Studija kemijskih profila i metabolita sirove i prerađene Cistanche Deserticola u štakora, UPLC-Q-TOF-MSE

email za kontakttina.xiang@wecistanche.comza više informacija

Sažetak

Pozadina: Prerada kineske materije medice istaknuta je i jedinstvena farmaceutska tehnika u tradicionalnoj kineskoj medicini (TCM) koja se koristi za smanjenje nuspojava i povećanje ili čak promjenu terapeutske učinkovitosti sirovog bilja. Promjene esencijalnih komponenti izazvane optimiziranim postupkom obrade prvenstveno su odgovorne za povećanu učinkovitost ljekovitog bilja. Bubrezi-yang okrepljujući učinak rižinog vina kuhanog na pariCistanche deserticola(C.deserticola) bila je jača od sirove C.deserticola (CD).

Metode: Analiza usporedbe provedena je pomoću UPLC-Q-TOF-MS' s ​​UNIFl informatičkom platformom kako bi se odredio utjecaj obrade. Provedene su in vitro studije za karakterizaciju sastojaka kao imetabolitiin vivo. Kemijske komponente određene su u CD-u i njegovim prerađenim proizvodima. Provedene su multivarijatne statističke analize kako bi se procijenile varijacije među njima, dok je OPLS-DA korišten za usporedbu parova.

Rezultati: Rezultati ove studije otkrili su značajne varijacije u feniletanoidnim glikozidima (PhG) iiridoidinakon obrade. U ekstraktima CD-a i njegovim prerađenim produktima otkriveno je ukupno 97 spojeva. PhG-ovi koji imaju 4-O-kafeoilnu skupinu u 8-O- -D-glukopiranozilnom dijelu, poput akteozida, cistanozida C, kampneozida Il, osmantusida smanjili su se nakon obrade, dok su PhG-ovi sa 6' -O-kafeoilna skupina u 8-O- -D-glukopiranozilnom dijelu, kao što su izoacetozid, izocistanozid C, izokampneozid I, izomartinozid, povećana je, posebno u CD-NP skupini. Povećao se i intenzitet ehinakozida i cistanozida B čija struktura posjeduje 6'-O- -D-glukopiranozilni dio. U in vivo studiji, 10 prototipnih komponenti i 44 metabolita otkriveno je u plazmi štakora, izmetu i urinu. Dobiveni rezultati otkrili su da obrada dovodi do značajnih varijacija u kemijskim sastojcima CD-a i utječe na dispoziciju spojeva in vivo, a faza Ⅱ metabolički procesi su ključne kaskade svakog spoja, a većina metabolita povezana je s ehinakozidom ili akteozid.

Zaključci: Ovo je prvo globalno usporedno istraživanje sirovog i obrađenog CD-a. Ovi nalazi doprinose našem razumijevanju utjecaja obrade CD-a i daju važne podatke za buduća ispitivanja učinkovitosti.

Ključne riječi: Cistanche deserticola, Obrada, UPLC-Q-TOF-MS5, Kemijski profili, Metaboliti in vivo

Uvod

Kineska materia medica (CMM) obrada pokazala je značajnu primjenjivost u kliničkoj praksi tradicionalne kineske medicine (TCM) i smatra se održivim tretmanom nekoliko stoljeća. Ovo je jedinstvena farmaceutska tehnologija koja je izvedena iz teorije TCM-a. Nakon obrade, identificirane su značajne razlike u izgledu, kemijskim sastojcima, karakteristikama i medicinskom značaju svih vrsta TCM-a, što je dovelo do pretpostavke da bi obrada mogla poboljšati učinkovitost ili smanjiti toksične učinke TCM-a.

Stotinama godina,Cistanche deserticola(Rou Cong Rong na kineskom, CD) obično se koristi u TKM kliničkoj praksi za nadopunjavanje funkcija bubrega. Također pomaže u vlaženju crijeva što dovodi do opuštanja crijeva [1].Cistancheje prvi put zabilježen u ShenNongBencaoJingu. Obično se nalazi u sušnim i polusušnim staništima diljem Euroazije i Sjeverne Afrike, uključujući Iran, Kinu, Indiju i Mongoliju [2]. Obrada CD-a provedena je kuhanjem na pari s rižinim vinom pod normalnim tlakom, što je metoda pripreme dokumentirana u kineskoj farmakopeji (Jiucongrong na kineskom, u daljnjem tekstu "CD-NP"). A kuhanje CD-a na pari s rižinim vinom pod visokim tlakom je učinkovitija metoda pripreme (u daljnjem tekstu "CD-HP") [3, 4]. Nekoliko je studija pokazalo da se farmakološki učinci CD-a razlikuju od njegovih prerađenih proizvoda [5]. CD može tonizirati bubrežni yang i opustiti crijeva, dok bi nakon kuhanja rižinim vinom učinak obnavljanja bubrežnog yanga bio pojačan. U našoj ranijoj studiji, utvrđeno je da CD-NP može poboljšati toniziranje bubrega i podržati yang, te ublažiti učinak vlaženja crijeva i defekacije [6-8]. U kliničkoj praksi prerađeni proizvodi su najčešće korišteni oblik.

Do danas je nekoliko studija analiziralo kemijske komponente CD-a, nakon čega je uslijedila izolacija i identifikacija više od 100 spojeva [9-11], kao što su feniletanol glikozidi (PhGs),iridoidi, lignani i oligosaharidi kao njegovi glavni kemijski sastojci. Također je objavljeno da postoje mnoge farmakološke aktivnosti PhG-a uključujući imunomodulatorne, neuroprotektivne, hepatoprotektivne, protuupalne, antioksidativne, itd.[12-14]. Iridoidi posjeduju protuupalno djelovanje [15, 16]. Ranije studije također su otkrile da su neke kemijske komponente pokazivale varijacije tijekom obrade [17-20]. Na temelju ovih izvješća, može se pretpostaviti da naknadna obrada, varijacije u kemijskom sastavu dovode do različitih farmakoloških učinaka, koje je potrebno dodatno istražiti.

