Sažetak:Zabilježeno je da korijenje Vitis amurensis ima potencijal za izbjeljivanje kože kroz procjenu melanogeneze i inhibicijskih aktivnosti tirozinaze. U ovoj studiji, korijenje V. amurensis korišteno je za brzi odabir sastojaka za izbjeljivanje korištenjem LC-Q-TOF-MS u kombinaciji s testom inhibicije tirozinaze i za optimiziranje procesa ekstrakcije za upotrebu kao funkcionalnog materijala za izbjeljivanje kože metodologijom površine odgovora. Rezultati su pokazali da korijenje V. amurensis pokazuje inhibicijski učinak na tirozinazu pomoću dva oligomera stilbena, ε-vinifera (1) i vitamina B (2), kao što je predviđeno pomoću LC-Q-TOF-MS zajedno s biološkim testom. Optimalni uvjeti ekstrakcije (koncentracija metanola 66 posto, volumen otapala 140 mL i vrijeme ekstrakcije 100 minuta) za sastojke za izbjeljivanje kože uspostavljeni su s prinosima od 6,20 posto, a inhibitorna aktivnost tirozinaze bila je 87,27 posto. Odnos između svakog faktora i njegovog odgovarajućeg odgovora potvrđen je Pearsonovom korelacijskom analizom. Volumen otapala pokazao je jasnu linearnu povezanost s prinosima, a koncentracija metanola imala je snažnu linearnu povezanost s inhibitornom aktivnošću tirozinaze za spojeve 1 i 2, kao i njihovu kombinaciju. Sve u svemu, dokazano je da LC-Q-TOF-MS zajedno s biološkim testom ima potencijal za učinkovito pronalaženje novih aktivnih sastojaka, kao i poznatih aktivnih sastojaka; vitamini se mogu predložiti kao novi prirodni potencijalni agens za izbjeljivanje.

Prema relevantnim studijama,cistancheje uobičajena biljka koja je poznata kao "čudotvorna biljka koja produžuje život". Njegova glavna komponenta jecistanozid, koji ima različite učinke kao nprantioksidans, protuupalno, ipromicanje imunološke funkcije. Mehanizam između cistanhe iizbjeljivanje koželeži u antioksidativnom učinku cistanheglikozidi. Melanin u ljudskoj koži nastaje oksidacijom tirozina koju kataliziratirozinaza, a reakcija oksidacije zahtijeva sudjelovanje kisika, pa radikali bez kisika u tijelu postaju važan čimbenik koji utječe na proizvodnju melanina. Cistanche sadržicistanozid, koji je antioksidans i može smanjiti stvaranje slobodnih radikala u tijelu, čime inhibira proizvodnju melanina.

Kliknite na Cistanche Sold Near Me

Za više informacija:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Ključne riječi:Vitis amurensis; LC-Q-TOF-MS spojen s testom inhibicije tirozinaze; metodologija odzivne površine; Pearsonova korelacija

1. Uvod

Melanin je odgovoran za boju kože i dlake sisavaca i štiti kožu od ultraljubičastih zraka, ali prekomjerna proizvodnja melanina i nakupljanje melanina u koži uzrokuju poremećaje hiperpigmentacije kože kao što su pjege, melazma, staračke pjege, efelidi i senilni lentigini. Tirozinaza, poznata kao enzim oksidaza koji sadrži bakar, ima ključnu ulogu u biosintezi melanina. Enzim je katalizirao dvije uzastopne reakcije oksidacije: prvi korak, hidroksilacija L-tirozina u 3,4-dihidroksi-L-fenilalanin (L-DOPA), i drugi korak, oksidacija L-DOPA u dopakinon. Dopakinon je vrlo reaktivna tvar koja može spontano polimerizirati i stvarati melanin [1–3]. Stoga se inhibitori tirozinaze mogu koristiti kao tretmani za kožne poremećaje povezane s hiperpigmentacijom i kao sredstva za izbjeljivanje kože.

Vitis amurensis, samonikla vrsta vinove loze, uglavnom je rasprostranjena u Aziji (Koreja, Kina i Japan). Potpuno zreli plodovi konzumiraju se sirovi, a sadrže obilje hranjivih tvari poput saharoze, glukoze, bjelančevina i vitamina, pa se koriste kao sirovina za vino, sok, žele i džem. Osim toga, njegovi listovi se koriste u salati [4]. Njegovi korijeni i stabljike korišteni su kao tradicionalni lijek za liječenje raka, neuralgičnih bolova i bolova u trbuhu [5,6]. Njegovo korijenje sastoji se od stilbena (glavni sastojak), procijanidina, flavonoida, triterpenoida i drugih fenolnih spojeva. Do sada je kemijski sastav korijena dovoljno detaljno proučavan. Konkretno, prijavljeni su različiti oligomeri stilbena, uključujući resveratrol, amurensin A, vitamin A, (plus)-ε-vinifera, amurenzine C–M, ampelopsin A, D i ampelopsin E [6]. Metanolni ekstrakt korijena pokazuje antimelanogeni učinak protiv melanogeneze inducirane melanocitnim hormonom u stanicama B16F10 i u oksidaciji 3,4-dihidroksifenilalanina (L-DOPA) putem tirozinaze gljiva [7]. Dodatno, ekstrakti V. amurensis i njihovi aktivni spojevi pokazuju antioksidativne, protuupalne, neuroprotektivne i antitumorske učinke [7-10].

