Poglavlje 2: Faktor 15 sličan Krϋppelu suzbija proliferaciju bubrežnih glomerularnih mezangijalnih stanica putem poboljšanja konjugacije P53 SUMO1

Za više informacija. kontakttina.xiang@wecistanche.com

3 REZULTATA

3.1|Provjera KLF15-vezujućih gena putem ChIP-Seq u primarnim bubrežnim glomerularnim MC-ima

Kako bismo identificirali partnerske gene za izravno vezivanje KLF15, izvršili smo ChlP-Seq analizu i na kraju pregledali 2478 gena. GO analiza ovih gena putem alata na web stranici www.uniprot.org (Slika 1A, B) otkrila je pojmove molekularne funkcije povezane s 1941 genom, pojmove stanične komponente koji se odnose na 1662 gena i pojmove bioloških procesa koji se odnose na 1766 gena. Budući da je naš cilj bio saznati kako KLF15 utječe na MC, usredotočili smo se na gene povezane sa staničnim procesima. Među 1315 gena povezanih sa staničnim procesima, 74 gena sudjeluju u procesima staničnog ciklusa; konkretno, ti su geni sudjelovali u mitotskom staničnom ciklusu, prijelazu faze staničnog ciklusa i drugim procesima (Slika 1C, D). Nadalje, analizirali smo gene uključene u rast i otkrili da su povezani s razvojnim rastom, rastom stanica i drugim vrstama rasta (Slika 1E).

3.2|Provjera različito reguliranih gena u KLF15-koje prekomjerno izražavaju bubrežne glomerularne MC koristeći SILAC i LC/MS

SILAC i LC/MS analiza HRMC-ova koji prekomjerno izražavaju KLF15 u usporedbi s roditeljskim stanicama doveli su do identifikacije 1357 proteina. Koristili smo DAVID i IPA za dobivanje GO domena i obogaćenih puteva kvantificiranih proteina koje je identificirao SILAC. Zanimljivo je da su mnogi pojmovi povezani s biološkom funkcijom proteina bili među prvih 30 značajno obogaćenih pojmova GO, uključujući regulaciju staničnog metaboličkog procesa aminokiselina, kompleks proteasoma, vezanje proteina i izraze transkripcije i prevođenja, a svi su oni blisko povezani s ubikvitinacija (Slika 2A). Slika 2B prikazuje prvih 30 značajno obogaćenih pojmova puta. Nekoliko termina bioloških procesa, uključujući pojmove proteasoma i neurodegenerativne bolesti, također je bilo povezano s ubikvitinacijom.

Kliknite da saznate više ocistancheprodajem sa detaljima

3.3|Bioinformatička analiza gena za vezanje KLF15- koji su potencijalno povezani s proliferacijom MC bubrežnog glomerula

Istražiti KLF15-vezujuće gene koji su potencijalno povezani sbubrežni glomerularniMC proliferacije, proveli smo bioinformatičku analizu ChIP-Seq podataka i SILAC-LC/MS podataka. Pregledano je 52 gena (tablica 2 i slika 2C), a pet od ovih gena, uključujući SUMO1, faktor inhibicije migracije makrofaga (MIF), faktor inicijacije eukariota (EIF), faktor rasta sličan inzulinu (IGF) i retikulokalbin (RCN) ), bili su blisko povezani sproliferacija stanica. Budući da su analize GO i puteva različito izraženih proteina sugerirale da su pregledani geni uglavnom povezani s procesom ubikvitinacije, zaključili smo da SUMO1, član obitelji proteina sličnih ubikvitinu (UBL), sudjeluje u post-translacijskoj modifikaciji sličnoj ubikvitinacije kao ciljnog gena KLF15.

Sve veći broj dokaza pokazuje da je HG jedan od glavnih čimbenika koji inducira razvoj dijabetičke nefropatije, te potiče proliferaciju MC-a i povećanu sintezu matriksa in vitro. 25 Prethodna studija pokazala je da je PDGF-BB bitan za proliferaciju MC-a prije razvoja glomeruloskleroze u eksperimentalnom glomerulonefritisu.26 Nakon potvrde da su MC stimulirane HG ili PDGF-BB in vitro, otkrili smo promjene u ekspresiji KLF15 i SUMO1 i na RNA i na proteinu

razine i otkrili da te molekule imaju slične trendove (slika 2D-l). Konačno, odredili smo SUMO1 kao ciljni gen KLF15.

3.4|KLF15 pojačava ekspresiju gena SUMO-1 vezanjem na 16 bp CACCCA-SUMO-1 promotorsku regiju i motiv bogat C plus A

Koristili smo paket MEME (http://meme-suite.org/tools/meme) za karakterizaciju KLF15-motiva vezanja 52 pregledana gena iz podataka KLF15 ChlP-Seq i identificirali KLF-vezujući motiv (Slika 3A). Osim toga, dodatno smo analizirali više od tisuću baza uzvodno od SUMO1 promotora i otkrili da KLF15 može prepoznati i vezati se na sekvencu od 16 bp (nukleotide -205~-199), uključujući - CACCCA-(Slika 3B).ChIP-PCR potvrdio je da je KLF15 vezan na SUMO1 promotor, a rezultati su pokazali značajno veću ekspresiju SUMO1 u skupini anti-KLF15 protutijela nego u pozadinskoj kontrolnoj skupini (Slika 3C).

Nadalje, proveli smo dvostruki luciferazni reporterski test kako bismo potvrdili odnos ciljanja između SUMO1 i KLF15. Skupina SUMO1 promotora divljeg tipa pokazala je veću aktivnost luciferaze od vektora pGL3 i mutantnih skupina u HRMC, a aktivnost je značajno povećana prekomjernom ekspresijom KLF15. Povećanje aktivnosti luciferaze poništeno je transfekcijom s plazmidom koji eksprimira regiju mutantnog promotora (Slika 3D). