Aktivne flavonoidne komponente i potencijalni mehanizmi nadzemnih dijelova Glycyrrhiza Uralensis za kronični prostatitis na temelju mrežne farmakologije i eksperimentalne validacije
Nov 06, 2025
Sažetak:
Cilj: Utvrditi djelatne tvari i moguće mehanizme djelovanja flavonoida iz nadzemnog dijela Cistanche za kronični prostatitis. Metode: Tekućinska kromatografija ultraučinkovitosti–kvadrupol–elektrostatsko polje Orbitrap spektrometrija mase visoke rezolucije (UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS) korištena je za identifikaciju glavnih flavonoidnih sastojaka u alkoholnom ekstraktu nadzemnih dijelova Cistanche. Mrežna farmakologija i molekularni docking korišteni su za predviđanje ključnih komponenti i ključnih ciljeva povezanih s kroničnim prostatitisom. Štakorski model kroničnog prostatitisa induciran je karagenanom, a histopatološke promjene u prostati štakora promatrane su HE bojenjem. Serumske razine DHT-a, IFN-a, IgG-a, IL-6, PSA i TNF-a mjerene su pomoću ELISA testa kako bi se procijenila terapijska učinkovitost ekstrakta. Rezultati: U alkoholnom ekstraktu identificirana su ukupno 44 flavonoida. Mrežna farmakologija je pokazala da ključne komponente, uključujući glicirizin, trihotecenske izoflavone, bodljikavu manzanita florifera i glicirizin (predviđeni kao reprezentativni sastojci), imaju učinke protiv kroničnog prostatitisa djelovanjem na ključne mete kao što su AKT1, TNF, VEGFA, EGFR i MMP9, čime reguliraju povezane signalne putove. Molekularno spajanje pokazalo je povoljne afinitete vezanja između osnovnih komponenti i ključnih ciljeva. Eksperimenti na životinjama pokazali su da alkoholni ekstrakt nadzemnih dijelova Cistanchea ima jasan terapeutski učinak na kronični prostatitis kod štakora. Zaključak: Učinkovitost nadzemnih dijelova Cistanchea protiv kroničnog prostatitisa je potvrđena. Aktivne komponente, uključujući bodljikavi aristolohicin, trihostatin izoflavone i glicirizin, mogu djelovati preko PI3K–AKT signalnog puta za modulaciju EGFR, AKT1 i MMP9.
Ključne riječi: nadzemni dijelovi Cistanche; kronični prostatitis; flavonoid; UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS; mrežna farmakologija
cistanche koristi za zdravlje prostate
Uvod:
Tradicionalna kineska ljekovita biljka Cistanche (Cistanche spp.) sastoji se od osušenog ljekovitog materijala koji se prvenstveno koristi u TKM-u. To je važan medicinski izvor u Kini, sa funkcijama kao što su toniziranje i potpora tjelesnim funkcijama, uklanjanje vrućine i detoksikacija, ublažavanje boli i usklađivanje formula, a obično se koristi kao dodatna komponenta u mnogim receptima s više biljaka. Tržišna potražnja je velika kako na domaćem tako i na međunarodnom tržištu. Nadzemni dijelovi, uključujući stabljike i lišće, bogati su resursi koji čekaju razvoj i korištenje.
Kronični prostatitis česta je urološka bolest muškaraca mlađe i srednje dobi. Klinički simptomi uključuju bol u donjem dijelu trbuha ili zdjelice, disuriju i učestalo mokrenje. Bez pravodobnog liječenja može dovesti do seksualne disfunkcije kao što je preuranjena ejakulacija i erektilna disfunkcija, što ozbiljno utječe na fizičko i mentalno zdravlje muškaraca.
Flavonoidi su bogati nadzemnim dijelovima Cistanche i pokazuju značajna protuupalna i antitumorska djelovanja. Prethodne studije pokazale su da su nadzemni dijelovi bogati flavonoidima s antitumorskim i protuupalnim djelovanjem. Obogaćivanje flavonoidima iz nadzemnih dijelova pokazalo je dobro antioksidativno djelovanje in vitro. Farmakodinamičkim istraživanjima također je utvrđeno da flavonoidi iz nadzemnih dijelova djeluju preventivno i terapeutski na kronični prostatitis.
U ovoj studiji UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS korišten je za profiliranje flavonoida u alkoholnom ekstraktu nadzemnih dijelova Cistanche. Mrežna farmakologija primijenjena je za predviđanje ključnih ciljeva i putova za kronični prostatitis, molekularno spajanje korišteno je za zaključivanje mehanizama, a pokusi na životinjama provedeni su kako bi se potvrdila aktivnost protiv kroničnog prostatitisa, pružajući referencu za kasniji razvoj lijeka i kliničku primjenu.