LC-MS u kombinaciji s biološkim testom može istovremeno potvrditi kemijski profil i biološku aktivnost komponenti u prirodnim proizvodima bez potrebe za ekstrakcijom i izolacijom. Stoga se nedavno koristi za učinkovito i brzo identificiranje bioaktivnih spojeva u prirodnim proizvodima [11-13].

Optimizacija je proces koji omogućuje maksimalnu učinkovitost eksperimentalnih sustava ili proizvoda. Metodologija površine odziva (RSM), multivarijatna analiza, dizajn eksperimenata korištenjem matematičkih i statističkih tehnika temeljenih na empirijskim modelima i izražavanje korelacije između eksperimentalnog dizajna i rezultata kao polinomske funkcije, neke su od tehnika koje pružaju idealne uvjete optimizacije uz maksimalnu učinkovitost. RSM je točna i učinkovita metoda optimizacije koja se široko koristi u raznim područjima, uključujući preradu hrane, kemiju, biologiju i poljoprivredu [14-16]. Tijekom proteklih desetljeća porastao je interes za farmaceutske proizvode, kozmetiku i funkcionalnu hranu koja sadrži prirodne proizvode; posljedično, u tijeku su istraživanja u akademskoj zajednici i industriji usmjerena na razvoj takvih proizvoda [17,18]. Prvi korak u ovim studijama uključuje ekstrakciju bioaktivnog sastojka iz prirodnih proizvoda. U ovom trenutku, budući da brojni čimbenici kao što su vrijeme ekstrakcije, temperatura, omjer tekućine i krutine i volumen otapala utječu na ekstrahirane sastojke, potrebna je optimizacija za maksimalno ekstrahiranje bioaktivnih sastojaka.

Prema našim saznanjima, sastojci inhibitori tirozinaze i optimizacija ekstrakata korijena V. amurensis rijetko su zabilježeni [5,19]. Stoga je cilj ove studije bio brzo dobivanje inhibitora tirozinaze iz korijena V. amurensis korištenjem LC-Q-TOF-MS u kombinaciji s testom inhibicije tirozinaze i optimiziranje uvjeta ekstrakcije za proširenje upotrebe korijena V. amurensis kao sredstva za izbjeljivanje kože od RSM.

2. Rezultati i rasprava

2.1. LC-QTOF MS u kombinaciji s testom inhibicije tirozinaze korištenjem ekstrakta korijena V. amurensis

Ekstrakt korijena V. amurensis s 80 posto MeOH pokazao je značajno inhibitorno djelovanje na tirozinazu (80,7 ± 0,8 posto pri 50 µg/mL, tablica S1). Za identifikaciju spojeva koji inhibiraju tirozinazu u korijenu V. amurensis bez izolacije, provedena je LC-QTOF-MS spojena s testom inhibicije tirozinaze. Kemijski profil ekstrakta korijena V. amurensis dobiven je u prvom ciklusu (Slika S1), a bioaktivni spojevi identificirani su pomoću testa inhibicije tirozinaze frakcija prikupljenih svakih 30 s iz drugog ciklusa (Slika 1). Postojala su dva pika između 19 i 22 minute na masenom kromatogramu za koje je predviđeno da imaju značajno inhibitorno djelovanje na tirozinazu, a njihove strukture identificirane su kao stilben dimer (1) i stilben tetramer (2) pomoću kemijskog profiliranja (Tablica 1).

2.2. Identifikacija inhibitornih sastojaka tirozinaze korijena V. amurensis

Najprije su iz frakcije EtOAc izolirana dva sastojka za koje se očekuje da imaju aktivnost inhibiranja tirozinaze, te je procijenjena njihova bioaktivnost. Strukture izoliranih spojeva 1 i 2 identificirane su kao ε-vinifera (1) [20,21] i vitamin B (-vinifera, 2) [21-23], koristeći 1H-NMR, 13C-NMR i ESI-MS (Slika 2, Slike S2 ​​i S3 i Tablica S2). U testu inhibicije tirozinaze, IC50 vrijednosti spojeva 1, 2 i kojične kiseline bile su 3,51, 10,74, odnosno 27,09 µM. Oba spoja pokazala su jače inhibitorne učinke tirozinaze od pozitivne kontrole, kojične kiseline koja je poznati sastojak za izbjeljivanje kože (tablica 1 i slika S4). U prijašnjim studijama je objavljeno da ε-vinifera (1) ima inhibitornu aktivnost tirozinaze [23]; međutim, vitamin B (2) je prvi put identificiran u našoj studiji.