U trenutnoj studiji, osjetljiva i učinkovita metoda, tj. tekućinska kromatografija ultravisoke učinkovitosti u kombinaciji s TOF-MSE (UPLC-Q-TOF-MSE) provedena je za komparativnu analizu, a in vitro studije provedene su za kvalitativno analiziranje ekstrakata CD-a, CD-NP-a i CD-HP-a za razjašnjavanje njihovih kemijskih profila. Općenito, egzogene kemikalije s visokom izloženošću u ciljnim organima smatrane su učinkovitim komponentama. Stoga su štakorima CD i njegovi prerađeni proizvodi davani oralno, nakon čega je slijedila njihova karakterizacija. Postojeća studija po prvi put otkriva komparativnu studiju (i in vitro i in vivo) sirovog i prerađenog CD-a. Dobiveni rezultati proširili bi naše razumijevanje o učinku obrade CD-a, što bi moglo biti od pomoći za daljnja istraživanja.

Materijali i metode

Materijali

Standardne spojeve ajugola (180120) i 2'-acetil-acetozida (M0601AS) osigurao je Chendu Pure Chem-Standard Co., Ltd (Chengdu, Kina). Cistanozid F(MUST-17022620), ehinakozid (D1105AS), cistano-strana A(M0906AS) i izoakteozid (M0106AS) osigurala je kompanija Must (Sichuan Kina); akteozid (O0618AS), salidrozid (J0526AS), katalpol (S0728AS), genipozid (A0407AS) i genipozidna kiselina (MB6001-S) nabavljeni su od Dalian Meilun Bio.Co., Ltd (Dalian, Kina).8-epide oksiloganska kiselina (B31123) je dobiven od Shanghai Yuanye Biological Technology Co., Ltd, Kina. Metanol i acetonitril bili su MS-grade i nabavljeni od Merck KGaA, Darmstadt, Njemačka. Metansku kiselinu (CH, O,) HPLCgrade je osigurao Merck KGaA (Darmstadt, Njemačka). Voda korištena u postojećoj studiji obrađena je putem Milli-Q sustava (18,2 MQ, Millipore, Ma, SAD). Rižino vino osigurao je Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, Kina).

Cistanch deserticola je prikupljen od Neimenggu wangyedi cistanche Co.Ltd. Uzorke je identificirao prof. Yanjun Zhai (farmaceutska škola, Sveučilište Liaoning TCM). Uzorci su predani Sveučilištu tradicionalne kineske medicine Liaoning.

Životinje

Muške štakore Sprague–Dawley (SPF stupanj) s 180-220 g ukupne tjelesne težine osigurao je Liaoning Changsheng biotechnology Co. Ltd. (Centar za laboratorijske životinjske resurse provincije Liaoning, broj licence: SCXK-2015-0001). Ovi su štakori bili smješteni u prostoriji za uzgoj s dobro održavanom temperaturom i vlagom, tj. 20-26 stupnjeva, 50-70 posto tijekom jednog tjedna. Prije pokusa štakori su hranjeni uobičajenom laboratorijskom hranom i vodom. Životinje su gladovale preko noći, međutim, voda im je davana ad libitum prije pokusa. Štakori su pogubljeni anestetikom od 10 posto kloralhidrata. Institucionalni odbor za etiku životinja pokrajinske bolnice kineske medicine Liaoning odobrio je sve eksperimentalne protokole (2019.3.25, 2019015).

Priprema CD-a, CD-NP i CD-HP ekstrakta

CD-NP, CD-HP obrađeni su iz iste serije Cistanch deserticola. Da bi se pripremio CD-NP, suhi komadići CD-a (5 mm debljine, 100 g) su navlaženi rižinim vinom (30 mL) i kuhani na pari na 100 stupnjeva 16 sati, nakon čega je uslijedilo sušenje na 55 stupnjeva u pećnici za sušenje. Dok je CD-HP pripremljen infiltracijom suhih komada CD-a (5 mm debljine, 100 g) s rižinim vinom (30 mL), nakon čega je uslijedilo kuhanje na pari na 1,25 atmosferskog tlaka tijekom 4 sata. a zatim suši u sušionici na 55 stupnjeva.

U mjernu tikvicu od 100 ml, jedan gram praha je prosijan kroz sito #4, nakon čega je dodano 50 posto metanola (50 mL), a zatim je čvrsto pokriven i promiješan. Ova smjesa je izvagana, a zatim pola sata. maceracija. Nakon maceracije, smjesa je ultrazvukom (snaga 250 W, frekvencija 35 kHz) 40 min, zatim ohlađena i ponovno vagana. Gubitak težine je nadopunjen 50 postotnim metanolom, pravilno promiješanim i ostavljenim da odstoji, nakon čega je uslijedilo filtriranje supernatanta i zatim korištenje dobivenog filtrata kao testne otopine.

MSE analiza aktivnih komponenti

Priprema standardnih supstanci: tubulozid-A (3.02 mg), ehinakozid (3.00 mg), 2'-acetilakteozid (2,34 mg), akteozid (2,45 mg), izoakteozid (0,61 mg), cistanozid-F (2,14 mg), salidrozid (3,39 mg), genipozid (2,84 mg), ajugol (1,58 mg), katalpol (2,39 mg), genipozidna kiselina (2,56 mg) i 8-epideoksiloganic kiseline (2,34 mg) dodani su u volumetrijsku posudu od 10 mL, dodan metanol konstantnog volumena na skali, konfiguriran u odgovarajuću koncentracijsku referentnu otopinu. Svaki od 100 μL je konfiguriran u miješanu referentnu otopinu.

Uvjeti MS analize: Vrijednost mase je korigirana prije eksperimenta, a korišten je način negativnih iona. Raspon mase bio je 50–1200 Da, a uzorak je ubrizgan kroz pumpu za ubrizgavanje protoka. Brzina konusa bila je 100 L/h, brzina protoka otapala je postavljena na 800 L/h. Kapilarni i konusni napon su fiksirani na 2500 i 40 V, u skladu s tim. Temperatura izvora iona i plina za otapanje bila je 100 stupnjeva odnosno 400 stupnjeva, a frekvencija prikupljanja signala bila je 0,5 S−1.

UPLC-Q-TOF-MS analiza CD ekstrakta (15-16 min), 65 posto do 55 posto A (16-18 min). Brzina protoka bila je 0.3 mL min−1, dok je temperatura prostorije za automatsko uzorkovanje i kolone bila 30 stupnjeva i 8 stupnjeva zasebno. Volumen injekcije bio je 1,0 μL.