Materijali
Životinje
Muški SD štakori SPF stupnja (n=24), stari 6-7 tjedana, tjelesne težine 230-250 g [Beijing Speifu Biotechnology Co., Ltd.; licenca za proizvodnju: SCXK (Jing) 2019-0010]. Životinje su bile smještene u SPF ustanovi za životinje u Centru za eksperimentalne životinje Pekinškog sveučilišta kineske medicine. Protokol je odobrilo institucionalno etičko povjerenstvo (br. odobrenja: BUCM-2023110204-4271).
instrumenti
Ultimate 3000 UPLC sustav (Dionex, SAD)
Maseni spektrometar visoke rezolucije Thermo Q Exactive Plus (Thermo Fisher Scientific, SAD)
KH500DE digitalni ultrazvučni čistač (Kunshan Hechuang)
FA2004N elektronička vaga (Beijing Sartorius)
H1650 rashladna centrifuga niske brzine (Changsha Xiangyi)
RE-5023 rotacijski isparivač (Shanghai Yarong)
Elektronički grijaći plašt s kontroliranom temperaturom (Tianjin Teste)
Multiskan MK3 čitač mikropločica (Thermo Scientific, Šangaj)
B032 fluorescentni invertirani biološki mikroskop (Nikon Instruments, Šangaj)
N5000 UV spektrofotometar (Shanghai Youke)
Reagensi
Nadzemni dijelovi Cistanche (stabljike, listovi i mala količina mahuna) sakupljeni su u rujnu 2019. iz okruga Guazhou, grad Jiuquan, provincija Gansu, a autentičnost je potvrdio prof. Wang Wenquan (Institut za razvoj ljekovitog bilja, CAMS) kao Cistanche spp.
Ostali reagensi: Ulatan (Shandong Keyuan Biochemical Co., serija C15887472); karagenan (Peking Solarbio, serija 20220601); Qianliekang Pule'an tablete (Zhejiang Conba Pharmaceutical); natrijeva karboksimetil celuloza (CMC-Na; Shanghai YuanYe, serija S14016); ELISA kompleti za štakorski DHT, IFN-, IgG, IL-6, PSA i TNF- (Shanghai Enzyme-linked Biotechnology); Multiskan MK3 čitač mikropločica (Thermo Scientific); fiksativ za tkivo (Guangzhou Shuopu, serija 23257838); etanol (Beijing Chemical Works, analitički stupanj); metanol, mravlja kiselina, acetonitril (Fisher Scientific, MS stupanj); voda (Wahaha Group). Referentni standardi (čistoća > 98%, Shanghai YuanYe): likviritigenin, puerarin, izoorientin II, naringenin, izokvercitrin, izolikviritin, ononin, izokvercitrin, kvercetin, astragalin, kemferol, formononetin.
Metode i rezultati
2.1 Kemijsko profiliranje alkoholnog ekstrakta iz nadzemnih dijelova Cistanche
2.1.1 Priprema uzorka
Odgovarajuće količine nadzemnih dijelova ekstrahirane su 70%-tnim etanolom. Ekstrakt je koncentriran do suhog. Ostatak je ultrazvučno otopljen u vodi 20 minuta, centrifugiran na 3000 r·min-1 15 minuta, a supernatant je koncentriran do suhog. Odgovarajuća količina osušenog uzorka stavljena je u odmjernu tikvicu od 5 mL i dovedena do željene količine metanolom kako bi se dobila ispitivana otopina.
2.1.2 Kromatografski i spektrometrijski uvjeti mase
Uvjeti UPLC: kolona ACQUITY UPLC BEH C18 (2,1 mm × 100 mm, 1,7 μm); mobilna faza A, acetonitril; mobilna faza B, 0,5% mravlja kiselina u vodi; elucija gradijenta (0–20 min, 5%–20% A; 20–70 min, 20%–30% A); brzina protoka 0,2 mL·min−1; volumen injekcije 2 μL; temperatura stupca 30 stupnjeva.
MS uvjeti: HESI izvor; modovi pozitivnih i negativnih iona; akvizicija potpunog skeniranja; napon prskanja +3.2 kV (pozitivno) i −3,0 kV (negativno); kapilarna temperatura 320 stupnjeva; plaštni plin 40 arb; pomoćni plin 15 arb; pomoćni grijač 350 stupnjeva ; MS rezolucija 70 000; MS/MS rezolucija 17,500; raspon skeniranja m/z 100–1500.