Sve u svemu, rezultati, u korelaciji s predviđenim podacima LC-MS zajedno s testom inhibicije tirozinaze i vitaminom B (2), pokazuju potencijal kao novi inhibitor tirozinaze. Nadalje, istraživanja molekularnog spajanja provedena su kako bi se potvrdio rezultat značajne inhibitorne aktivnosti tirozinaze dva oligomera stilbena. Kao što je prikazano u tablici 1, spojevi 1 i 2 pokazali su viši rezultat spajanja od pozitivne kontrole, kojične kiseline, što je u skladu s našim eksperimentalnim podacima. Međutim, rezultati spajanja spojeva bili su u suprotnosti s našim eksperimentalnim rezultatima. Načini interakcije spojeva 1 i 2 opisani su na slici 3. Spoj 1 formirao je 4 vodikove veze, 2 hidrofobne interakcije i 1 interakciju pi-lonskog para, a spoj 2 je stvorio 11 vodikovih veza, 7 hidrofobnih interakcija, 1 van der Waalsovu interakciju i 3 interakcije pi-usamljenog para. Kao rezultat, potvrđeno je da se spojevi mogu umetnuti u aktivno mjesto ciljanog proteina i vezati na katalitičke aminokiselinske ostatke koji mogu inhibirati aktivnost tirozinaze. Dodatno, ε-vinifera (1) se navodi kao kompetitivni inhibitor koji se veže na isto mjesto na kojem se L-DOPA veže za tirozinazu [23]. Uočeno je da se vitamin B (2) veže na isto mjesto kao i ε-vinifera (1), što potvrđuje da je vitamin B (2) novi kompetitivni inhibitor.

2.3. Optimizacija ekstrakcije korijena V. amurensis pomoću RSM

Za korištenje korijena V. amurensis kao funkcionalnog materijala za izbjeljivanje kože, Box-Behnken dizajn (BBD) osmislio je optimalne uvjete ekstrakcije kako bi se maksimizirao prinos ekstrakcije i inhibitorna aktivnost tirozinaze. Učinci neovisnih odgovora kao što su prinos ekstrakcije, inhibitorna aktivnost tirozinaze, količina spoja 1, količina spoja 2 i količina zbroja spojeva 1 i 2, na tri neovisne varijable (vrijeme ekstrakcije, koncentracija MeOH/voda i volumen otapala), izmjereni su (Tablica 2). Raspon varijabli postavljen je kao vrijeme ekstrakcije (40, 70 i 100 min), koncentracija MeOH (40, 70 i 100 posto) i volumen otapala ( 35, 87,5 i 140 mL) na temelju preliminarnog eksperimenta s jednim faktorom (podaci nisu prikazani). Vrijednosti dobivene iz dizajniranih eksperimenata izražene su kao polinomi korelacija između varijabli korištenjem regresijske analize (tablice S4-S13 i slika S5). Kao rezultat izvođenja pojedinačne optimizacije za svaku reakciju (tablica 3), očekivano je da će prinos predstavljati 6,21 posto kada se ekstrahira s 100.00 min, MeOH 64,78 posto, 140.{{42} } mL. Inhibicijska aktivnost tirozinaze (postotak) ekstrahirana je 65,22 min, MeOH 100.00 posto, 140.00 mL uvjetima, a predviđeno je da će pokazati vrijednost od 90,37 posto. Količina spoja 1 na 65,74 min, MeOH 100.00 posto, 35,00 mL predviđena je kao 37,45 µg/mg, a količina spoja 2 na 70,00 min, MeOH 70,00 posto i 92,24 mL je predviđen kao 86.77 µg/mg. Dodatno, očekivalo se da će ukupni sadržaji spojeva 1 i 2 pokazati maksimalnu vrijednost od 108,10 µg/mg kada su ekstrahirani pod uvjetima od 75,20 min, MeOH 100,00 posto i 35,00 mL. Eksperimenti temeljeni na optimiziranim uvjetima dali su 6,19 ± 0,36 posto, inhibitornu aktivnost tirozinaze 91,72 ± 3,48 posto, sadržaj spoja 1 36,54 ± 1,78 µg/mg, sadržaj spoja 2 85,74 ± 16,57 µg/mg, a zbroj spojeva 1 i {{85} }.10 ± 19,11 µg/mg je dobiveno, a pojedinačni odgovori za svaku varijablu pokazali su razliku od 5 posto ili manje od teoretski predviđenih vrijednosti. Provedena je optimizacija višestrukog odgovora kako bi se maksimizirao prinos ekstrakcije i inhibitorna aktivnost tirozinaze (Tablica 3). Optimizirani uvjeti bili su sljedeći: vrijeme ekstrakcije, 100 min; koncentracija MeOH, 66,38 posto; i volumen otapala, 140 mL. Koristeći ove uvjete, utvrđeno je da je prinos bio 5,95 ± 1,13 posto, a inhibitorna aktivnost tirozinaze bila je 85,93 ± 1,57 posto; te su vrijednosti bile slične predviđenim vrijednostima, 6,20 odnosno 87,25 posto. Dodatno, korelacija između svake varijable i odgovarajućeg odgovora analizirana je pomoću Pearsonove korelacije (Tablica 4). Iskorištenje ekstrakcije pokazalo je jasan linearni odnos između vremena ekstrakcije i koncentracije MeOH i negativan linearni odnos s količinom spoja 1. Dodatno, inhibicijska aktivnost tirozinaze pokazala je jak linearni odnos između količine spoja 2 i količine sume spojeva 1 i 2 i jasan linearni odnos sa spojem 1. Prema tome, inhibitorna aktivnost korijena V. amurensis na tirozinazu bila je proporcionalna i spoju 1 i 2, ali je pokazala jači linearni odnos s količinom spoja 2 nego spoja 1.