Procjena masene spektrometrije provedena je pomoću Waters XEVO G{{0}}XS QTOF MS (Waters Corporation, Milford, MA, SAD), uključujući ESI izvor. Brzina protoka plinovitog dušika bila je fiksirana na 800 L·h-1 s temperaturom od 400 stupnjeva, temperatura izvora je bila fiksirana na 100 stupnjeva, a konusni plin je postavljen na 50 L h-1. Napon konusa i kapilare podešen je na 40 i 2000 V, u skladu s tim. Energija sudara rampe korištena je u rasponu od 20-30 V. Centroidizirani podaci svih uzoraka dobiveni su od 50 do 1200 Da, s 5-vremenom skeniranja od 0,5 s tijekom vremena analize od 10 min . LockSpray TM korišten je za provjeru točnosti mase. Te [M–H]− ion leucin enkefalina (200 pg·μL−1 brzina protoka infuzije 10 μL min−1) pri m/z 554,2615 korišten je kao masa za zaključavanje. Softver MassLynx V4.1 (Waters Co., Milford, SAD) korišten je za točnu masu, sastav prekursora iona i izračun fragmenata iona.

Analiza podataka u Masslynx platformi

Nadalje, unutarnja knjižnica koja sadrži naziv spoja, njegovu strukturu i molekularnu formulu (u mol.) postavljena je na temelju literature. Svi spojevi su zabilježeni u posebnom predlošku, izrađenom u Excelu. Osim toga, mol datoteke (Chemdraw Ultra 8.0, Cam-bridge soft, SAD) i Excel datoteke svih pojedinačnih struktura spojeva također su spremljene na lokalno računalo. Uspostavljeni Excel list s važnim podacima izravno je uvezen u znanstvenu knjižnicu u UNIFI

UNIFI 1.8.2, Waters, Manchester, UK korišten je za procjenu strukturnih karakteristika, posebno za karakteristične fragmente i MS fragmentaciju. Minimalna površina vrha od 500 postavljena je za detekciju 2D vrha. Tijekom otkrivanja 3D vršnih vrijednosti, odabran je niski energetski vršni intenzitet od više od 300 odbrojavanja i povišeni energetski vršni intenzitet od više od 80 odbrojavanja. Utvrđeno je da je pogreška mase do ±10 ppm za poznate spojeve, a tolerancija vremena zadržavanja postavljena je u rasponu od ±0,1 min. Odabrali smo negativne adukte koji sadrže -H, plus HCOOH. Obrada neobrađenih podataka dobivenih od MS-a provedena je putem pojednostavljenog softvera UNIFI kako bi se brzo odredile kemijske komponente koje zadovoljavaju standarde pomoću baze podataka koju su sami izradili i interne knjižnice tradicionalne medicine.

Dalje, kako bi se potvrdila kemijska struktura svakog ciljnog spoja, izomeri su razlučeni po svojim karakterističnim obrascima MS fragmentacije koji su otkriveni u prijavljenim studijama i usporedbom vremena zadržavanja referentnih standarda.

Metabolomska analiza temeljena na multivarijantnoj statističkoj analizi

Prije obrade neobrađenih podataka postavljeni su parametri, kao što je masa u rasponu od 150 do 1200 Da, raspon vremena zadržavanja (0 do 20 min), intenzitet praga ( 2000 brojanja), tolerancija mase tj. 5 MDA, dok je prozor mase i vremena zadržavanja bio 0,20 min odnosno 0,05 Da. U sljedećem popisu baze podataka, identifikator iona bio je par RT-m/ s obzirom na njihovo vrijeme eluiranja. Iste vrijednosti za RT i m/z u različitim serijama uzoraka smatrane su istim spojem.

Provedena je multivarijatna statistička analiza kako bi se ocijenili učinkoviti biomarkeri koji su znatno pridonijeli varijacijama među različitim skupinama. Tijekom analize korištena je analiza glavnih komponenti (PCA) kako bi se ukazalo na maksimalne razlike i prepoznavanje uzoraka za dobivanje pregleda i klasifikacije. OPLS-DA je alat za modeliranje koji pruža vizualizaciju učitavanja prediktivne komponente OPLS-DA za pomoć pri evaluaciji modela. Varijabla važnosti za projekciju (VIP) korištena je za procjenu evaluacije različitih komponenti, ametabolitiwith VIP values>1.0 i P-vrijednost<0.05 were="" regarded="" as="" effective="" markers.="" furthermore,="" a="" permutation="" test="" was="" conducted="" for="" providing="" reference="" distributions="" for="" the="" r²/o²values="" that="" could="" show="" the="" statistical="">

Pokusi na životinjama štakori su nasumično kategorizirani u četiri skupine (n=6 za svaku skupinu), nakon čega je uslijedila oralna primjena različitih ekstrakata: (1) Slijepa kontrolna skupina: štakorima je dana normalna fiziološka otopina (2 mL/100 g) ; (2) CD skupina: štakori su dobili CD ekstrakt (2 mL/100 g); (3) CD-NP skupina: štakori su dobili CD-NP ekstrakt (2 mL/100 g); (4) CD-HP skupina: štakori su dobili CD-HP ekstrakt (2 mL/100 g). Daljnja kategorizacija svih skupina provedena je u tri podskupine za plazmu, urin i feces, prema tome. Dva sata kasnije, svakom štakoru je oralno primijenjena ista i jednaka količina ekstrakata.

Nakon primjene, prikupljanje uzoraka krvi obavljeno je nakon 1.0 h, 2.0 h i 4.0 h u hepariniziranim polietilenskim epruvetama od 1,5 mL (iz orbitalnih vena) , nakon čega slijedi centrifugiranje (pri 4500 okretaja u minuti) svih uzoraka tijekom 15 minuta.

Za uzorke urina i fecesa, štakori su držani u kavezima za metabolizam, a zatim je provedeno prikupljanje uzoraka urina i fecesa 24 sata nakon primjene. Centrifugiranje uzoraka urina obavljeno je na 4500 okretaja u minuti tijekom 15 minuta, dok su uzorci izmeta sušeni u hladu, mljeveni u prah, zatim je uzeto 0,2 g i dodano u 0,5 mL fiziološke otopine. otopine, ultrazvuk 5 minuta i centrifugiranje na 12,000 okretaja u minuti 15 minuta. Svi biouzorci držani su na -80 stupnjeva do analize.

