Karakteriziranje rizika od odbacivanja bubrega prije transplantacije i nakon transplantacije sekvenciranjem imunološkog repertoara B stanica

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Proučavanje imunološkog repertoara u kontekstu transplantacije organa pruža važne informacije o tome kako adaptivni imunitet može doprinijeti i modulirati odbacivanje presatka. Ovdje karakteriziramo imunološki repertoar periferne krvi pojedinaca prije i poslijebubregtransplantacija korištenjem sekvenciranja receptora B stanica u longitudinalnoj kliničkoj studiji. Pojedinci kod kojih se razvije odbacivanje nakon transplantacije imaju raznolikiji imunološki repertoar prije transplantacije, što ukazuje na predispoziciju za rizik od odbacivanja nakon transplantacije. Osim toga, tijekom 2 godine praćenja, pacijenti kod kojih se razvije odbacivanje pokazuju specifičan skup proširenih klonova koji perzistiraju nakon odbacivanja. Iako postoji sveukupno smanjenje raznolikosti perifernih B stanica, vjerojatno zbog povećane opće izloženosti imunosupresiji u ovoj kohorti, otkrivanje specifične upotrebe gena IGHV kod svih pacijenata koji odbacuju potvrđuje da zajednički skup imunogenih antigena može potaknuti odbacivanje nakon transplantacije. Naša otkrića mogu imati kliničke implikacije za predviđanje i kliničko liječenje odbacivanja presađenog bubrega.

Bubregtransplantacija je preferirano liječenje završnog stadija bubrežne bolesti (ESRD) i kroničnebubregbolest. Iako je došlo do značajnih poboljšanja u tehnologijama i podudarnosti tkiva na temelju testiranja histokompatibilnosti za humane leukocitne antigene davatelja/primatelja (HLA)1, predviđanje ishoda presađivanja još je uvijek neriješen problem. Izmjerena nepodudarnost tkiva na drugim manjim, ne-HLA lokusima23 također može izazvati aloimuno oštećenje s akutnim i kroničnim odbacivanjem, što rezultira lošim dugoročnim ishodima presatka4. Štoviše, oko 50 postobubregalografti, bez većih HLA nepodudarnosti, i dalje se gube unutar 10 godina od transplantacije². Prethodno smo pretpostavili da ne-HLA lokusi mogu utjecati na imunološki odgovor primatelja na njegovbubregdonor graft6. More research needs to be done to better understand and predict the recipient's risk of rejection to substantially improve long-term patient and graft outcomes. Nevertheless, the diversity of the immune response to various immunogenic epi-topes is as yet, poorly understood. The role of T cells in organ transplant rejection has been demonstrated, but there is increasing appreciation of the additional role of B cells and antibodies in triggering this process8. In this regard, B-cell receptor sequencing(BCRSeq)is a promising high-throughput technique that allows the sequencing of millions of Immunoglobulin (Ig)regions in parallel to study the immune response. The key feature of B cells is their enormous diversity. Each individual is capable of producing >1013 različitih antitijela0, što im omogućuje prepoznavanje širokog niza stranih antigena. Ljudski BCR ili Ig sastoji se od dva identična teška lanca (I) formirana od pet izotipova: IgM, IgD, IgA, IgE i IgG, i dva laka lanca. Intaktno antitijelo sadrži varijabilnu i konstantnu domenu. Vezanje antigena događa se u varijabilnoj domeni, koja nastaje rekombinacijom segmenata gena varijable (V), raznolikosti (D) i spojnih (J) genskih segmenata koji tvore imunološki repertoar B-stanica, a njegova je raznolikost uglavnom koncentrirana u komplementarna determinirajuća regija 3 (CDR3). Tijekom procesa sazrijevanja afiniteta dolazi do somatske hipermutacije (SHM) u varijabilnoj regiji. Snažan adaptivni imunološki odgovor oslanja se na ekspanziju klonova B-stanica i proces koji se naziva sazrijevanje afiniteta, tijekom kojeg se uvode somatske mutacije u preraspodjelu Ig gena i odabiru B stanice s višim afinitetom za dati antigen.

Proučavanje imunološkog repertoara kod transplantacije organa ključno je za razumijevanje što pokreće i održava proces odbacivanja i kako on na kraju može ubrzati put prema otkazivanja presatka. Uz napredak sljedeće generacije sekvenciranja i robusnih računalnih pristupa, možemo detaljno proučavati VDJ regiju,12. Do danas, analiza imunološkog repertoara T-stanica ububregtransplantacija je provedena u vrlo ograničenom broju pacijenatal3-15, i iako je BCRSeq primijenjen na druge bolesti i ljudske imunološke odgovore, kao što je multipla skleroza6, cjepivo protiv gripe7 ili poremećaji imunodeficijencije8, nedostaju studije o transplantaciji odbijanje. Ububregtransplantacije, BCRSeq je proveden samo u kontekstu tolerancije, HLA senzibiliziranbubregkandidati za transplantaciju koji su podvrgnuti terapiji desenzibilizacije20, i infiltracija B-stanica uspoređujući klonsku ekspanziju u krvi i presatku2l. Još jedna primjena BCRSeqa u transplantaciji prethodno je objavljena u maloj kohorti od 12 primatelja presađenog srca.

Prepoznajući važnost humoralnog dijela imunološkog odgovora u kasnom odbacivanju transplantata i kroničnom neuspjehu alografta, karakteriziramo imunološki repertoar periferne krvi koristeći BCRSeq u prospektivnoj, longitudinalnoj studiji. Otkrili smo da je raznolikost imunološkog repertoara prije transplantacije veća u onih pojedinaca koji odbacebubregpokazujući također ekspanziju određenih klonova i IGHV gena tijekom 24 mjeseca praćenja. Ovi rezultati mogu pomoći u predviđanju rizika od odbacivanja prije presađivanja i mogu imati kliničke implikacije u otkrivanju određenih antigena koji uzrokuju odbacivanje.

Cistanche je dobar za rad bubrega

Rezultati

Predmeti studija. Proveli smo BCRSeq u 83 uzorka periferne krvi od 27 jedinstvenih pacijenata i izvršili analitički cjevovod prikazan na slici 1. Tri skupine kliničkih fenotipa, definirane slijepim središnjim patološkim očitanjima serijskih biopsija alografta ocijenjenih prema Banffovim kriterijima23,24 i rezultatima indeksa kroničnog oštećenja alografta (CADI): Neprogresori (NP; n=10) imali su nizak neinkrementalni CADI skor bez akutnog odbacivanja, progresivni skor bez odbacivanja (PNR;n=10) ​​imali su inkrementalni CADI skor tijekom 2 godine bez odbacivanja, a progresivni s odbacivanjem (PR; n=7) imali su inkrementalni visoki CADI rezultati tijekom 2 godine s epizodama odbijanja. Demografija, uzrocibubregneuspjeh, a uporaba imunosupresije prikazana je u tablici 1. Važno je istaknuti neke karakteristike ovih bolesnika. Matična studija u koju su uključeni ovi pacijenti imala je ukupnu nisku stopu (17 posto) akutnog odbacivanja potvrđenog biopsijom (srednja vrijednost{min, max}=12 {6,24}vrijeme odbacivanja mjeseci). Svi su ti pacijenti bili pod niskim imunološkim rizikom za odbacivanje (vršni panel reaktivni status senzibilizacije antitijela<20%), and="" also="" had="" low="" rates="" of="" generation="" of="" donor-specific="" antibody(dsa)and="" only="" two="" of="" the="" rejection="" phenotype="" patients="" included="" in="" the="" analysis="" had="" dsa.="" the="" generation="" of="" dsa="" to="" hla="" and="" mica="" was="" measured="" in="" all="" serial="" sera="" throughout="" the="" study25.="" national="" experience="" with="" similar="" immunosuppressive="" protocols="" in="" similar="" patient="" cohorts="" have="" confirmed="" similar="" good="" clinical="" outcomes="" and="" low="" rejection="">

Sekvenciranje imunološkog repertoara B-stanica. BCRSeq je rađen na uzorcima genomske DNA (gDNA) ekstrahiranim iz krvnih ugrušaka na 81 uzorku iz 27bubregprimatelji transplantata u tri vremenske točke (0,6,24 mjeseca). Sekvenciranjem je dobiven ukupan broj od 327 703 očitavanja (srednja vrijednost 4045/uzorak) nakon kontrole kvalitete (vidi odjeljak s metodama). Za validaciju rezultata i daljnju procjenu svakog izotipa, dodatno smo ekstrahirali RNA iz podudarnih PBMC koji su bili dostupni za 55 uzoraka, prikupljenih u isto vrijeme kad i krvni ugrušak, i proveli komplementarno DNA (cDNA) sekvenciranje na većoj dubini, dobivši 1.773.330 čitanja za IgD (srednja vrijednost 31 667/uzorak), 1 708 227 očitavanja za IgM (srednja vrijednost 30 504/uzorak), 973 444 očitavanja za IgA (srednja vrijednost 17 383/uzorak), 139 7345 očitavanja za IgG (srednja vrijednost 24 953 po uzorku) i 29,{{27 }} očitava IgE (srednja vrijednost 5178/uzorak) (dodatna slika 1). Biblioteke za svaki izotip su amplificirane odvojeno i zatim skupljene za sekvenciranje; stoga usporedna križna analiza izotipa nije izvediva.