3. Materijali i metode

3.1. Opći eksperimentalni postupci

Srednjetlačna tekućinska kromatografija (MPLC) provedena je korištenjem Biotage Isolera (Biotage AB, Uppsala, Švedska). Jedan sustav opremljen je visokoučinkovitom pumpom za flash kromatografiju (HPFC), promjenjivim detektorom s dvije valne duljine i kolektorom. NMR spektri su dobiveni pomoću Bruker SPECTROSPIN 300 MHz spektrometra (Bruker Corporation, Billerica, MA, SAD). Metanol-d4, NMR otapalo, kupljeno je od Cambridge Isotope Laboratories, Inc. Acetonitril (ACN), voda i metanol (MeOH) kromatografske čistoće kupljeni su od ThermoFisher Scientific Korea Ltd. (Seul, Republika Koreja). L-tirozin, tirozinaza gljiva, kojična kiselina i mravlja kiselina kupljene su od Sigma–Aldrich Co (St. Louis, MO, SAD).

3.2. Biljni materijal

Korijen V. amurensis dobiven je iz Gyeongbuka, Koreja, a također je kupljen od Omniherba (Daegu, Republika Koreja). Identificirao ih je dr. prof. Ki Yong Lee, s Farmaceutskog fakulteta na Korejskom sveučilištu. Uzorak vaučera (KUP-HD071) pohranjen je u Laboratoriju za farmakognoziju Farmaceutskog fakulteta Korejskog sveučilišta.

3.3. LC-Q-TOF masena spektrometrija

LC je provedena korištenjem serije Agilent 1260 (Agilent, Santa Clara, CA, SAD) koja se sastoji od binarne pumpe, mrežnog degasera, automatskog uzorkovača, termostatski kontroliranog odjeljka kolone i detektora niza fotodioda. Kromatografsko odvajanje provedeno je korištenjem Shiseido CapCell PAK C18 kolone (5 µm, 4,6 mm, ID × 150 nm). Mobilna faza sastojala se od vode (otapalo A) i ACN (otapalo B), a oboje su sadržavali 0.1 posto mravlje kiseline. Uvjeti gradijenta bili su sljedeći: 0–5 min, 10 posto B, 5–30 min, i linearno povećanje B od 10 do 90 posto. Brzina povrata je postavljena na 0,6 mL/min; 5 µL i 20 µL uzoraka ubrizgano je za LC-Q-TOF-MS analizu, odnosno LC-Q-TOF-MS spojeno s testom inhibicije tirozinaze. Masena spektrometrija je provedena uporabom masenog spektrometra Agilent 6530 Q-TOF (Agilent, Santa Clara, CA, SAD) s elektrosprej ionizacijskim (ESI) sučeljem u negativnom načinu rada. Podaci o rasponu mase od m/z 50–1000 prikupljeni su u centroidnom načinu. Parametri mase bili su sljedeći: kapilarni napon, 4000 V; tlak nebulizatora, 40 psi; napon fragmenta, 175 V; napon skimmera, 65 V; temperatura plina za sušenje, 325 ◦C; sporedna brzina plina za sušenje, 12,0 L/min; energija sudara 10, 20, 30 i 40 eV. Podešavanje parametara prikupljanja i obrada podataka provedeni su korištenjem LC-MS/MS prikupljanja podataka korištenjem 6530 serije Q-TOF (verzija B.05.00) (softver MassHunter Workstation, Agilent, Santa Clara, CA, SAD).

3.4. LC-Q-TOF-MS u kombinaciji s testom inhibicije tirozinaze

LC-Q-TOF-MS u kombinaciji s testom inhibicije tirozinaze proveden je pomoću metode utvrđene u prethodnoj studiji [24]. Ukratko, test se odvijao u dva ciklusa. U prvoj fazi, kemijski profil uzorka dobiven je pomoću LC-Q-TOF-MS. U sljedećem ciklusu, eluat je nakon prolaska kroz LC sustav pod navedenim uvjetima LC-Q-TOF sakupljen u 96-jažične ploče svakih 30 s. Inhibicijska aktivnost tirozinaze sakupljenih frakcija procijenjena je korištenjem testa inhibicije tirozinaze.