Priprema bioloških uzoraka. Dodavanje uzoraka plazme, urina i fecesa provedeno je s 3 volumena metanola, nakon čega je uslijedilo vrtloženje tijekom 3 minute. Zatim je provedeno centrifugiranje (na 12,000 okretaja u minuti) smjesa tijekom 10 minuta, nakon čega je uslijedio prijenos supernatanta u EP epruvetu, a zatim osušena dušikom na 37 stupnjeva. Nadalje, provedeno je dodavanje 200 μL otopine HCN–H2O (50 posto). Deseto, vorteks je korišten za miješanje (1 min), nakon čega je uslijedilo centrifugiranje (pri 12,000 okretaja u minuti) tijekom 5 minuta. Supernatant (5 μL) tretiranih uzoraka ubrizgan je u sustav UPLC-Q-TOF-MSE.

Uvjeti tekućinske kromatografije i masene spektrometrije Analiza zametabolititakođer je izveden instrumentom Waters UPLC preko ESI sučelja. Odvajanja su provedena korištenjem stupca Acquity UPLC HSS T3 (100 mm×2,1 mm, 1,8 µm), mobilna faza bila je 0,1 posto mravlja kiselina (A): acetonitril (B), uvjet eluacije gradijenta bio je 0-3 min (99,8 posto →98 posto A).3-5 min (98 posto →95 posto A),5-8 min (95 posto →90 posto A), { {18}} min (90 posto →85 posto A),12-17 min (85 posto →70 posto A), 17-22 min (70 posto →60 posto A), 22-23 min (60 posto →58 posto A), 23-25 min (58 posto A),25-32 min (58 posto →45 posto A) i 32-37 min (45 posto →35 posto A ),0,4 mL min-1 bila je brzina protoka. Temperatura za kolonu i prostoriju za uzorke postavljena je na 40 stupnjeva odnosno 8 stupnjeva. Korišteni su gore navedeni uvjeti masene spektrometrije.

Strategija za sustavnu analizu metabolita u bio-uzorcima Za obradu podataka korišten je softver UNIFI (1.8.2). Za identifikaciju učinkovitih metabolita korištena je funkcija Binary Compare. Ocijenjeni metaboliti nisu postojali u ekvivalentnom kontrolnom uzorku ili su postojali pri niskom intenzitetu iona. Prag relativnog intenziteta postavljen je na 3 ili 5, a metaboliti koji su ispunili podcrtane kriterije mogli su se ocijeniti. Uobičajeni i predvidljivi metaboliti zatim su određeni EIC-om. Za traženje dvofaznih metabolita primijenjena je NLF funkcija. Na primjer, u softveru UNIFI, parametri se mogu postaviti na 176.0321 za traženje mogućih konjugata glukuronske kiseline. Nakon obrade, neutralni gubitak se može postaviti u metodi ili identificirati. MassFragment je korišten za određivanje ili karakterizaciju detektiranih struktura metabolita, UNIFI-jeva funkcija spektralne interpretacije glavna je funkcija koja se koristi za analizu sekundarne fragmentacije roditeljskih komponenti. Ova se funkcija može koristiti za brzu provjeru je li putanja fragmentacije razumna.

Rezultati

Pravilo fragmentacije mase feniletanoidnih glikozida i iridoida

Feniletanoidni glikozidi glavni su kemijski sastojci CD-a. Standardne otopine izoakteozida,

uzeti su cistanozid F, tubulozid A, ehinakozid, akteozid i 2'-acetil-akteozid, nakon čega je osigurana drugačija razina energija sudara (tablica 1), a zatim su dobivene odgovarajuće MS2 mape (sl. 1).

Masena spektrometrijska analiza otkrila je da feniletanoidni glikozidi imaju slične uzorke fragmentacije masenog spektra, putevi cijepanja u načinu negativnih iona uglavnom uključuju (1) cijepanje esterske veze: gubitak neutralne kafeoilne skupine (C, H, O162.03) i neutralne acetilne skupine skupina (C, H, O, 42.00); (2) Glikozidno cijepanje: gubitak neutralnih ostataka ramnoze (C.HIO, 146,05) i neutralnog ostatka glukoze (CgHO, 162,05). Iz masene spektrometrije visoke rezolucije mogu se razlikovati kafeoil (162.03) i glukozni ostatak (162.05).

Uzete su standardne otopine iridoida ajugola, katalpola, genipozidne kiseline, genipozida i 8-epide oksiloganske kiseline, nakon čega su pribavljene različite energije sudara i dobivene su odgovarajuće MS'mape (slika 2).

Iridoidni glikozidi imaju slične uzorke fragmentacije masenog spektra, putevi cijepanja u načinu negativnih iona uglavnom uključuju (1) Glikozidno cijepanje: Gubitak neutralnog ostatka glukoze (CHoO, 162,05); (2) Gubitak neutralnog CO, (43,99) i H , O(18.01).

Identifikacija spojeva u CD, CD-NP i CD-HP ekstraktima

UPLC-QTOF-MSE analiza

Provedena je optimizacija kromatografskih uvjeta. Zatim su spojevi CistancheHerba procijenjeni iu modovima negativnih i pozitivnih iona s visokim i niskim CE. Dobiveni rezultati otkrili su da je kompatibilnost negativnog načina bila veća u odnosu na pozitivni način za ove spojeve. Slika 3 prikazuje kromatogram MS osnovnog vrha iona (BPI) praćen numeriranim vrhovima. Intenzitet svakog detektiranog iona u analizi UPLC-Q-TOF-MS normaliziran je s obzirom na cijeli broj iona za generiranje matrice podataka koja se sastoji od m/z vrijednosti, normalizirane površine vrha i vremena zadržavanja.