Kao što je prikazano na slici 1b, definirali smo klon kao skupinu stanica koja potječe od molekule zajedničkog pretka koja ima isti IGHV i IGHJ segment, istu duljinu CDR3 i 90 postotnu identičnost nukleotida između CDR3 kako je prethodno definirano u studijama adaptivnog B -stanični odgovori'8. Ova definicija omogućuje proučavanje raznolikosti, zajedničkih ili zajedničkih češera i klonske ekspanzije u kontekstu aloimuniteta ububregtransplantacije. Broj jedinstvenih čunjeva po pojedincu u svakoj vremenskoj točki prikazan je kao trakasti dijagram u dodatnom materijalu (Dopunska slika 1). Radi strogosti analize podataka, diskontirali smo uzorke s<100 clones="" (69="" samples="" from="" gdna="" and="" 55="" samples="" from="" cdna="" were="" left="" for="" further="" study.="" ige="" isotype="" was="" discarded="" completely="" due="" to="" a="" very="" small="" number="" of="" reads).="" in="" addition,="" we="" filtered="" outpatient="" 8="" in="" the="" np="" group="" from="" subsequent="" analysis,="" as="" we="" recognized="" after="" the="" run,="" that="" he="" had="" developed="" ebv+post="" transplant="" lymphoproliferative="" disease(ptld)at="" 2.2="" years="" post="">bubregtransplantacija, karakterizirana proliferacijom Epstein Barr

Slika 1 Cjelokupni niz studija.a Shematski prikaz strukture protutijela i procesa VDJrekombinacije odgovornog za raznolikost proizvedenu u imunološkom repertoaru.b B-stanični klon definiran kao stanice zajedničkog pretka i c analitički cjevovod studije: B-stanice sekvenciranje za gDNA i cDNA, analiza raznolikosti s obzirom na broj klonova (bogatstvo) i učestalost svakog klona (Shannonova entropija), mrežna analiza i klonska analiza i analiza IGHV gena

B stanice zaražene virusom (EBV). Uočili smo povećani broj klonova u vremenu 6 kod ovog pacijenta, s nižom klonskom raznolikošću prijebubregtransplantacije i 24 mjeseca nakon transplantacije bubrega. Budući da su biblioteke umnožene iz nepromjenjive količine uzorka, veći udio B stanica u krvi mogao je rezultirati većim brojem klonotipova zastupljenih u sekvenciranim proizvodima. Zbog različitog i jedinstvenog patološkog procesa u ovog pacijenta, ovaj uzorak je isključen iz buduće analize.

Raznolikost B-stanica prije transplantacije povezana je s odbacivanjem. Kao što je prikazano na slici 1c, ispitali smo raznolikost imunološkog repertoara B-stanica uzimajući u obzir bogatstvo vrsta (broj jedinstvenih klonova) i Shannonovu entropiju (jednadžba (1) iz metoda) kroz vremenske točke i kliničke ishode koristeći model linearne regresije uzimajući u obzir broj klonova ili entropija kao zavisna varijabla i klinički ishod ili SHM kao nezavisna faktorska varijabla. Repertoar prijebubregtransplantacija u PR bila je znatno raznolikija nego u NP (bogatstvo: P-vrijednost=0.005, entropija: P-vrijednost=0.01) s istim trendom koji je trajao 6 mjeseci nakonbubregtransplantacija (bogatstvo: P-vrijednost=0.02, entropija: P-vrijednost=0.02), i bez prepoznatljivih grupnih razlika 2 godine nakon transplantacije (Sl. 2a i dodatna slika 2). Podaci sekvenciranja cDNA nakon transplantacije pokazali su isti trend u većoj raznolikosti repertoara 6 mjeseci nakon transplantacije, pretežno za izotipove IgD (bogatstvo: P-vrijednost=0.02, entropija: P-vrijednost=0. 03) (Slika 2b i Dodatna slika 2). Nije bilo zbunjujućeg učinka na podatke različitih demografskih i kliničkih varijabli, kao što su dob primatelja, spol, rasa, izvor davatelja, vrsta imunosupresije, HLA neusklađenost i uzrok zatajenja bubrega. Budući da odgovor B-stanica 1-godišnjaka (minimalna dob u podacima) i 19-godina (maksimalna dob u podacima) može biti vrlo različit, izvršili smo osjetljivost analiza koja je isključila ova dva pacijenta i rezultati su ostali značajni (NP u odnosu na PR u vremenu 0: bogatstvo: P-vrijednost=0.01, entropija: P-vrijednost=0.03). U drugom mjerilu raznolikosti imunološkog repertoara, procijenili smo SHM, definiran kao učestalost mutacija u svakom genskom segmentu V, i pronašli trend za veći broj SHM za PR prije transplantacije, i trend za viši SHM u IgD izotipu u PR-u 6 mjeseci nakon transplantacije (P-vrijednost=0.06).

Raznolikost B-stanica mijenja se tijekom vremena prema kliničkom ishodu. Kako bismo utvrdili mijenja li se raznolikost imunološkog repertoara tijekom vremena prema kliničkom ishodu, modelirali smo longitudinalne podatke koristeći linearne modele mješovitog učinka uzimajući u obzir interakciju između kliničkog ishoda i vremena. Otkrili smo da su se NP i PR ponašali različito tijekom vremena nakon transplantacije pokazujući povećanje raznolikosti u NP i smanjenje raznolikosti u PR, dok je za PNR raznolikost ostala nepromjenjiva tijekom vremena. To je primijećeno za gDNA (bogatstvo: P-vrijednost=0.007, entropija: P-vrijednost=0.001, slika 3a) i sve izotipove za cDNA, pri čemu su najznačajnije razlike u entropiji za izotipove IgM i IgD (IgA: P-vrijednost=0.07, IgD: P-vrijednost=0.02, IgG: P-vrijednost=0.05, IgM: P-vrijednost=0.04, slika 3b). Dijagrami bogatstva s odgovarajućim P-vrijednostima prikazani su na Dodatnoj slici 3. Kao što je uočeno na dijagramima, jedna osoba ima dodatni uzorak u vremenu od 32 mjeseca, što bi moglo iskriviti rezultate, stoga je provedena analiza osjetljivosti isključujući ovaj uzorak iz analizu i promatranje sličnih rezultata osim za izotipove IgG i IgM gdje se gubi značaj (gDNA-entropija: P-vrijednost=0.004. cDNA-entropija: IgA: P-vrijednost=0.1 , IgD: P-vrijednost=0.05, IgG: P-vrijednost=0.08, IgM: P-vrijednost=0.1).

Na mjere raznolikosti može utjecati biološko i tehničko uzorkovanje. Raznolikost uzorka može se značajno razlikovati od ukupne raznolikosti u repertoaru budući da je zastupljen samo djelić milijardi stanica, što je poznato kao problem nestalih vrsta. Tehničko uzorkovanje može postojati jer svaki uzorak može varirati u dubini sekvenciranja i određenom stupnju eksperimentalnih pogrešaka. Kako bismo riješili problem nestalih vrsta, upotrijebili smo alat Recon (rekonstrukcija procijenjenih klonova iz promatranog broja)29, koji procjenjuje ukupnu distribuciju veličine klonova. Recon daje točne i robusne procjene skupa mjera raznolikosti, uključujući bogatstvo i entropiju, omogućujući snažne usporedbe raznolikosti između pojedinaca. Kako bismo riješili dubinu sekvenciranja i određeni stupanj eksperimentalnih pogrešaka, izveli smo strategiju smanjivanja uzorkovanja; vrlo dobro korištena strategija u analizi imunološkog repertoara11,17,30. U analizi Recon (dodatna slika S4: A–E), i bogatstvo i raznolikost replicirani su za gDNA podatke. U podacima o cDNA, izotip IgD vremena 6 pokazuje trend, ali nije dosegao značajnost iako su longitudinalni rezultati za izotipove IgA, IgD i IgG ponovljeni. U analizi smanjenog uzorkovanja (dodatna slika S4: F–J), sve se replicira, ali vrijeme je 0 za gDNA podatke. To bi mogla biti posljedica ograničenja smanjenja uzorkovanja

Slika 2 Violin dijagrami koji prikazuju broj klonova (bogatstvo) kroz tri klinička ishoda. određeni broj klonova u trenucima 0, 6 i 24 iz gDNA uzoraka. b Broj klonova u vremenu 6 za IgD izotip iz cDNA uzoraka. P-vrijednosti dobivene su prilagodbom linearnog regresijskog modela uzimajući u obzir broj klonova kao zavisnu varijablu i klinički ishod kao neovisnu faktorsku varijablu (n=27 uzoraka). Violin dijagrami predstavljaju gustoću vjerojatnosti podataka za svaku vrijednost. Oznaka točke predstavlja vrijednost medijana s interkvartilnim rasponom. Izvorni podaci navedeni su kao datoteka izvornih podataka

Slika 3 Longitudinalni podaci iscrtani s fictiranom linijom za svaki klinički ishod. a Raznolikost mjerena Shannonovom entropijom predstavljenom kroz vremenske točke pomoću tri klinička ishoda (NP, PNR, PR) u gDNA. b Raznolikost mjerena Shannonovom entropijom predstavljenom kroz vremenske točke pomoću tri klinička ishoda (NP, PNR, PR) izotipovima u cDNA. P-vrijednosti odgovaraju terminu interakcije definiranom vremenom × kliničkim ishodom prilagodbe linearnog modela mješovitog učinka (n=27 uzoraka). Svaka točka predstavlja entropiju po uzorku u vremenu sa svojom prilagođenom linijom i intervalom pouzdanosti. Izvorni podaci navedeni su kao datoteka izvornih podataka

implicirane strategije, posebno na gDNA podacima gdje je broj sekvenci mnogo manji nego za cDNA podatke. U gDNA smo ograničili analizu na pojedince s najmanje 1000 klonova kako bismo sačuvali dovoljno sekvenci. Uzorkovanje je napravljeno na najmanje 1062 klona u usporedbi sa 62173 klona u cDNA. Unatoč ovom ograničenju, promatrali smo trend za vrijeme 0, sačuvali značaj za longitudinalnu analizu u gDNA i replicirali sve asocijacije u cDNA. U obje analize (recon i downsampling), replicirali smo rezultate, unatoč nekim ovdje istaknutim ograničenjima, pokazujući valjanost prethodno prijavljenih rezultata.