3.5. Izolacija spojeva inhibitora tirozinaze iz korijena V. amurensis

Za izolaciju spojeva koji inhibiraju tirozinazu identificiranih pomoću LC-Q-TOF-MS zajedno s testom inhibicije tirozinaze, korijen V. amurensis (3.01 kg) ekstrahiran je tri puta s 80 posto MeOH 60 min na sobnoj temperaturi korištenjem ultrazvučne obrade. Ekstrahirano otapalo je filtrirano i koncentrirano kako bi se dobio sirovi ekstrakt (215,7 g), koji je suspendiran u vodi i sekvencijalno razdijeljen pomoću n-heksana, etil acetata (EtOAc) i n-BuOH. Frakcija EtOAc (25,85 g) podvrgnuta je kromatografiji na stupcu silikagela upotrebom n-heksan:EtOAc pod uvjetima gradijenta (20:1 → 0:1) da bi se dobilo sedam frakcija (E1–E7). Frakcija E4 odvojena je pomoću MPLC i 100 g SNAP KP-Sil, uloška sa silika gelom i diklorometana: MeOH pod uvjetima gradijenta (97:3 → 0:100) da bi se dobilo sedam podfrakcija (E4–1 do E4–7) . Spoj 2 (417,0 mg) dobiven je iz E4–5. Subfrakcija E4–4 ponovno je kromatografirana na MPLC pomoću SNAP 25 g Ultra, uloška sa silika gelom i kloroforma:MeOH:H2O pod uvjetima gradijenta (50:4:1 → 15:4:1) da bi se dobilo sedam frakcija ( E4–4–1 do E4–4–7). Spoj 1 (396,0 mg) dobiven je iz E4–4–5, koji je promatran kao jedna točka na ploči za tankoslojnu kromatografiju (TLC).

3.6. Test inhibicije tirozinaze

Inhibicijska aktivnost tirozinaze procijenjena je prethodno opisanom metodom uz male modifikacije [25]. Dva mikrolitra uzorka i 50 µL 0.1 U/µL tirozinaze gljive tretirani su u 96-pločama s jažicama i inkubirani na 37 ◦C. Nakon 15 minuta, dodano je 50 µL 1 mM L-tirozina i zatim je reagirao na 37 ◦C tijekom 15 minuta. Količina stvorenog dopakroma izmjerena je na 495 nm pomoću čitača mikropločica Spectra Max 19{{20}} (Molecular Devices, San Jose, CA, SAD). Inhibicijska aktivnost tirozinaze izračunata je pomoću sljedeće jednadžbe: inhibicija tirozinaze ( postotak )=[1 − (S − S0)/(C − C0)] × 100, gdje je S apsorbancija uzorka, tirozinaze i L -tirozin; S0 je apsorbancija uzorka i L-tirozina; C je apsorbancija tirozinaze i L-tirozina, a C0 je apsorbancija L-tirozina. Kojična kiselina, poznati inhibitor tirozinaze, korištena je kao pozitivna kontrola. Vrijednosti IC50 izračunate su korištenjem GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, SAD).

3.7. Molecular Docking Studies

Molekularno spajanje provedeno je pomoću softvera SYBYL-X 2.1.1 (Tripos Ltd., St. Louis, MO, SAD) s kristalnim strukturama PPO3, tirozinaze iz Agaricus bisporusa (Protein Data Bank (PDB) ID: 2Y9W). Sve molekule vode ciljnog proteina su uklonjene, a priprema liganda je provedena protokolom pripreme "sanitize" u SYBYL-X 2.1.1. Afinitet protein-ligand izračunat je pomoću Tripos polja sile i izražen kao ukupni rezultati. Usidrena poza liganda iz kompleksa protein-ligand vizualizirana je u programu Discovery Studio 2017 R2 Client (Biovia Co., San Diego, CA, SAD).

3.8. Dizajn eksperimenta i statistička analiza

Optimizirani uvjet za ekstrakciju sastojaka s maksimalnom inhibicijskom aktivnošću tirozinaze iz korijena V. amurensis uspostavljen je korištenjem BBD-a s tri varijable i tri razine (MINITAB izdanje 14.12.0 Statistički softver). Na temelju preliminarnih rezultata jednofaktorskog eksperimenta odabrane su nezavisne varijable uključujući vrijeme ekstrakcije (X1), koncentraciju MeOH i vode (X2) i volumen tekućine (X3), te niz njihovih varijabli (tablica S3). Varijable za RSM kodirane su korištenjem tri razine, -1, 0 i 1. Ukupno je osmišljeno 15 eksperimenata uključujući 3 replika u središtu dizajna (Tablica 2). Kao neovisni odgovori, mjereni su prinos (postotak), inhibitorna aktivnost tirozinaze (postotak), količina spoja (1) (µg/mg) i količina spoja (2) (µg/mg). Inhibicijska aktivnost ekstrakta na tirozinazu procijenjena je pri koncentraciji od 50 µg/mL. Svaki odgovor izražava se pomoću sljedeće polinomske jednadžbe drugog reda:

