktom CD-a. Slika 5a pokazuje da je predtretman osteoblasta s PDTC ili TPCK inhibirao stvaranje koštanih nodula izazvano ekstraktom CD-a i također smanjio povećanje ekspresije ALP, BMP-2 i OPN (Slika 5b i 5c). Fosforilacija podjedinice NF-kB p65 pokazatelj je aktivacije NF-kB;[28] u skladu s tim, otkrili smo da CD ekstrakt povećava fosforilaciju p65 u osteoblastima (Slika 5d). Ovi rezultati pokazuju da je aktivacija NF-kB važna za ekspresiju ALP, BMP-2 i OPN izazvanu ekstraktom CD-a i stvaranje koštanih čvorića.
Inhibicija gubitka koštane mase ekstraktom Cistanche deserticola u ovarijektomiziranih miševa
Kako bi se ispitao učinak CD ekstrakta na gubitak koštane mase, osteoporoza je inducirana u ženki miševa ovariektomijom. Kao što se očekivalo, miševi s ovariektomijom pokazali su smanjenu ukupnu mineralnu gustoću kostiju i mineralni sadržaj kostiju (Slika 6a i 6b). Liječenje CD ekstraktom tijekom četiri tjedna inhibiralo je gubitak mineralne gustoće kostiju i mineralnog sadržaja kostiju na način ovisan o dozi (Slika 6a i 6b). Koncentracije ALP u krvi mogu odražavati osteoblastičnu aktivnost.[29] Kao što je prikazano na slici 6c, CD ekstrakt je inhibirao smanjenje aktivnosti ALP u serumu izazvano ovarijektomijom. Uz to, ekstrakt CD-a također je povećao razinu osteokalcina, markera formiranja kostiju, i smanjio razinu C-terminalnih telopeptida kolagena tipa I, markera resorpcije kosti (Slika 6d i 6e). Ovi nalazi stoga podupiru moć i učinkovitost CD ekstrakta u sprječavanju gubitka koštane mase in vivo.
Rasprava
Cistanche deserticolaMa, izvorna biljka u Kini, naširoko se koristi u tradicionalnoj medicini za različite terapijske tretmane zbog svog sedativnog, analgetskog i imunostimulirajućeg djelovanja.[11-15] Ovdje smo pokazali da CD ekstrakt inducira mineralizaciju kosti u kultiviranim osteoblastima, ali jest ne utječe na njihovu migraciju ili proliferaciju stanica. Osim toga, otkrili smo da su ALP, BMP-2 i OPN ciljni proteini signalizacije izazvane CD ekstraktom, što zahtijeva aktivaciju ERK, p38, JNK i NF-kB.
Kost je složeno tkivo sastavljeno od nekoliko vrsta stanica koje kontinuirano prolaze kroz proces obnove i popravka.[30] Kada su resorpcija i formiranje kosti neuravnoteženi, razgradnja kosti nadjačava stvaranje kosti i rezultira osteoporozom.[30] Koristili smo ovariektomirane miševe kako bismo ispitali antiosteoporotski učinak CD ekstrakta. Miševi kojima je uklonjena ovarijektomija imali su smanjenu ukupnu mineralnu gustoću kostiju i sadržaj minerala u kostima, što je ublaženo tretmanom ekstraktom CD-a. CD ekstrakt je također povećao serumske razine osteogenog markera ALP i osteokalcina. Stoga je CD sredstvo za stvaranje kostiju koje sprječava gubitak koštane mase uzrokovan ovariektomijom in vivo.
Iako mehanizmi osteoporoze nisu sasvim jasni, vjerojatno su povezani sa smanjenom dostupnošću ili smanjenim učincima faktora rasta kostiju, kao što su ALP, BMP-2 i OPN. Ova tri čimbenika igraju važnu ulogu u procesu formiranja i remodeliranja kosti [31], a dobro je dokumentirano da je stimulacija diferencijacije stanica osteoblasta karakterizirana uglavnom povećanom ekspresijom ALP, BMP-2 i OPN.[32] ] U ovoj studiji otkrili smo da ekstrakt CD-a povećava ekspresiju ALP, BMP-2 i OPN te poboljšava mineralizaciju kostiju. Stoga ekstrakt CD-a posreduje u stvaranju kostiju djelomično regulirajući ekspresiju ALP, BMP-2 i OPN.