B-stanične mreže pokazuju razlike u klonskoj ekspanziji. Repertoar B-stanica može se prirodno predstaviti kao mreža temeljena na raznolikosti sekvenci31. U našim smo podacima razvili vizualnu mrežu za svaki uzorak (slika 4 i dodatne slike 5–7) gdje je svaki vrh predstavljao jedinstveni BCR, a broj identičnih BCR-ova na temelju njihovih nukleotidnih sekvenci definirao je veličinu vrha. Rub postoji između vrhova kada pripadaju istom klonu, tako da se klasteri B stanica mogu prikazati kao grupe međusobno povezanih vrhova koji tvore klon. Za kvantificiranje mreže upotrijebili smo Ginijev indeks, što je mjera neujednačenosti koja je primijenjena na distribuciju vrhova i klastera. Kada se primijeni na veličinu verteksa, Gini(V), predstavljena je ukupna klonska priroda. Ako je Gini(V) bliži 1, vrhovi su nejednaki pokazujući ekspanziju nekih od njih, a bliže 0 u protivnom. Kada se primijeni na veličinu klastera, Gini(C), predstavljena je klonska dominacija. Ako su bliže 1, klasteri su nejednaki i stoga predstavljaju dominantne klonove, ako su bliže 0, svi klasteri su jednake veličine.

Na slici 4 prikazujemo primjer izraženih vizualnih i kvantitativnih razlika između reprezentativnih repertoara B-stanica iz svake od tri skupine kliničkih ishoda, kroz tri različite vremenske točke (prije transplantacije i nakon transplantacije 6 i 24 mjeseca) . U PR repertoaru postoji obilje B-staničnih sekvenci formiranja više i većih klastera klonova u usporedbi s NP dok se PNR nalazi između. Tijekom vremena, PR skupina pokazuje smanjenje broja BCR i jedinstvenih klonova u usporedbi s NP. Detaljne mreže B-stanica svakog pojedinca u studiji prikazane su u Dodatnim slikama. 5–7. Zanimljivo je promatrati vrlo raznolik obrazac mreže B-stanica kod pojedinca koji je razvio PTLD u NP skupini (dopunska slika 5), ​​bez ekspanzije B-stanica prije transplantacije, nakon čega je uslijedio porast B-stanica nakon 6 mjeseci i jasno klonsko širenje praćeno smanjenjem raznolikosti 24 mjeseca nakon transplantacije.

Pri daljnjoj procjeni mjere Gini indeksa (Slika 5), ​​PR skupina dosljedno je pokazivala značajno više mjere i za verteks i za klaster u odnosu na NP skupinu, što sugerira da su pacijenti iz PR skupine imali veću klonsku ekspanziju na početku,

Slika 4 Mreže repertoara B-stanica od tri osobe koje predstavljaju tri klinička ishoda kroz vremenske točke. Svaki vrh predstavlja jedinstveni BCR koji je veličina vrha definirana brojem identičnih BCR-ova s ​​obzirom na nukleotidne sekvence. Brid postoji između vrhova kada oni pripadaju istom klonu kako je prije definirano, tako da su klasteri skupine međusobno povezanih vrhova koji tvore klon. Svaki uzorak prikazuje gini indeks dobiven za veličinu vrha (Gini(V)) i veličinu klastera (Gini(C)). BCR odražava ukupni broj receptora B-stanica za taj specifičan uzorak, a klonovi odražavaju ukupan broj jedinstvenih klonova. Izvorni podaci navedeni su kao datoteka izvornih podataka

i daljnje širenje podskupa dominantnih klonova nakon transplantacije (P-vrijednost [linearna regresija] < 0.05,="" slika="" 5).="" pnr="" skupina="" nalazi="" se="" između="" np="" i="" pr="" kao="" što="" je="" prethodno="" prikazano,="" iako="" je="" ovo="" vrijeme="" značajno="" različito="" u="" odnosu="" na="" np="" skupinu="" u="" vremenu="" 24="" (p-vrijednost="" [linearna="" regresija]="">< 0,05).="" iako="" su="" podaci="" za="" sliku="" 5="" generirani="" iz="" podataka="" o="" gdna,="" izotip="" igm="" za="" cdna="" pokazao="" je="" iste="" razlike="" (p-vrijednost="" [linearna="" regresija]="0.05)" (dodatna="" slika="">

Određeni klonovi i IGHV geni uključeni su u odbacivanje.

Iako je naš primarni fokus bio okarakterizirati repertoar B-stanica prema skupinama kliničkih ishoda, pružajući globalnu sliku imunološkog odgovora prije i poslije transplantacije, naši su nam podaci također omogućili da izvedemo analizu specifičnih za Ig sekvencu na klonu i IGHV-u. razini gena.

Za klonsku analizu procijenili smo povezanost prisutnosti ili odsutnosti svakog pojedinog klona (ukupno 118 223 klona) s kliničkim ishodom (PR, PNR, NR) u svakoj vremenskoj točki. Primjenom Fisherovog egzaktnog testa, pronašli smo 8, 4 i 21 klona nominalno povezanih s kliničkim ishodima u svakom od 0, 6, odnosno 24 mjeseca (dodatna tablica 1). Iako nijedan nije prošao korekciju višestrukog testiranja, uglavnom zbog nedostatka snage budući da imamo ograničenu veličinu uzorka u analizi s tisućama parametara (klonovi), mogli smo uočiti da je nekoliko klonova koji su se približili značajnosti (P-vrijednost < {{="" 11}}.05)="" podijeljeni="" su="" među="" pacijentima="" samo="" u="" pr="" skupini="" i="" obogaćeni="" 24="" mjeseca="" nakon="">

Također smo razmotrili jesu li neki klonovi postojali tijekom vremena uzorkovanja, više od drugih, unutar svakog kliničkog ishoda (dopunska slika 9). Uzimamo u obzir dvije različite mjere: (1) broj postojanih klonova i (2) klonsku ekspanziju. Primijetili smo da su klonovi koji su postojani u PR-u bili značajno ekspandiraniji (P-vrijednost [linearna regresija]=0.01, PR naspram NP) i pokazali su trend većeg broja postojanih klonova (P- vrijednost [linearna regresija]=0.09). Nadalje smo ispitali jesu li ti perzistentni klonovi također podijeljeni među različitim pojedincima unutar svakog kliničkog ishoda. Od 263 otkrivena postojana klona, ​​23 su podijeljena među pojedincima. Pet ih je podijeljeno unutar istog PNR-a i šest unutar PR grupe, a NP grupa nije dijelila nijedan klon. Ukupno je 12 zajedničkih klonova bilo uobičajeno u obje skupine pacijenata s progresivnom kroničnom ozljedom transplantatom i fibrozom tijekom vremena (PR i PNR). Popis klonova koji se dijele među pojedincima nalazi se u dopunskom materijalu (dodatna tablica 2).

Zatim smo izvršili analizu gena IGHV, promatrajući upotrebu gena IGHV po uzorku, definiranu kao broj puta kada je svaki gen za IGHV korišten, normaliziran prema broju klonova (kako bismo izbjegli pristranost uzorkovanja određenih gena IGHV), filtrirajući slabo izražene

Slika 5 Vertex Gini Index iscrtan u odnosu na Gini Index klastera. Dijagram raspršenosti predstavlja svaki uzorak u vremenima 0, 6 i 24. Okvirni dijagrami pokazuju Gini(V) i Gini(C) razlike u vremenu 24. P-vrijednosti dobivene su prilagodbom modela linearne regresije uzimajući u obzir Gini(V) i Gini(C) kao zavisnu varijablu i klinički ishod kao nezavisnu faktorsku varijablu za svaku vremensku točku (n=27 uzoraka). U dijagramu je prikazano samo vrijeme 24, ali vrijeme 0 i 6 također su značajni za NP u odnosu na PR: vrijeme 0: P (Gini (V))=0.1, P ( Gini(C))=0.05; vrijeme 6 P (Gini(V))=0.02, P (Gini(C))=0.01; vrijeme 24: P (Gini(V))=0.003, P (Gini(C))=0.01. Traka unutar okvira predstavlja srednju vrijednost, okvir definira interkvartilni raspon (IQR), a brkovi definiraju prvi i treći kvartil ± 1,5 × IQR. Izvorni podaci navedeni su kao datoteka izvornih podataka