Ocjenjivanje komponenti s CD-a i njegovih prerađevina na platformi UNIFl

Ukupno 97 spojeva identificirano je s -SEM (n=6) načinom iz CD-a i njegovog prerađenog proizvoda (Tablica 2), uključujući feniletanoidne glikozide (PhG), iridoide, lignane i oligosaharide. Komponente 95, 91 i 94 otkrivene su u CD, CD-NP i CD-HP prema tome. Među njima su 64 feniletanoida, 13 iridoida, a utvrđeno je još 20 drugih vrsta spojeva. Postojala je sličnost u kemijskom sastavu CD-a i njegovog prerađenog proizvoda, međutim, utvrđeno je da se količina komponenti razlikuje između CD-a i njegovog prerađenog proizvoda.

Varijacije u kemijskim komponentama prerađenih proizvoda Softver Simca-P 13.0 korišten je za analizu multivarijantne matrice podataka. Prije PCA, sve su varijable bile srednje centrirane i Pareto skalirane, nakon čega je slijedila identifikacija potencijalnih diskriminantnih varijabli. U dijagramu PCA rezultata, svaka točka je pokazala pojedinačni uzorak. Uzorci koji su pokazali sličnost u svojim kemijskim komponentama bili su raštrkani jedan uz drugi, dok su oni koji su pokazali varijacije u svojim komponentama podijeljeni. Kao što se vidi na PCA (slika 4), skupina CD-HP je odvojena od skupina CD i CD-NP.

To distinguish CD from CD-HP and CD-NP, OPLS-DA, permutation test, S-plot, and VIP value were developed. (Figs.5, 6,7)The obtained results revealed that many components were key characteristic components of each product. The screening condition was the VIP>1 i P<0.05. from="" the="" date="" of="" the="" s-plot,="" the="" characteristic="" components="" were="" evaluated,="" which="" were="" commonly="" existing="" in="" the="" three="">

Na slici 8 pronašli smo intenzitet akteozida (54), cistanozida C (74), kampneozida I (43), osmantusida (75) i 2'-aktilakteozida (80) koji imaju 4'-O-kafeoilnu skupinu u 8-O- -D-glukopiranozilni dio (vidi sliku 9) smanjio se nakon obrade rižinim vinom, dok je intenzitet izoacetozida (60) kastanozid (71), izo-kampneozid I (69), izomartinozid (86) koji ima 6'-O-kafeoilnu skupinu (vidi sliku 9) povećan, posebno za CD-NP skupinu. Iako tubulozid B (72) ima 6'-O-kafeoilnu skupinu, isto kao i izoakteozid, intenzitet se smanjio zbog njegove 2'-acetilne skupine. Intenzitet ehinakozida (38) i cistanozida B koji imaju 6'-O- -D-glukopiranozilne skupine porastao je, ali se intenzitet tubulozida A (55) smanjio također zbog njegove 2'-acetilne skupine.

Naš istraživački tim također je proučavao termičku stabilnost akteozida i izoakteozida i otkrio da je akteozid nestabilan u vodi, metanolu i otopini vina od žute riže i da se djelomično može pretvoriti u izoakteozid u uvjetima zagrijavanja. Ali termostabilnost izoakteozida bila je bolja, posebno u otopini žutog rižinog vina. Slika 10 prikazuje moguće promjene PhG-ova u CD-u tijekom obrade:

Identifikacija metabolita u štakora Iz podataka masene spektrometrije visoke rezolucije analizirana je i uspoređena točna molekularna težina i elementarni sastav za metabolite i spojeve proto molekula. Kako su iste vrste spojeva u TCM-u pokazale sličnost u metaboličkim modifikacijama, korelacije fitokemijskih sastojaka in vitro mogu se proširiti na njihove metabolite in vivo. U međuvremenu, na temelju konvencionalnih puteva biotransformacije, izveden je zaključak o razumnoj promjeni molekularne težine. Konačno, metaboliti su identificirani analizom MSE spektra mase metabolita i putanje fragmentacije proto-spojeva u spektru mase [21, 22]. U usporedbi sa slijepim uzorkom, njegove komponente identificirane su in vivo na temelju informacija dobivenih kromatogramom spektra mase, mogućnosti metaboličke reakcije, karakteristika strukture spoja i pravila fragmentacije njegovog spektra mase. Pogledajte tablicu 3.

Identifikacija metabolita povezanih s feniletanol glikozidima

Za obradu je korištena UNIFI platforma. Slika 11 prikazuje TIC kromatografiju urina, fecesa i plazme za CD i njegove prerađene proizvode. U usporedbi sa slijepim uzorcima, u štakora su identificirana ukupno 54 metabolita, uključujući 10 prototipnih komponenti i 44 metabolita, od kojih je 24, 49 i 6 bilo u izmetu, urinu i plazmi, prema tome.

Na temelju točne mase, kaskade fragmentacije i predvidljivih neutralnih gubitaka biotransformacijom, provizorno je procijenjeno ukupno 35 metabolita povezanih s feniletanoidnim glikozidima. Povezani metaboliti feniletanoidnih glikozida imaju slične obrasce fragmentacije spektra mase, poput tipičnog dekafeoilnog fragmenta m/z 461.1605, zatim se dalje hidroliziraju glikozidnim i esterskim vezama in vivo i metaboliziraju u hidroksitirozol (HT)(m/ z153,0504, C.HO.4,73 min) i kavenu kiselinu (CA) (m/z179,0389, CH, 0,77 min), vidi sliku 12A.

M11 označen [MH]~ na m/ 153,0504 s formulom ie, C.HO, i identificiran kao HT. M16 predstavlja [MH]- na m/z 329,0851, što je bilo 176 Da povišeno u odnosu na HT, otkrivajući da bi mogao biti glukuronidirani metabolit HT. [MH]- za M26 bio je na m/z 343,1037,14 Da viši od onog za HT-glukuronid. Stoga je M26 identificiran kao HT-metilirani glukuronid. M17 je identificiran kao HT-sulfat na temelju njegovog [MH]-na m/z 233,0112,80 Da u odnosu na HT, koji se mogao dalje metilirati, a zatim je proizveo M22, koji je pokazao m/z 247,0278, što ukazuje da je HT- metilirani sulfatirani metabolit. M7 (m/167,0335) i M5 (m/z 167,0762) smatrani su oksidacijskim produktima, odnosno metiliranim HT (Slika 12B).