Zabilježeno je da je p38 uključen u regulaciju ekspresije ALP tijekom diferencijacije osteoblastičnih stanica; [33] slično tome, ERK1/2 je važan za proliferaciju i diferencijaciju osteoblasta [34,35] JNK je uključen u stvaranje osteoklasta. [36] Ovdje smo pokazali da ekstrakt CD-a izaziva fosforilaciju ERK, p38 i JNK, a inhibitori ovih enzima antagoniziraju potenciranje mineralizacije kosti posredovano ekstraktom CD-a, sugerirajući da aktivacija ERK, p38 i JNK igra obaveznu ulogu u formiranju kosti izazvanom ekstraktom CD-a osteoblasti. Uz to, inhibitori enzima i dominantno negativni mutanti ERK, p38 i JNK smanjili su ekspresiju ALP, BMP-2 i OPN pojačanu ekstraktom CD-a. Ovi podaci sugeriraju da je aktivacija putova ERK, p38 i JNK potrebna za povećanje ekspresije i sazrijevanja ALP, BMP-2 i OPN uzrokovano ekstraktom CD-a u osteoblastima. Zabilježeno je da ERK povećava proliferaciju i diferencijaciju osteoblasta.[34,35] Međutim, nismo otkrili učinak CD ekstrakta na proliferaciju osteoblasta. Stoga su drugi putovi mogli poništiti učinak ERK nakon stimulacije ekstraktom CD-a ili su bili nužni za proliferaciju. U tom smislu, otkrili smo da inhibitori PI3K i Akt također smanjuju mineralizaciju kosti izazvanu CD ekstraktom i ekspresiju mRNA ALP, BMP-2 ili OPN (podaci nisu prikazani). Stoga bi ti putovi mogli biti potrebni za stvaranje kosti izazvano CD ekstraktom.
Pokazalo se da NF-kB kontrolira funkciju osteoblasta u kostima.[37] Rezultati ove studije pokazuju da aktivacija NF-kB doprinosi mineralizaciji kosti izazvanoj CD ekstraktom i ekspresiji ALP, BMP-2 i OPN u kultiviranim osteoblastima te da inhibitori signalnog puta ovisnog o NF-kB (PDTC i TPCK ) inhibirao je mineralizaciju kosti izazvanu CD ekstraktom i ekspresiju ALP, BMP-2 i OPN. p65 je fosforiliran na Ser536 raznim kinazama u nekoliko signalnih putova, što povećava potencijal transaktivacije p65.[38] Rezultati ove studije pokazali su da CD ekstrakt povećava fosforilaciju p65. Uzeti zajedno, ovi rezultati sugeriraju da je aktivacija NF-kB potrebna za stvaranje kosti izazvano CD ekstraktom u kultiviranim osteoblastima. Također smo otkrili da inhibitori ERK, p38 i JNK poništavaju aktivnost NF-kB luciferaze izazvanu ekstraktom CD-a (podaci nisu prikazani), u skladu s time da su ti enzimi uzvodni posrednici aktivacije NF-kB izazvane ekstraktom CD-a. Stoga ekstrakt CD-a potiče stvaranje kosti putem ERK/p38/JNK/ i NF-kB puteva.
Zaključci
Ova je studija pokazala da CD ekstrakt inducira diferencijaciju i sazrijevanje osteoblasta, ali ne i proliferaciju ili migraciju. CD ekstrakt je također povećao ekspresiju ALP, BMP-2 i OPN i mineralizaciju kostiju. Pokazali smo da su putevi ERK, p38, JNK i NF-kB uključeni u stvaranje kosti posredovano CD ekstraktom i ekspresiju ALP, BMP-2 i OPN. Nadalje, ekstrakt CD-a spriječio je in vivo gubitak koštane mase izazvan ovariektomijom. Stoga CD može biti koristan u poticanju stvaranja kostiju u liječenju osteoporotičnih bolesti.