gdje R označava odgovor; 1, 2 i 3 su linearni koeficijenti; 12, 23 i 13 su koeficijenti interakcije između tri varijable; a 11, 22 i 33 su kvadratni koeficijenti.
Nadalje, provedena je Pearsonova korelacijska analiza kako bi se utvrdilo postojanje linearne veze između svake varijable i odgovora. Pearsonov koeficijent korelacije ima snažan linearni odnos između {{0}}.7 i 1.0, jasan linearni odnos između 0.3 i 0.7, slab linearni odnos između {{10}}.1 i 0.3, i nikakav ili zanemariv linearni odnos između 0.0 i 0.1. Pozitivna i negativna korelacija izražavaju se ovisno o tome je li Pearsonov koeficijent korelacije pozitivan ili negativan.

3.9. Kvantitativna analiza spojeva 1 i 2 koji inhibiraju tirozinazu

Količina svakog spoja 1 i 2 u ekstraktima dobivenim korištenjem dizajniranih 15 eksperimentalnih uvjeta izmjerena je pomoću kalibracijskih krivulja (Tablica 2). Kalibracijske krivulje za spojeve 1 i 2 određene su korištenjem površine ispod krivulje UV kromatograma (330 nm dobivene pri koncentracijama od 0,1–1000 µg/mL odnosno 7,81–1000 µg/mL). LC je proveden korištenjem Waters 2695 LC sustava (Waters, Santa Clara, CA, SAD) uz iste uvjete kao oni za LC sustav detaljno opisan u materijalima i metodama, LC-Q-TOF masena spektrometrija.

4. Zaključci

ε-Viniferin (1) i vitamin B (2) iz korijena V. amurensis okarakterizirani su kao sastojci koji izbjeljuju kožu pomoću LC-Q-TOF-MS u kombinaciji s testom inhibicije tirozinaze. Konkretno, vitamin B (2) prvi je put identificiran kao spoj koji inhibira tirozinazu u ovoj studiji, a ε-vinifera (1) i vitamin B (2) pokazali su jače inhibicijske učinke na tirozinazu od pozitivne kontrole, kojične kiseline. Uvjeti optimizacije s maksimalnim inhibicijskim učinkom tirozinaze i prinosom korijena V. amurensis utvrđeni su korištenjem vremena ekstrakcije (100 min), koncentracije MeOH (66,38 posto) i volumena tekućine (140 mL). Rezultat je pokazao dobru podudarnost između eksperimentalnih i predviđenih vrijednosti. Posljedično, LC-Q-TOF-MS u kombinaciji s biološkim testom pokazao je potencijal za učinkovito pronalaženje novih aktivnih sastojaka, kao i poznatih aktivnih sastojaka, vitamina B (2), koji se može predložiti kao novi prirodni potencijalni agens za izbjeljivanje.

Dopunski materijali: Sljedeće je dostupno online, Slika S1: MS kromatogram u načinu negativne ionizacije (A); UV kromatogram na 280 nm (B) ekstrakata korijena V. amurensis, Slika S2: 1H- i 13C-NMR spektri spoja 1 (300 i 75 MHz, CD3OD), Slika S3: 1H- i 13C-NMR spektri spoja 2 (300 i 75 MHz, CD3OD), Slika S4: Sigmoidalni dijagram i IC50 pozitivne kontrole, spojevi 1 i 2, Slika S5: Grafički prikaz površine odgovora i konture koji pokazuju učinak parametara ekstrakcije (X1: vrijeme ekstrakcije, min; X2: Koncentracija MeOH, postotak; X3: volumen otapala, mL). (A) prinos; (B) inhibitorna aktivnost tirozinaze; (C) spoj 1; (D) spoj 2; (E) zbroj spojeva 1 i 2, tablica S1. Inhibicijska aktivnost ekstrakata korijena V. amurensis na tirozinazu, Tablica S2: 1H- i 13C NMR podaci spojeva 1 i 2 u CD3OD (δ u ppm), Tablica S3: Neovisne varijable i razine za metodologiju površine odgovora, Tablica S4: Procijenjena regresija koeficijent za prinos, Tablica S5: Analiza varijance za prinos, Tablica S6: Procijenjeni koeficijent regresije za inhibitornu aktivnost tirozinaze, Tablica S7: Analiza varijance za inhibitornu aktivnost tirozinaze, Tablica S8: Procijenjeni koeficijent regresije za spoj 1, Tablica S9: Analiza varijanca za spoj 1, tablica S10: Procijenjeni koeficijent regresije za spoj 2, tablica S11. Analiza varijance za spoj 2, Tablica S12: Procijenjeni koeficijent regresije za zbroj spojeva 1 i 2, Tablica S13: Analiza varijance za zbroj spojeva 1 i 2.
Doprinosi autora: Konceptualizacija, KYL; metodologija, K.-EO, HS i KYL; softver, K.-EO i HS; validacija, HS; formalna analiza, K.-EO i HS; istraga, K.-EO, HS, MKL i KYL; upravljanje podacima, K.-EO, HS, BP i KYL; pisanje— izvorna priprema nacrta, K.-EO i HS; pisanje—pregled i uređivanje, HS, MKL, BP i KYL; nadzor, MKL, BP i KYL Svi su autori pročitali i složili se s objavljenom verzijom rukopisa.
Financiranje: Ovo istraživanje je podržala potpora Nacionalne istraživačke zaklade Koreje koju je financirala korejska vlada (NRF-2017R1A2B4003403 i NRF-2019R1A6A1A03031807) i potpora Korejskog projekta istraživanja i razvoja zdravstvene tehnologije kroz razvoj zdravstvene industrije u Koreji Institut (KHIDI), financiran od strane Ministarstva zdravstva i socijalne skrbi Republike Koreje (HF20C0038).
Izjava o dostupnosti podataka: Podaci predstavljeni u ovoj studiji dostupni su u dodatnom materijalu.
Sukob interesa:Autori izjavljuju da nema sukoba interesa.
Dostupnost uzorka: Nije dostupno