M1 je pokazao [MH]- na m/z 179,0389, razjašnjena molekularna formula bila je CH-O i identificirana kao kafeinska kiselina (CA). M25 je otkrio [MH]- na m/355,0704, koji je bio 176 Da povišen od onog CA, pokazuje da bi mogao biti glukuronidirani metabolit CA. M27 je imao m/z 258,994, što je bilo 80 Da više od one za CA, pa smo ga razjasnili kao CA sulfat, i mogao je proizvesti M35 (m/z 273,0064). Kako M4 daje [MH]7 na m/z 193,0524,14 Da više od CA, identificiran je kao CA metilirani metabolit. M39 je bio metabolit dehidroksilacije CA, s m/z 163,04, i mogao se sulfatirati u M32 (m/z 242,9951).

M33(m/z 181.0491, C.HO,9,06 min) bio je produkt redukcije CA, to jest 3,4-dihidroksi-benzenpropionske kiseline, koja se može metilirati u M19 (m /z 195,0623, C10H1204, 0,93 min). M33 bi se mogao dehidrirati u M43, to jest 3-HPP (m/z 165,0558, C9H10O3, 11,29 min), i M31 (m/z 341,0942, C15H17O9, 8,90 min) i M29 (m/z 245,0125, C9H10O6S, 8,52 min) bili su glukuronidirani i sulfatirani produkti (slika 12C).

Za metabolite povezane s feniletanoidnim glikozidima, ključne metaboličke kaskade bile su metaboličke reakcije faze II, tj. glukuronidacija, metilacija i sulfatacija. Predložene metaboličke kaskade feniletanoida prikazane su na slici 13.

Identifikacija metabolita povezanih s iridoidima

Analizom elementarnog sastava metabolita, fragmentacije MSE i povezane literature, provizorno je procijenjeno ukupno 19 metabolita povezanih s iridoidom. Iridoidni glikozidi su hidrolizirani glikozidnim vezama da bi se formirali odgovarajući aglikoni. M/z 185,117 bio je za M8, 162 Da manji od ajugola, koji je dobiven gubitkom ostatka glukoze.

M40 (m/z 199,0641, Rt 10,91 min) bio je deglikozilirani produkt katalpola. M45 m/z 169,0487, Rt 12,15 min) bio je manji od 30 Da od deglikoziliranog metabolita katalpola i identificiran je kao uklanjanje molekule metabolita CH, O. M34 (m/z 151,0352, Rt 9,08 min), bio je daljnji gubitak H, O metabolita.

M44 (m/z 211,0665, Rt 11,31 min) bio je deglikozilirani metabolit genipozida, a M37 (m/z 197,0833, Rt 15,03 min) bio je deglikozilacija 8-epideoksiloganske kiseline. Metaboličke reakcije za iridoide mogu se otkriti kao faza I metabolizma deglikozilacije (Slika 12D).

Usporedba metaboličkog profila u plazmi, urinu i fecesu između CD-a i njegovih prerađenih proizvoda

Uspoređena su 2 prototipa u plazmi, 7 u urinu i 3 u fecesu. Bilo je 7 prototipova apsorbiranih u CD, 7 prototipova apsorbiranih u CD-NP i 8 prototipova u CD-HP. M21 je detektiran samo u grupi CD-NP u fecesu, a M38 i M51 su detektirani samo u grupama urina CD-HP. U usporedbi s metabolitima, identični metaboliti u plazmi, urinu i fecesu bili su 4, 42, odnosno 21. U skupini koja je primala CD bila su apsorbirana 34 metabolita, 39 u skupini koja je primala CD-NP, a 40 u skupini koja je primala CD-HP. M5, M7, M40 i M52 otkriveni su samo u CD-NP skupinama, dok su M24, M4l i M48 samo otkriveni u CD-HP skupinama.

Uočene su varijacije u apsorpciji, kao iu metabolizmu aktivnih spojeva u različitim prerađenim produktima CD-a. Sa slike 14, otkrili smo da je intenzitet konjugacije HT-sulfata (M17) bio najveći u urinu, a zatim slijedi 3-HPP konjugacija sulfata (M29), metilirana HT konjugacija sulfata (M22), dehidroksilirani CA sulfat konjugacija (M32) i 3,4-dihidroksi benzen propionska kiselina sulfatna konjugacija (M19). Sadržaj metaboličkih produkata u prerađenoj skupini bio je veći nego u CD skupini, posebice za M22, M29, M27, M16, M19, M1, M2. Njihov prekursor 6'-O-kafeoilna skupina u 8-O- -D-glukopiranozilnom dijelu, spojevi, poput hidroksitirozola, imaju antitumorska, protuupalna, antibakterijska, antivirusna i antifungalna svojstva [ 23]. Kafeinska kiselina ima protuupalno, antikancerogeno i antivirusno djelovanje [24]. Bio je u skladu s kliničkom uporabom CD-a i njegovih prerađenih proizvoda.

Rasprava

CD je TCM, a njegove glavne bioaktivne komponente, uključujući PhG, iridoide, polisaharide, dokumentirane su raznim istraživačkim studijama. U kliničkoj praksi TCM-a, prerađeni proizvodi CD-a naširoko su korišteni u odnosu na sirove. Kemijski sastav će se promijeniti tijekom obrade, što može dovesti do promjena u ljekovitim učincima (slika 14).

PhG su vrsta fenolnih spojeva karakteriziranih -glukopiranozidnom strukturom koja nosi hidroksi-feniletilni dio kao aglikon. Ovi spojevi često sadrže kavenu kiselinu i ramnozu vezane na glukozni ostatak putem esterskih ili glikozidnih veza. U trenutnoj studiji, kvalitativne analize CD-a, CD-NP. i CD-HP, te je identificirano ukupno 97 spojeva, uključujući feniletanoidne glikozide (PhG), iridoide itd. Dobiveni rezultati pokazali su varijacije u kemijskom sastavu prije i nakon obrade. Intenzitet PhG-ova koji imaju 4'-O-kafeoilnu skupinu u 8-O- -D-glukopiranozilnom dijelu, poput akteozida, cistanozida C, kampneozida II, osmantusove strane, smanjio se nakon obrade, dok su PhG-ovi s

kao što su izoacetozid, izocistanozid, izokampneozid I, izomartinozid povećan, posebno u skupini CD-NP. Povećao se i intenzitet ehinakozida i cistanozida B čija struktura posjeduje 6'-O- -D-glukopiranozilni dio. PhG-ovi koji imaju 2'-acetilnu skupinu često se smanjuju zbog reakcije hidrolize tijekom procesa, poput tubulozida B, 2-acetilakteozida.