gena (upotreba gena IGHV > {{0}}.05 u najmanje 10 posto uzoraka), i primjenom modela linearne regresije kako bi se pronašli oni geni koji su bili povezani sa svakim kliničkim ishodom, u svakoj vremenskoj točki. Od 27 IGHV gena koji su prošli filtar niske ekspresije, pronašli smo značajne gene između PR i NP skupine (P-vrijednost < 0.05)="" s="" tri="" gena="" u="" vremenu="" 0,="" 7="" u="" vremenu="" 6="" i="" 16="" u="" vremenu="" vrijeme="" 24="" (sl.="" 6a–c).="" od="" ovih="" gena,="" 1="" (ighv3-11)="" u="" vremenu="" 0,="" 5="" gena="" (ighv3-7,="" ighv3-15,="" ighv3-21,="" ighv3-23,="" ighv{="" {22}})="" u="" vremenu="" 6="" i="" 16="" gena="" (ighv1-8,="" ighv1-18,="" ighv1-46,="" ighv2-="" 5,="" ighv3-7,="" ighv{{="" 30}},="" ighv3-15,="" ighv3-23,="" ighv3-30,="" ighv3-33,="" ighv3-48,="" ighv3-74,="" ighv{{37="" }},="" ighv4-59,="" ighv4-61,="" ighv5-51)="" u="" trenutku="" 24="" prošli="" su="" višestruku="" korekciju="" stope="" lažnog="" otkrivanja="" (fdr).="" zanimljivo,="" otkrili="" smo="" da="" je="" ighv3-23="" bio="" najznačajniji="" i="" najobilniji="" gen="" u="" sve="" tri="" vremenske="" točke="" u="" usporedbi="" np="" naspram="" pr="" (vrijeme="" 0:="" p-vrijednost="0.04," vrijeme="" 6:="" p-="" vrijednost="0.003," vrijeme="" 24:="" p-vrijednost="0.02)" (sl.="" 6d).="" osim="" toga,="" procijenili="" smo="" jesu="" li="" ighv3-23="" sekvence="" bile="" previše="" zastupljene="" među="" zajedničkim="" sekvencama="" iz="" prethodne="" klonalne="" analize.="" ustanovili="" smo,="" koristeći="" analizu="" obogaćivanja="" s="" fisherovim="" egzaktnim="" testom,="" da="" su="" ighv3-23="" sekvence="" bile="" značajno="" prekomjerno="" zastupljene="" u="" oba,="" perzistentna="" klona="" podijeljena="" među="" pojedincima="" (dodatna="" tablica="" 2)="" (p-vrijednost="">< 2,2="" ×="" 10="" −="" 16="" ),="" i="" klonovi="" povezani="" s="" kliničkim="" ishodom="" u="" vremenu="" 24="" (dodatna="" tablica="" 1)="" (p-vrijednost="">< 2,2="" ×="" 10−16).="" primijetili="" smo="" da="" se="" jedinka="" 9="" u="" nr="" skupini,="" za="" koju="" je="" u="" prethodnim="" analizama="" utvrđeno="" da="" dijeli="" neke="" postojane="" klonove="" s="" progresorima,="" klasificirala="" u="" pr="" skupinu="" u="" svim="" vremenskim="" točkama.="" nije="" bilo="" zbunjujućeg="" učinka="" na="" podatke="" različitih="" demografskih="" i="" kliničkih="" varijabli,="" kao="" što="" su="" dob="" primatelja,="" spol,="" rasa,="" izvor="" davatelja,="" vrsta="" imunosupresije,="" hla="" neusklađenost="" i="" uzrok="" zatajenja="" bubrega.="" osim="" toga,="" za="" ovaj="" je="" gen="" također="" utvrđeno="" da="" je="" značajan="" u="" oba="" izotipa="" igm="" (p-vrijednost="" [linearna="" regresija]="0.008)" i="" igd="" (p-vrijednost="" [linearna="" regresija]="0.05)" na="" temelju="" cdna="" 24="" mjeseca="" nakon="" transplantacije,="" u="" skladu="" s="" prethodnim="" rezultatima="" koji="" pokazuju="" dosljednost="" s="" ova="" dva="" izotipa="" koja="" su="" najviše="" obogaćena="" u="" pr="" skupini.="" samo="" su="" tri="" druga="" gena="" bila="" značajna="" u="" analizi="" cdna,="" a="" svi="" su="" bili="" 24="" mjeseca="" nakon="" transplantacije="" u="" izotipovima="" igd="" i="" igm="" (ighv3-15="" i="" ighv4-="" 61="" u="" igd="" i="" ighv4-39="" u="">

Rasprava

Raznolikost je ključna karakteristika imunološkog sustava, a kod zdravih ljudi ključna je protiv patogena u borbi protiv bolesti. Kod presađivanja organa klinički se provodi namjerna terapijska manipulacija kako bi se omogućilo aktivno ignoriranje ili prihvaćanje stranog organa od strane imunološkog sustava vlastitog pacijenta kako ne bi došlo do aloimunog odgovora, što dovodi do odbacivanja. B stanice su važna komponenta ovog procesa i naša grupa i drugi su pokazale da su ključne u prezentaciji antigena32,33 i proizvodnji aloantitijela34,35. U ovom smo radu upotrijebili sekvenciranje B-stanica visoke propusnosti kako bismo bolje razumjeli raznolikost i klonalnost B-stanica ububregcirkulaciju primatelja transplantata, prije presađivanja i nakon 24 mjeseca praćenja, uz longitudinalnu procjenu imunološkog repertoara B-stanica. Sveukupno, naša analiza pokazuje veću raznolikost B-stanica prije presađivanja, uzdužne razlike sa smanjenjem raznolikosti popraćenom klonskom ekspanzijom i povećanjem korištenja određenih IGHV gena među onima koji odbace presatke.

Ključna nezadovoljena klinička potreba za transplantacijom organa je nedostatak neinvazivnog, osjetljivog i točnog predviđanja ozljeda i loših ishoda transplantacije. Ovaj zadatak je kompliciran činjenicom da postoje različiti čimbenici koji utječu na preživljavanje presatka36. U ovoj smo studiji otkrili da su stabilne osobe imale smanjenu raznolikost imunološkog repertoara B-stanica prije transplantacije u usporedbi s onima koji su odbacili organ. Sljedeći korak trebao bi biti demonstracija prediktivne vrijednosti raznolikosti repertoara B-stanica, pružajući potencijalno bolje biomarkere za predviđanje odbacivanja prije presađivanja, te mogućnost primjene u kliničkoj skrbi i izboru imunosupresije prije i poslijebubregpresaditi. Ako je ova značajka rezultat bilo kojeg čimbenika koji pridonosi smanjenju raznolikosti kod stabilnih jedinki, kao što su okolišni ili genetski čimbenici, mogli bismo ne samo predvidjeti odbacivanje, već ga i spriječiti. Doista, nedavna otkrića pokazala su da varijacije u imunološkom sustavu pokreću okolišno-mentalni i genetski čimbenici37,38. U našoj studiji nismo mogli pronaći nikakvu povezanost s bilo kojim demografskim ili drugim kliničkim karakteristikama bolesnika (dob, spol, rasa, imunosupresija, izvor organa, nepodudarnost HLA i ESRD). U tom smislu, potrebna nam je nova analiza kako bismo potvrdili utječu li specifični čimbenici na raznolikost repertoara B-stanica i ishode transplantacije.

Još jedno zanimljivo otkriće u našoj studiji pokazuje da se imunološki repertoar ponaša različito tijekom vremena, ovisno o skupini kliničkog ishoda. Za one koji pokazuju odbacivanje organa nakon transplantacije, raznolikost B-stanica je u početku veća, a zatim se s vremenom smanjuje, dok se obrnuti trend raznolikosti vidi kod pacijenata koji ne razviju odbacivanje ili kroničnu ozljedu presatka. Iako su svi pojedinci primili isto opterećenje imunosupresije nakon transplantacije, neka moguća objašnjenja za smanjenu raznolikost kod pacijenata koji razviju odbacivanje mogu se odnositi na činjenicu da ti pacijenti primaju privremeno znatno povećano opterećenje imunosupresije za liječenje odbacivanja i zatim zadržavaju se na višoj osnovici. Iako bi ovo moglo objasniti smanjenje raznolikosti B-stanica tijekom vremena i objasniti razliku 24 mjeseca nakon transplantacije, malo je vjerojatno da je to uzrok, jer je smanjena raznolikost u PR skupini

Slika 6. Toplinska karta i okvir za analizu upotrebe gena IGHV. Toplinska karta koja prikazuje IGHV gene odabrane kao nominalno značajne (P-vrijednost < 0.05)="" u="" trenutku="" 0="" (a),="" 6="" (b)="" i="" 24="" (c)="" za="" np="" u="" odnosu="" na="" pr.="" ljestvica="" crvene="" boje="" predstavlja="" ekspresiju="" svakog="" gena="" u="" uzorcima.="" trake="" na="" vrhu="" pokazuju="" klinički="" ishod="" i="" uzrok="" esrd.="" okvirni="" dijagram="" koji="" prikazuje="" ighv3-23="" izraz="" kroz="" vremenske="" točke="" za="" np="" u="" odnosu="" na="" pr="" (vrijeme="" 0:="" p-vrijednost="0.04," vrijeme="" 6:="" p-vrijednost="0.003," vrijeme="" 24:="" p="" -vrijednost="0.02)" (d).="" traka="" unutar="" okvira="" predstavlja="" srednju="" vrijednost,="" okvir="" definira="" interkvartilni="" raspon="" (iqr),="" a="" brkovi="" definiraju="" prvi="" i="" treći="" kvartil="" ±="" 1,5="" ×="" iqr.="" p-vrijednosti="" dobivene="" su="" prilagodbom="" linearnog="" regresijskog="" modela="" uzimajući="" u="" obzir="" v="" gene="" kao="" zavisnu="" varijablu="" i="" klinički="" ishod="" kao="" nezavisnu="" varijablu.="" (n="12" uzoraka).="" izvorni="" podaci="" navedeni="" su="" kao="" datoteka="" izvornih="">

također se vidi 6 mjeseci nakon transplantacije, u vrijeme kada pacijenti još nisu razvili odbacivanje, što sugerira da su vjerojatno uključeni i drugi aktivni procesi. Opažanje selektivne klonalne ekspanzije s dominantnijim klonovima samo u pacijenata koji razviju i odbacivanje i/ili progresivno kroničnobubregozljeda transplantata, sugerira biološki relevantnu, aloantigenom vođenu selekciju, postojanost i širenje određenih klonova tijekom vremena, što objašnjava ukupno smanjenje vremenske raznolikosti. Iako možemo pretpostaviti da je širenje ovih klonova vjerojatno povezano s aloimunološkim oštećenjem presatka, izravan dokaz da je širenje ovih klonova aloimuno zahtijeva dodatne in vitro studije i studije na životinjama.