Reference

1. Ranjbar, S.; Shahvaran, PS; Edraki, N.; Khoshneviszadeh, M.; Darroudi, M.; Sarrafifi, Y.; Hamzehloueian, M.; Khoshneviszadeh, M. 1, 2, 3-Triazolom povezani 5-benziliden (tio) barbiturati kao novi inhibitori tirozinaze i hvatači slobodnih radikala. Arh. Pharm. 2020, 353, 2000058. [CrossRef] [PubMed]

2. Chang, T.-S.; Ding, H.-Y.; Lin, H.-C. Identificiranje 6, 7, 40 -trihidroksiizoflavona kao snažnog inhibitora tirozinaze. Biosci. biotehnologija. Biochem. 2005, 69, 1999–2001. [CrossRef] [PubMed]

3. Miyazawa, M.; Oshima, T.; Koshio, K.; Itsuzaki, Y.; Anzai, J. Inhibitor tirozinaze iz mekinja crne riže. J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 6953–6956. [CrossRef]

4. Chen, Q.; Diao, L.; Pjesma, H.; Zhu, X. Vitis amurensis Rupr: Pregled kemije i farmakologije. Fitomedicina 2018, 49, 111–122. [CrossRef] [PubMed]

5. Jin, K.-S.; Oh, YN; Hyun, SK; Kwon, HJ; Kim, BW Betulinska kiselina izolirana iz korijena Vitis amurensis inhibira 3-izobutil-1- metilksantinom induciranu melanogenezu putem regulacije puteva MEK/ERK i PI3K/Akt u stanicama B16F10. Food Chem. Toxicol. 2014, 68, 38–43. [CrossRef]

6. Kim, H.; Thuong, PT; Ngoc, TM; Lee, I.; Hung, ND; Bae, K. Antioksidativna i inhibitorna aktivnost lipoksigenaze oligostilbena iz lista i stabljike Vitis amurensis. J. Ethnopharmacol. 2009, 125, 304–309. [CrossRef]

7. Jin, K.-S.; Oh, YN; Hyun, SK; Kwon, HJ; Kim, BW Vitis amurensis Ruprecht korijen inhibira melanocite stimulirajući hormon induciranu melanogenezu u stanicama B16F10. Nutr. Res. Vježbajte. 2014, 8, 509–515. [CrossRef]

8. Jang, MH; Piao, XL; Kim, HY; Cho, EJ; Baek, SH; Kwon, SW; Park, JH Oligomeri resveratrola iz Vitis amurensis umanjuju oksidativni stres izazvan amiloidom u stanicama PC12. Biol. Pharm. Bik. 2007., 30, 1130–1134. [CrossRef]

9. Lee, E.-O.; Lee, H.-J.; Hwang, H.-S.; Ahn, K.-S.; Chae, C.; Kang, K.-S.; Lu, J.; Kim, S.-H. Snažna inhibicija rasta Lewisovog raka pluća pomoću heksanola A iz korijena Vitis amurensis putem apoptotičkih i antiangiogenih aktivnosti. Carcinogen 2006, 27, 2059–2069. [CrossRef]

10. Bak, M.-J.; Truong, VL; Kang, H.-S.; Jun, M.; Jeong, W.-S. Protuupalni učinak procijanidina iz sjemenki divljeg grožđa (Vitis amurensis) u stanicama RAW 264.7 izazvanim LPS-om. Oksid. Med. Ćelija. Longev. 2013, 2013. [CrossRef]

11. Shin, H.; Chung, H.; Park, B.; Lee, KY Identifikacija antioksidativnih sastojaka iz Polygonum aviculare korištenjem LC-MS zajedno s DPPH testom. Nat. proizvod Sci. 2016, 22, 64–69. [CrossRef]