Ispitivanje metabolita apsorbiranih in vivo provedeno je nakon oralne primjene CD-a i njegovih prerađenih produkata. Metabolički procesi faze II bili su ključne kaskade, a većina metabolita bili su sulfatni, glukuronidni i metilirani konjugati. Feniletanol glikozidi imaju nisku oralnu apsorpciju i iskorištenost. Teško se apsorbiraju u krv i djeluju kao preci koji igraju svoje uloge nakon metaboličke aktivacije in vivo. Feniletanoidi proizvedeni u fenileta-nolaglikon, poput hidroksitirozola (HT) i kavene kiseline (CA) i njezinog derivata 3-hidroksifenilpropionske kiseline (3-HPP), ti se metaboliti mogu lakše apsorbirati u plazmu i imati bolji ljekoviti učinak.

CD i njegovi prerađeni proizvodi. HT-sulfatna konjugacija (M17) ima najveći intenzitet u urinu, zatim 3-HPP sulfatna konjugacija (M29), metilirana HT sulfatna konjugacija (M22), dehidroksilirana CA sulfatna konjugacija (M32) i 3,{{ 7}}dihidroksi benzenpropionska kiselina sulfatna konjugacija (M19). Sadržaj metaboličkih produkata u prerađenoj skupini bio je veći nego u CD skupini, posebice za M22, M29, M27, M16, M19, M1, M2.

Općenito, komponente koje imaju visoku izloženost u ciljnim organima mogle bi biti učinkovite. Dovoljna količina feniletanoida i njihovih derivata procijenjena je i određena in vitro. Akteozid je karakterističan spoj, čiji se sadržaj smanjio nakon prerade rižinim vinom, a sadržaj izoakteozida, izocistanozida C, izokampneozida I se u skladu s time povećao. Produkti razgradnje PhG-a, poput derivata CA i HT, mogu se procijeniti u bio-uzorcima, a prerada rižinog vina može poboljšati apsorpciju metabolita in vivo.

Zaključak

U ovoj studiji otkriveno je 97 spojeva u ekstraktima CD-a i njegovim prerađenim proizvodima. Razgradnja nekoliko glikozida odvijala se pod povišenom temperaturom i kao rezultat su sintetizirani neki novi izomeri i kompleksi. U studiji in vivo, komponente prototipa (10) i metaboliti (44) određeni su ili probno procijenjeni u plazmi štakora, izmetu i urinu. Metabolički procesi faze II bili su ključne kaskade, većina metabolita bila je povezana s ehinakozidom ili akteozidom, poput HT, CA i njihovih derivata 3-hidroksifenilpropionske kiseline 3-HPP. Ti se metaboliti mogu lakše apsorbirati u plazmu i imati bolji ljekoviti učinak. Dobiveni rezultati pokazali su da je kemijski sastav CD-a različit i da utječe na dispoziciju spoja in vitro i in vivo.

Kratice

PhGs: Feniletanoidni glikozidi; CD: Cistanche deserticola; CMM: kineska Materia Medica; TKM: Tradicionalna kineska medicina; CD-NP: Gistanche deserticola Obrađeno kuhanjem na pari s rižinim vinom pod normalnim tlakom; CD-HP: Cistanche deserticola Obrađeno kuhanjem na pari s rižinim vinom pod visokim pritiskom; UPLC-Q-TOF-MS: Tekućinska kromatografija ultravisoke učinkovitosti spojena s TOF-MS; PCA: Analiza glavnih komponenti; VIP: Promjenjiva važnost za projekciju; CA: Caffeicacid; HA: Hidroksitirozol.

Priznanja

Nije primjenjivo.

Prilozi autora

U izradi, pisanju rukopisa sudjelovali su LZ, LBN, SJ. RJ, LPP pomogli su u pokusima na životinjama te su izradili i finalizirali sve slike i tablice. ZC, HY. ITZ je pomogao u dizajnu i izvedbi ove studije te je pregledao rukopis. Svi su autori pročitali i odobrili konačni rukopis.

Financiranje

Ovaj rad podržali su Nacionalna zaklada za prirodne znanosti Kine (br. potpore: 81874345) i Zaklada za prirodne znanosti provincije Liaoning (br. potpore: 2020-MS-223).

Dostupnost podataka i materijala

Skupovi podataka korišteni i/ili analizirani tijekom trenutne studije dostupni su od odgovarajućeg autora na razuman zahtjev.

Deklaracije

Etičko odobrenje i pristanak za sudjelovanje

Etičko odobrenje za korištenje pokusnih životinja za ovu studiju dobiveno je od Odbora za medicinsku etiku Sveučilišta tradicionalne kineske medicine Liaoning (Broj odobrenja: 2018YS(DW)-044-01). Svi eksperimentalni postupci u ovoj studiji bili su pod etičkim standardima Povjerenstvo za medicinsku etiku Sveučilišta tradicionalne kineske medicine Liaoning.

Suglasnost za objavu

Nije primjenjivo.

Suprotstavljeni interesi

Autori izjavljuju da nemaju sukoba interesa za otkrivanje.

Podaci o autoru

'Farmaceutski odjel, Liaoning sveučilište tradicionalne kineske medicine, Dalian, Liaoning, Kina.' Institut za istraživanje lijekova Monos grupe, Ulaanbaatar 14250, Mongolija.

Primljeno: 31. svibnja 2021. Prihvaćeno: 17. rujna 2021. Objavljeno na mreži: 28. rujna 2021.