Akutno odbacivanje ostaje najjači negativni čimbenik za dugoročno preživljavanje presatka unatoč brzim poboljšanjima u imunosupresivnim terapijama39,40. Ova studija također pronalazi povezanost upotrebe nekih IGHV gena s odbacivanjem, iako bi uzročnu vezu trebalo istražiti u budućim studijama. IGHV3-23 je najzanimljiviji gen u analizi gDNA jer se značajno češće koristi kod pacijenata koji razviju odbacivanje u svim izmjerenim vremenskim točkama i previše je zastupljen u perzistentnim klonovima koji se dijele među pojedincima i klonovima obogaćenim među odbijenih pacijenata 24 mjeseca nakon transplantacije. Ovaj je gen također potvrđen 24 mjeseca nakon transplantacije u oba izotipa IgD i IgM u cDNA analizi. IGHV3-23 se opsežno povezuje s lošom prognozom kod kronične limfocitne leukemije41 i pokazalo se da je velika većina IGHV3-23 sekvenci zadržala sposobnost posredovanja u interakcijama superantigena42. Superantigene B-stanica proizvode virusi i bakterije, za koje je poznato da se vežu na imunoglobuline izvan uobičajenih mjesta vezanja antigena43. Pokazalo se da susreti B stanica sa superantigenom induciraju proliferaciju, aktivaciju, migraciju i brisanje44. U presađenombubreg, postoji mogućnost kontinuirane izloženosti virusu i bakterijskim antigenima, u vezi s etiologijom primarnog vezikoureterskog refluksa kao uzroka ESRD-a ili sekundarnog urinarnog refluksa nakon reimplantacije transplantiranog uretera, ili refluksa nakon infekcije mokraćnog sustava, rizik od koja se povećava s izloženošću kroničnoj imunosupresiji nakon transplantacije. Prilagodili smo rezultate analiza za uzrok zatajenja bubrega, između ostalih kliničkih i demografskih čimbenika; rezultati o kojima smo prethodno raspravljali ostaju značajni iako smo shvatili da je NP pogrešno klasificiran pacijent u analizi (slika 6) imao refluksnu bolest. Cheng i sur. također su prethodno otkrili da su klonovi u biopsijskom tkivu primatelja transplantiranog bubrega infiltrirani B stanicama među ostalima imali dominaciju gena IGHV3-2345. Grover i sur.46 pokazali su da protutijela za ovaj određeni gen nisu prepoznavala donorske HLA antigene, već su bila specifična za E. coli, a Modena i sur.47 pokazali su da je opterećenje brojem bakterija u urinu puno veće u bolesnika s intersticijalnu fibrozu i tubularnu atrofiju od onih s presacima koji su dobro funkcionirali. Proširujemo ove nalaze pokazujući da je upotreba gena IGHV3-23 znatno veća kod višestruko odbijajućih pacijenata u perifernoj krvi i može implicirati određene uobičajene antigene u pokretanju odbijanja. U budućnosti bi se ekspresija IGHV3-23 potencijalno mogla koristiti za praćenje imunološkog odgovora na transplantiranebubreg.

Proširujući našu studiju korištenjem cDNA sekvencioniranja, mogli bismo replicirati većinu naših rezultata u dva izotipa (IgM i IgD), pokazujući manju raznolikost prije transplantacije u NP, budući da su dva najznačajnija u longitudinalnoj analizi s većom ekspanzijom i dominantnošću klonova u analizi mreže i također repliciranje gena IGHV3-23. Prva protutijela koja se proizvode u humoralnom imunološkom odgovoru uvijek su IgM i brzo napreduju do proizvodnje svih različitih izotipova, IgD, IgA, IgG i IgE, ali poseban interes zahtijeva izotip IgD48. IgD se eksprimira zajedno s IgM, a izlučeni IgD postoji i ima funkciju u krvi, mukoznim sekretima i na površini urođenih imunoloških efektorskih stanica kao što su bazofili49. Bazofili su bijele stanice koje se bore protiv virusa, bakterija, parazita i gljivica, a uključene su u bubrežne bolesti i odbacivanje transplantata50. Dakle, još jedan dokaz koji povezuje odgovore B-stanica s procesom odbacivanja kod virusa i bakterija.

Potrebne su buduće studije kako bi se pokazalo da je ta aktivacija posljedica razlika u mikrobiomu primatelja s implikacijama u dijagnostici i terapiji.

Ova nam je studija omogućila da identificiramo relevantnost nekih od ovih BCR klonova, identificiramo BCR klonove od kliničke važnosti s odbacivanjem alografta i pokažemo da postoji vjerojatna relevantnost ovih klonova s ​​heterolognim imunitetom, s obzirom na obogaćivanje ovih klonova u bolesnika s kolonizirani urinarni trakt prije transplantacije i njihova biološka važnost za odgovor patogena. Bolje razumijevanje ponašanja imunološkog repertoarabubregtransplantacije ne bi bile moguće bez primjene BCRSeq-a u kombinaciji s robusnom implementacijom računalnih i statističkih cjevovoda. Unatoč tome, postoji nekoliko ograničenja našeg pristupa koja treba prepoznati: Prvo, veličina našeg uzorka je visoko odabrana i relativno mala u skupini pedijatrijskih pacijenata i iako smo dosegli statističku značajnost u našoj analizi i potvrdili u dva različita izvora podataka, bit će potrebna daljnja analiza kako bi se potvrdili naši rezultati. Drugo, naši rezultati nisu izuzeti od utjecaja koji biološko i tehničko uzorkovanje može imati u našoj analizi. Mjere raznolikosti ovise o nekoliko pitanja: činjenica da je samo djelić milijardi stanica u repertoaru zastupljen u uzorku, razlike u dubini sekvenciranja i moguće eksperimentalne pogreške. Opsežno smo kontrolirali sve te probleme, prvo u laboratoriju, uzevši istu količinu krvi za svaki uzorak u istoj seriji i drugo, računalno i statistički, primjenom alata za rekonstruiranje za procjenu ukupnog repertoara i izvođenjem smanjenja uzorkovanja za kontrolu dubine sekvenciranja i eksperimentalne greške. Treće, proveli smo BCRSeq koristeći dva različita izvora, gDNA i cDNA. Sekvenciranje gDNA olakšava procjenu klonalnosti danog slijeda Ig budući da će broj očitanih slijeda biti proporcionalan broju molekula gDNA. Sekvenciranje cDNA daje procjenu relativne razine ekspresije različitih Ig sekvenci u repertoaru. Pokazalo se da za T-stanične receptore karakterizacija klonotipa izvedena na cDNA nije tako dobra kao u gDNA pokazujući da se relativni udio pojedinačnih klonova jako razlikuje15 ili da je praćenje klonova specifičnih za HIV uspješno samo s gDNA, ali ne mRNA51. Četvrto, utjecaj imunosupresije može biti zbunjujući čimbenik u ovoj vrsti analize. U ovoj studiji, svi uzorci potječu iz kliničkog ispitivanja gdje su svi pacijenti nakon transplantacije primili isto opterećenje imunosupresijom. Unatoč tome, kontrolirali smo dvije vrste na bazi steroida i one bez steroida kako bismo bili sigurni da to nije problem, ne promatrajući razlike u rezultatima. Konačno, kohorta koju ovdje predstavljamo je ona pedijatrijskih transplantacija. Većina transplantiranih kliničkih aspekata slična je u djece i odraslih. Imunosupresija i korišteni režimi su slični, kreatinin je glavni biomarker u serumu, akutno odbacivanje se prvenstveno utvrđuje biopsijom uz korištenje Banffovih kriterija, a mehanizmi odbacivanjabubregtransplantat općenito su slični52, stoga se većina istraživanja provedenih u odraslih ili djece može odnositi na oboje. Međutim, drugi aspekti kao što su nepridržavanje/nepridržavanje imunosupresije, imunološki aspekti, primarne bolesti bubrega, koje dovode do zatajenja bubrega, često povezane s urološkim problemima, i imunizacije koje su potrebne prije transplantacije mogu se razlikovati, stoga se daljnja analiza u odrasla populacija bit će potrebna za generalizaciju ovih nalaza.

Unatoč tim ograničenjima, naši podaci otkrivaju da je veća raznolikost prije presađivanja primijećena kod pojedinaca koji odbace organ, što ukazuje na predispoziciju odbacivanja, što može imati buduće implikacije u predviđanju rizika od odbacivanja prije presađivanja, izbora imunosupresije i kliničke skrbi praksi. Nakon 24 mjeseca praćenja, uočeno je sveukupno smanjenje raznolikosti tijekom vremena popraćeno postojanošću i širenjem određenih klonova i većom upotrebom nekoliko IGHV gena u skupini koja je odbacila, što može implicirati određene uobičajene antigene u pokretanju odbacivanja. Poseban interes se primjećuje za povećanu upotrebu gena IGHV3-23 među pacijentima s odbacivanjem budući da je prethodno povezivan sbubregtransplantacije i mogla bi biti ključna komponenta za pokretanje procesa odbacivanja. Ovaj rad predstavlja longitudinalnu analizu imunološkog repertoara B-stanica u transplantaciji organa promičući više studija za potvrdu ovih nalaza budući da mogu imati kliničke implikacije u predviđanju, kontroli, praćenju i liječenjububregodbijanje.

metode

Studirati dizajn. Proučavali smo 81 uzorak za gDNA i 56 podudarnih uzoraka za cDNA longitudinalno u razdobljima 0, 6 i 24 mjeseca od ukupnog broja od 27 pedijatrijskih primatelja koji su primili primarnibubregpresaditi. Subjekti u ovoj studiji dolaze iz kliničkog ispitivanja (SNSO1 multicentrična studija) gdje su subjekti bili randomizirani (1:1) na tradicionalni režim imunosupresije baziran na niskim dozama steroida (steroidi, standardna indukcija daklizumaba do drugog mjeseca nakon transplantacije, i održavanje imunosupresije takrolimusom (Prograf, Astellas Pharma) i MMF-om (CellCept, Hoffman-La Roche) ili režimom imunosupresije bez steroida (produljena indukcija daklizumabom do šestog mjeseca nakon transplantacije, takrolimus i MMF). Svi subjekti su bili uključeni nakon odobrenja IRB-a i imali su informirani pristanak. U ovoj studiji, 14 pacijenata je primilo režim izbjegavanja steroida, dok je 13 primilo režim imunosupresije na bazi steroida53 i niti jedan od tih pacijenata nije primio imunosupresiju prije transplantacije jer je to bio jedan od kriterija za isključenje. Liječenje odbacivanja sastojao se od tri pulsa intravenoznog kortikosteroida (10 mg/kg) i početne intenzifikacije imunosupresije.