12. Park, S.; Shin, H.; Park, Y.; Choi, I.; Park, B.; Lee, KY Karakterizacija inhibicijskih sastojaka proizvodnje NO iz Catalpa ovata korištenjem LC-MS u kombinaciji sa staničnom analizom. Bioorg. Chem. 2018, 80, 57–63. [CrossRef] [PubMed]

13. Ingkaninan, K.; De Best, C.; Van Der Heijden, R.; Hofte, A.; Karabatak, B.; Irth, H.; Tjaden, U.; Van der Greef, J.; Verpoorte, R. Tekućinska kromatografija visoke učinkovitosti s on-line povezanom UV, spektrometrijom mase i biokemijskom detekcijom za identifikaciju inhibitora acetilkolinesteraze iz prirodnih proizvoda. J. Chromatogr. 2000, 872, 61–73. [CrossRef]

14. Bezerra, MA; Santelli, RE; Oliveira, EP; Villar, LS; Escaleira, LA Metodologija površine odziva (RSM) kao alat za optimizaciju u analitičkoj kemiji. Talanta 2008, 76, 965–977. [CrossRef] [PubMed]

15. Witek-Krowiak, A.; Čojnička, K.; Podstawczyk, D.; Dawiec, A.; Pokomeda, K. Primjena metodologije odzivne površine i metoda umjetne neuronske mreže u modeliranju i optimizaciji procesa biosorpcije. Bioresour. Technol. 2014., 160, 150–160. [CrossRef] [PubMed]

16. Araujo, PW; Brereton, RG Eksperimentalni dizajn I. Probir. Analitičar trendova. Chem. 1996, 15, 26–31. [CrossRef]

17. Wang, Y.; Zhao, L.; Zhang, R.; Yang, X.; Sun, Y.; Shi, L.; Xue, P. Optimizacija ekstrakcije potpomognute ultrazvukom metodologijom površine odgovora, antioksidativnim kapacitetom i inhibitornom aktivnošću tirozinaze antocijana iz mekinja crvene riže. Food Sci. Nutr. 2020, 8, 921–932. [CrossRef]

18. Weremfo, A.; Adulley, F.; Adarkwah-Yiadom, M. Simultana optimizacija mikrovalne ekstrakcije fenolnih spojeva i antioksidativne aktivnosti sjemenki avokada (Persea americana Mill.) korištenjem metodologije odzivne površine. J. Anal. Metode Chem. 2020, 2020, 7541927. [CrossRef]

19. Ko, J.; Choi, J.; Bae, SK; Kim, J.; Yoon, KD Odvajanje pet oligostilbena iz Vitis amurensis protustrujnom kromatografijom visoke učinkovitosti s gradijentom druge brzine. J. Sep. Sci. 2013, 36, 3860–3865. [CrossRef]

20. Wang, K.-T.; Chen, L.-G.; Tseng, S.-H.; Huang, J.-S.; Hsieh, M.-S.; Wang, C.-C. Protuupalni učinci resveratrola i oligostilbena iz Vitis thunbergii var. taiwaniana protiv artritisa izazvanog lipopolisaharidima. J. Agric. Food Chem. 2011, 59, 3649–3656. [CrossRef]

21. Hu, J.; Lin, T.; Xu, J.; Ding, R.; Wang, G.; Shen, R.; Zhang, Y.-W.; Chen, H. Polifenoli izolirani iz lišća Vitis thunbergii var. Taiwaniana regulira put povezan s APP-om. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2016, 26, 505–511. [CrossRef] [PubMed]

22. Oshima, Y.; Kamijou, A.; Ohizumi, Y.; Niwa, M.; Ito, J.; Hisamichi, K.; Takeshita, M. Novi oligostilbeni iz Vitis coignetiae. Tetrahedron 1995, 51, 11979–11986. [CrossRef]

23. Anna Malinowska, M.; Billet, K.; Drouet, S.; Munsch, T.; Unlubayir, M.; Tungmunnithum, D.; Giglioli-Guivarc'h, N.; Hano, C.; Lanoue, A. Ekstrakti trske grožđa kao multifunkcionalni kozmetički sastojak za pomlađivanje: Procjena aktivnosti sirtuina, inhibicije tirozinaze i potencijala bioraspoloživosti. Molecules 2020, 25, 2203. [CrossRef] [PubMed]

24. Yang, HH; Oh, K.-E.; Jo, YH; Ahn, JH; Liu, Q.; Turk, A.; Jang, JY; Hwang, BY; Lee, KY; Lee, MK Karakterizacija inhibicijskih sastojaka tirozinaze iz nadzemnih dijelova Humulus japonicus korištenjem LC-MS/MS spojenog online testa. Bioorg. Med. Chem. 2018, 26, 509–515. [CrossRef] [PubMed]

25. Liu, Q.; Kim, C.; Jo, YH; Kim, SB; Hwang, BY; Lee, MK Sinteza i biološka procjena derivata resveratrola kao inhibitora melanogeneze. Molecules 2015, 20, 16933–16945. [CrossRef] [PubMed]

Za više informacija: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501