Popis specifikacija Cistanche
2.1.3 Identifikacija komponenti
Uzorak zračnog dijela analiziran je UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS kako bi se dobili TIC-ovi (Slika 1). Podaci su obrađeni s Thermo Xcaliburom i uspoređeni s bibliotekama komponenti i literaturom, identificirajući ukupno 44 flavonoida (Tablica 1).
2.2 Mrežna farmakologija
Identificirani sastojci uvezeni su u bazu podataka TCMSP 2.3 (http://tcmspw.com/tcmsp.php). Na temelju oralne bioraspoloživosti (OB) veće ili jednako 30,00% i sličnosti lijeku (DL) veće ili jednako 0,18, pregledano je 19 aktivnih komponenti. Predviđeni ciljevi aktivnih komponenti i ciljevi bolesti za kronični prostatitis su presječeni, dajući 88 zajedničkih ciljeva. Za konstrukciju PPI mreže korišten je STRING 11.0 (http://string-db.org). Temeljni ciljevi rangirani po stupnju uključivali su AKT1, TNF, VEGFA, EGFR, SRC, ESR1, PTGS2, MMP9, BCL2L1 i MMP2. GO i KEGG obogaćivanje (DAVID 6.8, http://david.ncifcrf.gov) pokazalo je biološke procese kao što je pozitivna regulacija protein kinaze B, negativna regulacija apoptoze i pozitivna regulacija aktivnosti MAPK; stanične komponente uključujući izvanstaničnu regiju, makromolekularne komplekse i receptorske komplekse; molekularne funkcije uključujući aktivnosti tirozin kinaze, serin kinaze i treonin kinaze. KEGG putevi obogaćeni su putevima kod raka, PI3K–AKT signalizacije, raka prostate i otpornosti na inhibitore EGFR tirozin kinaze. Cytoscape 3.7.1 korišten je za konstrukciju mreže "aktivna komponenta–jezgra meta–put" (Slika 2). Prvih 10 komponenti po stupnju bili su likviritgenin, spinacetin (reprezentativni flavon), izoviteksin, krizoeriol, santin, kemferol, šaftozid, luteolin, ononin i formononetin.
Molekularno spajanje provedeno je u paru između 10 osnovnih komponenti i ključnih ciljeva iz PPI analize. Molekularne strukture jezgrenih komponenti preuzete su iz TCMSP 2.3 (mol2 format), a 3D strukture ključnih meta dobivene su iz PDB (http://www.rscb.org/) u pdb formatu. Autodock je korišten za spajanje svakog para ligand-protein. Energije vezanja < −20,92 kJ·mol−1 ukazuju na povoljno vezanje; što je niža energija, to je bolji afinitet. Parovi cilj-ligand s najboljim rezultatom navedeni su u tablici 2. Reprezentativni docking kompleksi s pet ciljeva vizualizirani su u PyMolu (slika 3).
2.3 Validacija in vivo
Štakorski model kroničnog prostatitisa uspostavljen je korištenjem karagenana. Bojanje HE otkrilo je histopatološke lezije karakteristične za kronični prostatitis u modelnim životinjama, dok je tretman alkoholnim ekstraktom nadzemnih dijelova Cistanche poboljšao arhitekturu žlijezda i smanjio upalnu infiltraciju. ELISA je pokazala da su, u usporedbi s modelnom skupinom, terapijske skupine pokazale regulaciju serumskog DHT-a, IFN-a, IgG-a, IL-6, PSA i TNF-a prema normalnim razinama, što ukazuje na terapijsku učinkovitost.
Rasprava
Sveobuhvatna analiza koja uključuje profiliranje visoke razlučivosti temeljeno na MS-u, mrežnu farmakologiju, molekularno spajanje i validaciju na životinjama potvrđuje da flavonoidi iz nadzemnih dijelova Cistanche imaju učinke protiv kroničnog prostatitisa. Pretpostavljeni mehanizmi uključuju modulaciju PI3K–AKT i srodne putove povezane s upalom i proliferacijom i ključne ciljeve kao što su EGFR, AKT1 i MMP9. Rezultati daju znanstvenu osnovu za razvoj i kliničku primjenu nadzemnih flavonoidnih pripravaka iz Cistanche u liječenju kroničnog prostatitisa.
Zaključak
Flavonoidi iz nadzemnih dijelova Cistanche pokazuju terapeutski potencijal protiv kroničnog prostatitisa, vjerojatno putem regulacije puta PI3K–AKT i interakcije s EGFR, AKT1 i MMP9. Integracija kemijskog profiliranja, mrežne farmakologije, molekularnog spajanja i pokusa na životinjama potvrđuje njihovu učinkovitost i razjašnjava prihvatljive mehanizme.