Svi uzorci korišteni u studiji imali su pridruženu serijsku biopsiju alografta, koju je očitao središnji patolog, koristeći polukvantitativne histološke rezultate. Kliničko akutno odbacivanje definirano je kao akutna epizoda odbacivanja, povezana s disfunkcijom presatka, na temelju porasta serumskog kreatinina za više od 10 posto u odnosu na početne vrijednosti, a potvrđeno je središnjim patološkim očitavanjem biopsija prema ažuriranoj Banffovoj klasifikaciji23,24. Kronična ozljeda alografta definirana je korištenjem indeksa kroničnog oštećenja alografta (CADI). Bolesnici su klasificirani u tri klinička ishoda definirana CADI rezultatom i epizodama odbacivanja. Pacijenti bez progresije (NP) imali su nizak neinkrementalni CADI rezultat na tri serijske biopsije tijekom 2 godine, bez akutnog odbacivanja, progresorni pacijenti bez odbacivanja (PNR) imali su viši CADI rezultat na svojim serijskim biopsijama tijekom 2 godine i inkrementalni kroz vremenske točke bez odbacivanja, a progresorni s odbacivanjem (PR) imali su inkrementalne visoke CADI rezultate na svojim serijskim biopsijama tijekom 2 godine s epizodama odbacivanja. Ovi su pacijenti vrlo pažljivo odabrani iz veće skupine od 120 pacijenata, koji su odgovarali demografskim varijablama, te svim NP i PNR-ima kako ne bi imali dokaze o upali na biopsiji ili subkliničkoj ozljedi mjerenoj odsutnošću antitijela specifičnih za davatelja. Nitko nije imao HLA ili haploidentični transplantat jer je to bio kriterij isključenja za upis54. Svi uzorci prikupljeni su iz 12 različitih američkih programa pedijatrijske transplantacije između 2004. i 2006., prema protokolima koje je odobrio IRB. Studiju je također odobrio Human Research Protection Program (HRPP) Kalifornijskog sveučilišta u San Franciscu i Stanford Sveučilišta kako bi se omogućila analiza uzoraka biobanke. Svi pacijenti/staratelji dali su informirani pristanak za sudjelovanje u istraživanju, uz potpuno pridržavanje Helsinške deklaracije. Kliničke i istraživačke aktivnosti o kojima se izvještava u skladu su s načelima Istanbulske deklaracije kako je navedeno u Istanbulskoj deklaraciji o trgovini organima i transplantacijskom turizmu.

Izolacija gDNA i RNA. Uzorci krvi (4,5 ml) sakupljeni su u epruvetu s crvenim vrhom od 5 ml i inkubirani na sobnoj temperaturi 30 minuta do formiranja ugruška. Uzorak je zatim centrifugiran na 2000 × g tijekom 5 minuta pomoću rotirajućeg rotora. Gornji sloj seruma je zatim prebačen u drugu krioepruvetu, a ugrušak je pohranjen u istoj epruveti na -80 stupnjeva do upotrebe. Genomska DNK iz ugrušaka pune krvi ekstrahirana je korištenjem Clotspin Baskets i Gentra PuregeneBlood Kit (Qiagen, Valencia, CA).

Za ekstrakciju RNA izbubregbiopsija iglom (Qiagen, Valencia, CA) i pohranjena na -80 stupnjeva; ukupna RNA ekstrahirana je korištenjem glavne mješavine od 790 µl TRIzola i 10 µl glikogena. Uzorci tkiva su homogenizirani, inkubirani na 15 do 25 stupnjeva 5 minuta i dodano je 160 µl kloroforma za odvajanje faza. Smjesa je ponovno inkubirana na 25 stupnjeva 2 minute nakon čega je slijedilo centrifugiranje na 4 stupnja i korištena za ekstrakciju RNK pomoću RNeasy Micro Kita (Qiagen katalog br. 4004). Količina i cjelovitost RNK određeni su pomoću Thermo Scientific NanoDrop ND-2000 UV-Vis spektrofotometra i Agilent Bioanalyzera.

Sekvenciranje B-stanica. Pripremljene su PCR reakcije s uzorkom genomske DNA

od 100 ng alikvota gDNA za generiranje šest nezavisnih biblioteka s barkodom po uzorku. Korišteni su multipleksirani primeri za IgH J ili FR1 ili FR2 okvirne regije prema BIOMED-2 dizajnu55. Desetonukleotidne 'sekvencije barkoda' u početnicama korištene su za označavanje identiteta uzorka i identiteta replicirane biblioteke za svaku PCR reakciju. PCR je izveden s polimerazom AmpliTaq Gold (Roche) sa sljedećim programom: 94 stupnja 5 min; 35 ciklusa (94 stupnja za 30 s, 60 stupnjeva za 45 s, 72 stupnja za 90 s); i konačna ekstenzija na 72 stupnja 10 min. Provedena je druga PCR reakcija kako bi se osiguralo da se biblioteke nisu umnožile do zasićenja prije pročišćavanja gelom i sekvenciranja. Sveukupno, 0,4 ul svakog prvog PCR produkta uzorkovalo je drugu PCR reakciju korištenjem vanjskih početnica specifičnih za 454 linker sekvence; amplifikacija je provedena s programom: 94 stupnja tijekom 15 minuta, 12 ciklusa (94 stupnja tijekom 30 s, 60 stupnjeva tijekom 45 s, 72 stupnja tijekom 90 s), i konačna ekstenzija na 72 stupnja tijekom 10 minuta. Stopa pogreške AmpliTaq Golda trebala bi imati minimalan učinak na identifikaciju klonski povezanih sekvenci ili procjenu stopa somatskih mutacija u sekvencama kao što je objašnjeno negdje drugdje56. cDNA je sintetizirana iz ukupno 300 ng RNA uz priming nasumičnim heksamerima. Predlošci su umnoženi pomoću PCR-a korištenjem Biomed IGHV početnica u okviru 1 (FR1) i početnica specifičnih za izotip smještenih u prvom egzonu konstantnih regija. Ovi primeri18,57 također su kodirali približno polovicu Illumina linker sekvenci potrebnih za stvaranje klastera i sekvenciranje na instrumentu MiSeq. Identitet uzorka kodiran je crtičnim kodovima identifikatorskog multipleksa s osam nukleotida u svakoj početnici. Za prepoznavanje klastera Illumina, četiri randomizirana nukleotida kodirana su u početnicama neposredno nakon sekvence Illumina poveznice u početnicama konstantne regije. Svaki izotip protutijela za svaki uzorak umnožen je u zasebnoj PCR reakciji, kako bi se spriječilo stvaranje križnih izotipskih kimernih PCR proizvoda. PCR je proveden s AmpliTaq Gold (Roche) prema uputama proizvođača i korišten je program od 94 stupnja tijekom 7 minuta, 35 ciklusa od (94 stupnja tijekom 30 s, 58 stupnjeva tijekom 45 s, 72 stupnja tijekom 120 s) i konačni produženje na 72 stupnja 10 min. Drugi korak PCR-a korišten je za dodavanje preostalog dijela Illumina povezivača amplikonima i proveden je s Qiagen Multiplex PCR kompletom (Qiagen) u skladu s uputama proizvođača, koristeći 0,4 mikrolitara prvog PCR produkta kao predloška u 30 mikrolitara reakcije. PCR program za drugi korak PCR-a bio je 94 stupnja tijekom 15 minuta, 12 ciklusa od (94 stupnja tijekom 30 s, 60 stupnjeva tijekom 45 s, 72 stupnja tijekom 90 s), i konačna ekstenzija na 72 stupnja tijekom 10 minuta. Produkti svake PCR reakcije sakupljeni su u procijenjenim ekvimolarnim količinama, podvrgnuti elektroforezi na agaroznim gelovima i gel ekstrahiran s QIAquick kitovima (Qiagen). Visokopropusno sekvenciranje knjižnica s predlošcima genomske DNA provedeno je na platformi 454 (Roche) korištenjem Titanium kemije. Sekvenciranje biblioteke cDNA provedeno je na instrumentu Illumina MiSeq pomoću 600-setova za ciklus sekvenciranja. Potpuni popis početnica korištenih s MiSeq (M154 i M155) i 454 Titanium (T7) uključen je u Dodatnim podacima 1.