Zhe Li1, Lkhaasuren Ryenchindorj2, Bonan Liu1, Ji Shi1*, Chao Zhang1, Yue Hua1, Pengpeng Liu1, Guoshun Shan1 i Tianzhu Jia1

Reference

1. Povjerenstvo za kinesku farmakopeju. Farmakopeja Narodne Republike Kine, sv. I. Peking: China Medical Science Press; 2020. str. 140.
2. Li Z, Lin H, Gu L, Gao J, Tzeng CM. Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): jedan od najboljih farmaceutskih darova tradicionalne kineske medicine. Front Pharmacol. 2016;7:41.
3. Liu BN, Shi J, Zhang C, Li Z, Hua Y, Liu PP, Jia TZ. Učinci različitih metoda sušenja za svježu Cistanche deserticola na sadržaj njenih komponenti. J Chin Med Mater. 2020;10:2414–8.
4. Liu BN, Shi J, Jia TZ, Lv TT, Li Z. Optimizacija procesa parenja pod visokim tlakom za Cistanches Herba. Chin Trad Patent Med. 2019;11:2576-80.
5. Fan YN, Huang YQ, Jia TZ, Wang J, La-Sika, Shi J. Učinci Cistanches herba prije i poslije obrade na funkciju protiv starenja i imunološku funkciju štakora starenja izazvanih D-galaktozom. Chin Arch Trad Chin Med, 2017.; 11: 2882-2885.
6. Gao YJ, Jiang Y, Dai F, Han ZL, Liu HY, Bao Z, Zhang TM, Tu PF. Studija laksativnih sastojaka u Cistanche deserticola YMCA. Modern Chin Med. 2015;17(4):307–10.
7. Liu BN, Shi J, Li Z, Zhang C, Liu P, Yao W, Jia T. Studija o neuroendokrino-imunološkoj funkciji Cistanche deserticola i njezinih proizvoda kuhanja rižinog vina na modelu štakora izazvanog glukokortikoidima. Evid Based Complement Alternat Med. 2020;22:5321976.
8. Guo Y, Wang L, Li Q, Zhao C, He P, Ma X. Poboljšanje funkcije oživljavanja bubrega u mišjem modelu pomoću biljke Cistanches herba brzo osušene na srednje visokoj temperaturi. J Med Food. 2019;22(12):1246–53.
9. Wang T, Zhang X, Xie W. Cistanche deserticola YC Ma, "Pustinjski ginseng": recenzija. Am J Chin Med. 2012;40(6):1123–41.
10. Fu Z, Fan X, Wang X, Gao X. Cistanches Herba: Pregled njegovih kemijskih, farmakoloških i farmakokinetičkih svojstava. J Ethnopharmacol col. 2018;219:233–47.
11. Lei H, Wang X, Zhang Y, Cheng T, Mi R, Xu X, Zu X, Zhang W. Herba Cistanche (Rou Cong Rong): pregled njegove fitokemije i farmakologije. Chem Pharm Bull. 2020;68(8):694–712.
12. Geng X, Tian X, Tu P, Pu X. Neuroprotektivni učinci ehinakozida u mišjem MPTP modelu Parkinsonove bolesti. Eur J Pharmacol. 2007;564:66-74.

13. Deng M, Zhao JY, Ju XD, Tu PF, Jiang Y, Li ZB. Zaštitni učinak tubulozida B na apoptozu izazvanu TNF alfa u neuronskim stanicama. Acta Pharmacol Sin. 2004;25(10):1276–84.
14. Nan ZD, Zhao MB, Zeng KW, Tian SH, Wang WN, Jiang Y, Tu PF. Protuupalni iridoidi iz stabljika Cistanche deserticola uzgojenih u pustinji Tarim. Chin J Nat Med. 2016;14(1):61–5.
15. Nan ZD, Zeng KW, Shi SP, Zhao MB, Jiang Y, Tu PF. Feniletanoidni glikozidi s protuupalnim djelovanjem iz stabljika Cistanche deserticola uzgojenih u pustinji Tarim. Fitoterapija. 2013;89:167–74.
16. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Yuan D, Yoshikawa M, Hayakawa T, Muraoka O. Iridoidni i aciklički monoterpenski glikozidi, kankanozidi L, M, N, O i P iz Cistanche tubulosa. Chem Pharm Bull. 2010;58(10):1403–7.
17. Li SL, Song JZ, Qiao CF, et al. Nova strategija za brzo istraživanje potencijalnih kemijskih markera za razlikovanje sirovog i prerađenog Radix Rehmanniae pomoću UHPLC-TOF-MS s multivarijatnom statističkom analizom. J Pharm Biomed Anal. 2010;51(4):812–23.
18. Peng F, Chen J, Wang X, Xu CQ, Liu TN, Xu R. Promjene u razinama feniletanoidnih glikozida, antioksidativnoj aktivnosti i drugim svojstvima kvalitete u kriškama Cistanche deserticola obradom parom. Chem Pharm Bull. 2016;64:1024-30.
19. Ma ZG, Tan YX. Promjene sadržaja šest feniletanoidnih glikozida tijekom kuhanja na pari s vinom u Desertliving Cistanche. Chin Trad Pat ent Med. 2011;33(11):1951–4.
20. Peng F, Xu R, Wang X, Xu C, Liu T, Chen J. Učinak procesa parenja na kvalitetu cistanche deserticola nakon žetve za medicinsku upotrebu tijekom sušenja na suncu. Biol Pharm Bull. 2016;39(12):2066–70.
21. Cui Q, Pan Y, Zhang W, Zhang Y, Ren S, Wang D, Wang Z, Liu X, Xiao W. Metaboliti dijetetskog akteozida: profili, izolacija, identifikacija i hepatoprotektivni kapaciteti. J Agric Food Chem. 2018;66(11):2660–8.
22. Cui Q, Pan Y, Bai X, Zhang W, Chen L, Liu X. Sustavna karakterizacija metabolita ehinakozida i akteozida iz Cistanche tubulosa u plazmi, žuči, urinu i izmetu štakora na temelju UPLC-ESI-Q-TOF -MS. Biomed Chromatogr. 2016;30(9):1406–15.
23. Bertelli M, Kiani AK, Paolacci S, Manara E, Kurti D, Dhuli K, Bushati V, Miertus J, Pangallo D, Baglivo M, Beccari T, Michelini S. Hydroxytyrosol: prirodni spoj s obećavajućim farmakološkim aktivnostima. J Biotechnol. 2020;309:29-33.
24. Touaibia M, Jean-François J, Doiron J. Kafeinska kiselina, svestrani farmakofor: pregled. Mini Rev Med Chem. 2011;11(8):695–713.

Napomena izdavača

Springer Nature ostaje neutralan u pogledu tvrdnji o nadležnosti u objavljenim kartama i institucionalnim vezama.