Očitavanja sekvenciranja obrađena su na sljedeći način: uparena očitavanja kraja spojena su korištenjem FLASH58 gdje su nakon toga sekvence demultipleksirane i odrezane od crtičnih kodova i IGHV početnih sekvenci. Regije V, D i J te spojevi V–D (N1), D–J (N2) identificirani su pomoću programa za poravnanje IgBLAST59. Sekvence su filtrirane kako bi se uklonili ne-IGH artefakti, sekvence s umetanjem ili brisanjem V gena, kimerne sekvence i nefunkcionalne sekvence. Na razini uzorka isključili smo one s<100 clones="" (defined="" by="" same="" v="" and="" j="" segments,="" same="" cdr3="" length,="" and="" 90%="" nucleotide="" identity)="" as="" a="" control="" for="" bad="" quality="" samples.="" after="" quality="" control,="" for="" gdna,="" we="" had="" complete="" longitudinal="" data="" for="" 69="" samples="" at="" times="" 0,="" 6,="" and="" 24="" with="" a="" total="" number="" of="" 327,703="" reads="" (mean="" 4045="" per="" sample).="" for="" cdna,="" we="" had="" complete="" data="" for="" 55="" matched="" samples,="" although="" no="" time="" 0="" samples="" were="" further="" available.="" in="" this="" case,="" we="" had="" isotype-="" specific="" information="" (1,773,330="" reads="" for="" igd="" (31,667="" per="" sample),="" 1,708,227="" reads="" for="" igm="" (30,504="" per="" sample),="" 973,444="" reads="" for="" iga="" (17,383="" per="" sample),="" 139,7345="" reads="" for="" igg="" (24,953="" per="" sample),="" and="" 29,000="" reads="" for="" ige="" (5,178="" per="">

Analiza raznolikosti. Raznolikost se mjeri bogatstvom vrsta s obzirom na broj klonova po uzorku. Ova mjera ne uzima u obzir učestalost svake vrste, pa smo također koristili Shannonovu entropiju (H) za mjerenje raznolikosti koja pruža

informacije o veličini distribucije vrsta u populaciji. H je definiran kao:

gdje je N broj jedinstvenih klonova, a pi je frekvencija klona i. H se kreće od 0 (uzorak sa samo jednim klonom) do Hmax ¼ log2N (uzorak s ravnomjernom distribucijom klonova).

Zatim smo upotrijebili opći linearni model kako bismo pronašli povezanost između bogatstva i entropije s kliničkim ishodom u različitim vremenskim točkama. Prilagodili smo ovaj model prema svim dostupnim kliničkim varijablama prikazanim u tablici 1 kako bismo bili sigurni da je bilo koja od karakteristika pacijenta zbunjujući čimbenik

Kako bismo modelirali longitudinalnu komponentu podataka, primijenili smo linearni model mješovitog učinka uzimajući u obzir model uvjetnog rasta kao što je prikazano na Dodatnoj slici 10. Da bismo primijenili ovaj model, koristili smo paket lme4 u R uzimajući u obzir interakciju između kliničkog ishoda i vremena do pronaći povezanost s bogatstvom i raznolikošću s time da je vrijeme slučajan učinak.

Kako bismo se pozabavili činjenicom da na mjere raznolikosti može utjecati problem nestalih vrsta (predstavljen je samo djelić milijardi stanica u repertoaru) te sekvencioniranje i eksperimentalne pogreške, izveli smo dvije strategije uz potpunu analizu podataka. Prvo smo upotrijebili alat Recon (rekonstrukcija procijenjenih klonova iz promatranog broja)29 kako bismo riješili problem nestalih vrsta. Recon je modificirana metoda maksimalne vjerojatnosti koja daje ukupnu raznolikost repertoara iz mjerenja na uzorku. Recon daje točne i robusne procjene skupa mjera raznolikosti, uključujući bogatstvo i entropiju, omogućujući snažne usporedbe raznolikosti između pojedinaca. Drugo, proveli smo strategiju smanjivanja uzorkovanja uzimajući nasumični podskup čitanja za svaki uzorak jednak najmanjoj veličini sekvenciranja, nakon čega je uslijedio ponovni izračun klonova B-stanica kako bismo prilagodili dubinu sekvenciranja i riješili moguće eksperimentalne pogreške. Za gDNA, postoje uzorci s vrlo niskim očitanjima (< 1000),="" a="" kako="" bismo="" izbjegli="" gubitak="" mnogih="" sekvenci="" i="" realnosti="" podataka,="" isključili="" smo="" ukupno="" devet="" uzoraka="" koji="" su=""><1000 reads.="" in="" the="" case="" of="" cdna,="" this="" was="" not="" necessary.="" we="" generated="" ten="" random="" subsamples="" to="" account="" for="" possible="" stochastic="" effects="" and="" performed="" the="" diversity="" analysis="" at="" each="" time="" point="" and="" the="" longitudinal="" data="" analysis="" on="" the="" mean="" value="" of="" ten="" independently="" downsampled="" diversity="">

Analiza mreže. Algoritam za generiranje mreže vrlo je sličan prethodno definiranom31. Ukratko, svaki vrh predstavlja niz B-stanica gdje je veličina definirana svim identičnim nizovima. Rubovi se izračunavaju korištenjem definicije klona (isti segmenti V i J, ista duljina CDR3 i 90 posto identičnosti nukleotida između CDR3) i klasteri predstavljaju svaki klon u repertoaru. Analiza je napravljena korištenjem paketa grafikona u R-u korištenjem izgleda_s_opcijom graphopt za generiranje grafikona.

Kako bismo kvantificirali mrežu, izračunali smo Ginijev indeks za veličinu vrhova i veličinu klastera. Ginijev indeks je mjera nejednakosti koja se intenzivno koristi za mjerenje raspodjele bogatstva. Mjeri nejednakost među vrijednostima distribucije frekvencija. Koristili smo Gini funkciju iz jednog paketa u R za izračunavanje Gini koeficijenta za veličinu vrhova i distribuciju veličine klastera. Gini koeficijent nula izražava savršenu jednakost, a Gini koeficijent 1 izražava maksimalnu nejednakost.

Klonska analiza. Kako bismo proučili specifične klonove povezane s kliničkim ishodima, napravili smo matricu sa svim klonovima koji su prisutni u više od jednog uzorka (ukupni broj=118,223) po svim uzorcima u svakoj vremenskoj točki. Zatim smo proučavali povezanost s kliničkim ishodom svakog pojedinog klona definirajući jednu varijablu po klonu kao prisutnu/neprisutnu. Konačno, primijenili smo Fisherov egzaktni test kako bismo uzeli u obzir značajnost u tablicama 2 × 3 za svaki klon u svakoj vremenskoj točki. Također smo proučavali postojanost klonova definiranih onim klonovima koji su u više od jedne vremenske točke u svakoj jedinki. Zatim, kako bismo objasnili razlike prema kliničkom ishodu, primijenili smo linearni model definirajući kao zavisnu varijablu broj klonova (za mjerenje razlika u postojanosti) i broj brojanja svakog klona (za mjerenje klonske ekspanzije) i klinički ishod kao nezavisni prediktor.

Analiza korištenja gena IGHV. Kako bismo proučili IGHV gene, procijenili smo upotrebu IGHV gena po uzorku kao broj upotrebe svakog gena normalizirano prema broju klonova kako bismo izbjegli pretjeranu zastupljenost određenih IGHV gena. Za statističku analizu, filtrirali smo one gene s vrlo niskom ekspresijom (IGHV upotreba/klonovi < {{0}}.05)="" u="" najmanje="" 10="" posto="" uzoraka.="" ukupno="" smo="" analizirali="" 27="" ighv="" gena="" koji="" odgovaraju="" 63="" uzorka.="" zatim="" smo="" primijenili="" linearni="" model="" kako="" bismo="" pronašli="" one="" gene="" koji="" su="" bili="" povezani="" s="" kliničkim="" ishodom="" u="" svakoj="" vremenskoj="" točki="" i="" ispravili="" te="" rezultate="" višestrukim="" testiranjem="" koristeći="" benjamini="" i="" hochberg="" fdr="">< 0,05.="" prilagodili="" smo="" ovaj="" model="" prema="" svim="" dostupnim="" kliničkim="" varijablama="" prikazanim="" u="" tablici="" 1="" kako="" bismo="" bili="" sigurni="" da="" je="" bilo="" koja="" karakteristika="" pacijenta="" zbunjujući="">

Sažetak izvješća. Dodatne informacije o dizajnu istraživanja dostupne su u Sažetku izvješća o istraživanju prirode povezanom s ovim člankom.

Reference

1.Cai,J.& Terasaki,PI Praćenje antitijela nakon transplantacije i HLA 1.(identifikacija epitopa antitijela. Curr.Opin.Immunol. 20,602-606(2008).

2. Sigdel, TK et al. Ne-HLA antitijela na imunogene epitope predviđaju razvoj kronične ozljede bubrežnog alografta.J. Am. Soc. Nephrol.23, 750-763 (2012).

3. Li, L. et al. Kompartmentalna lokalizacija i klinička važnost MICA protutijela nakon transplantacije bubrega. Transplantacija 89,312-319(2010).

4. Lamb, KE, Lodhi, S. & Meier-Kriesche, H.-U. Dugotrajno preživljavanje bubrežnog alografta u Sjedinjenim Državama: kritična ponovna procjena. Am.J. Presaditi. 11, 450-462(2011).

5. Znanstveni registar transplantiranih. Dostupno na: https://rtr. transplant.hrsa.gov/annual_reports/2012/Default.aspx.(Pristup: 24. svibnja 2018.) Pineda, S. et al. Nove ne-histokompatibilne nepodudarne varijante antigena

6. Poboljšati sposobnost predviđanja rizika odbacivanja posredovanog antitijelima kod transplantacije bubrega. Ispred. Immunol. 8, 1687 (2017).

7. Valuiskikh, A.Baldwin, WM & Fairchild, R.L. Nedavni napredak i nove perspektive u proučavanju odgovora T stanica na alografte. Am.J. Transplant.10, 117-1125 (2010).

8. Zarkhin, V, Chalasani, G. & Sarwal, MM Yin i yang B stanica u odbacivanju i toleranciji presatka. Transplant. Rev.24,67-78(2010).

9. Georgiou, G. et al. Obećanje i izazov visokoučinkovitog sekvenciranja repertoara plus antitijela. Nat. Biotechnol.32,158-168(2014).

10. Schroeder, HW Sličnost i razlika u razvoju i ekspresiji repertoara mišjih i ljudskih antitijela. Dev. Comp. Immunol. 30,119-135(2006).

11. Yaari, G. & Kleinstein, SH Praktične smjernice za analizu sekvenciranja repertoara receptora B-stanica. Genome Med.7,121(2015).

12. Shugay, M. i sur. VDJtools: Objedinjujuća post-analiza repertoara receptora T stanica. PLOS računalo. Biol.11, e1004503 (2015).

13. Alachkar, H. et al. Kvantitativna karakterizacija repertoara T-stanica i biomarkera kod odbacivanja transplantata bubrega. BMC Nephrol.17,181(2016). 14. Morris, H. et al. Praćenje donor-reaktivnih T stanica: Dokazi za klonsku deleciju u tolerantnih bolesnika s presađenim bubregom. Sci. prev. Med.7,272ral0 (2015).

15. Dziubianau, M. et al. Analiza repertoara TCR sekvenciranjem sljedeće generacije omogućuje složenu diferencijalnu dijagnozu patologije povezane s T stanicama. Am. J. Transplant.13, 2842-2854 (2013).

16. Palanichamy, A. et al. B stanice s promjenom klase imunoglobulina tvore aktivnu imunološku osovinu između CNS-a i periferije kod multiple skleroze. Sci. prev. Med.6, 248ra106-248ra106(2014).

17. Strauli, NB & Hernandez, RD Statistički zaključak konvergentnog repertoarnog odgovora protutijela na cjepivo protiv gripe. Genome Med. 8,60 (2016).

18. Roskin, KM i sur. IgH sekvence u uobičajenom varijabilnom imunološkom nedostatku otkrivaju izmijenjeni razvoj i selekciju B stanica. Sci. prev. Med.7,302ra135 (2015).

19.Massart, A., Ghisdal, L., Abramowicz, M. & Abramowicz, D. Operativna tolerancija u transplantaciji bubrega i povezani biomarkeri. Clin. Exp. Immunol.189,138-157(2017).

20. Beausang, JFet al. Repertoari B stanica u HLA-senzibiliziranih kandidata za transplantaciju bubrega koji su podvrgnuti terapiji desenzibilizacije.J. prev. Med.15, 9(2017).

21. Ferdman, J. i sur. Ekspanzija i somatska hipermutacija klonova B-stanica u odbačenim presacima ljudskog bubrega. Transplantacija 98,766-772(2014).

22. Vollmers, C. et al. Praćenje farmakološki inducirane imunosupresije sekvenciranjem imunološkog repertoara za otkrivanje akutnog odbacivanja alografta kod pacijenata s transplantiranim srcem: Studija dijagnostičke točnosti dokaza koncepta.PLOS Med. 12, e1001890 (2015).

23. Solez, K. et al. Izvještaj sa sastanka Banff'05: Diferencijalna dijagnoza kronične ozljede alografta i eliminacija kronične alograftske nefropatije (CAN). Am. J. Transplant.7,518-526(2007). imunosupresija kod transplantacije bubrega: je li vrijeme da se razmotri kao standardna terapija? Kidney Int.76,825-830(2009).

28. Legendre, C. et al. Trogodišnji ishodi kod pacijenata s presađenim bubregom randomiziranih na imunosupresiju bez steroida ili prekid uzimanja steroida, s mikofenolatom obloženim crijevom i ciklosporinom: beskonačna studija. J. Transplant.2014,1-8(2014).

29. Kaplinsky, J. & Arnaout, R. Robusne procjene ukupne raznolikosti imunološkog repertoara iz mjerenja visoke propusnosti na uzorcima. Nat. Commun.7, 11881(2016).

30. Stern, JNH et al. B stanice koje naseljavaju mozak oboljelog od multiple skleroze sazrijevaju u drenažnim cervikalnim limfnim čvorovima. Sci. prev. Med.6,248ra107 (2014).

31. Bashford-Rogers, RJMet sur. Mrežna svojstva izvedena iz dubokog sekvenciranja repertoara ljudskih B-staničnih receptora ocrtavaju populacije B-stanica. Genome Res.23,1874-1884 (2013).

32. Sarwal, Met al. Molekularna heterogenost u akutnom odbacivanju bubrežnog alografta

identificiran profiliranjem DNK mikronizova. N.Engl.J. Med.349,125-138(2003). 33. Zarkhin, V., Lovelace, PA, Li, L., Hsieh, S.-C. & Sarwal, MMPhenotipska procjena podskupa b-stanica nakon rituksimaba za liječenje akutnog odbacivanja bubrežnog alografta u pedijatrijskih primatelja. Transplantacija 91,1010-1018 (201).

34. Clatworthy, MR& Targeting, B. Stanice i antitijela u transplantaciji. Amm. J. Transplant.11,1359-1367 (2011).

35. Dijke, EI et al.Bcells in transplantation.J. Heart Lung Transplant.35,704-710(2016).

36. Nankivell, BJ & Kuypers, DDR Dijagnostika i prevencija kroničnog gubitka alografta bubrega. Lancet 378,1428-1437(2011).

37. Patin, E. et al. Prirodne varijacije u parametrima urođene imunološke stanice prvenstveno su potaknute genetskim čimbenicima. Nat.Immunol.19,302-314(2018). 38. Liston, A. & Goris, A. Porijeklo raznolikosti u ljudskom imunitetu.Nat. Immunol. 19,209-210(2018).

39. Meier-Kriesche, H.-U, Schold, JD, Srinivas, TR & Kaplan, B. Nedostatak poboljšanja u preživljavanju bubrežnog alografta unatoč značajnom smanjenju akutnih stopa odbacivanja u posljednje vrijeme. Am.J. Transplant.4, 378-383 (2004).

40. Keith, DS, Vranic, G. & Nishio-Lucar, A. Funkcija presatka i srednjoročni ishodi transplantacije bubrega poboljšani su u posljednjem desetljeću: Analiza baze podataka o transplantaciji bubrega u Sjedinjenim Državama. Presaditi. izravni 3,el66 (2017).

41. Bomben, R. i sur. Ekspresija mutiranih IGHV3-23 gena u kroničnoj limfocitnoj leukemiji identificira podskup bolesti s posebnim kliničkim i biološkim značajkama. Clin. Cancer Res. 16,620-628(2010).

42. Levinson, AI, Kozlowski, L, Zheng, Y. & Wheatley, L. B-stanični superantigeni: definicija i potencijalni utjecaj na imunološki odgovor.J. Clin.Immunol.15, 26S-36S(1995.

43. Silverman, GJ & Goodyear, CSA model B-staničnog superantigena i imunobiologija B limfocita. Clin.Immunol.102,117-134(2002).

44. Silverman, GJ & Goodyear, CS Confounding obrana B-stanica: lekcije iz stafilokoknog superantigena. Nat. Rev. Immunol.6,465-475(2006). 45. Cheng, J. et al. Ektopične nakupine B-stanica koje se infiltriraju u transplantirane ljudske bubrege su klonalne. Proc. Natl Acad. Sci. 108, 5560-5565 (2011).

46. ​​Grover, RK i sur. Kostimulacijski imunogen LPS inducira klonove B-stanica koji se infiltriraju u transplantirane ljudske bubrege. Proc. Natl Acad. Sci. SAD 109, 6036-6041(2012).

47, Modena, BDet al. Promjene u populaciji urinarnog mikrobioma koreliraju u transplantaciji bubrega s intersticijskom fibrozom i tubularnom atrofijom dokumentiranom u ranim nadzornim biopsijama. Am. J. Transpl.17, 712-723 (2017).

48. Chen, K. & Cerutti, A. Novi uvidi u enigmu imunoglobulina D. Immunol. Rev. 237, 160-179 (2010).

49. Chen, K. i sur. Imunoglobulin D pojačava imunološki nadzor aktiviranjem antimikrobnih, proupalnih programa i programa stimulacije B stanica u bazofilima. Nat. Immunol. 10, 889-898(2009).

50. Mack, M. & Rosenkranz, AR Bazofili i mastociti kod oštećenja bubrega. KidneyInt.76, 1142-1147 (2009).

51. Nixon, DFet al. Molekularno praćenje virusa humane imunodeficijencije

nef specifični citotoksični T-stanični klon pokazuje postojanost klon-specifičnog T-staničnog receptora DNA, ali ne i mRNA nakon rane kombinirane antiretrovirusne terapije. Immunol. Lett.66,219-228(1999).

52. Dharnidharka, VR, Fiorina, P. & Harmon, WEK Transplantacija bubrega u djece.N.Engl. J. Med. 371, 549-558(2014).

53. Sarwal, MMet al. Potpuno izbjegavanje steroida učinkovito je i sigurno u djece s transplantiranim bubrezima: multicentrično randomizirano ispitivanje s trogodišnjim praćenjem. Am.J.Transplant.12,2719-2729(2012).

24. Solez, K. et al. Banff 07 klasifikacija patologije bubrežnog alografta: ažuriranja i budući smjerovi. Am.J.Transplant.8, 753-760 (2008).

54. Li, L i sur. imunosupresija bez steroida od 1999:129 pedijatrijski bubrežni transplantatori s dugotrajnim dobrobitima transplantata i pacijenata. Am.J. Transpl. 9, 1362-1372(2009).

25. Chaudhuri, A. et al. Klinički utjecaj humoralne imunosti u pedijatrijskoj transplantaciji bubrega.J. Am. Soc.Nephrol.24, 655-664 (2013).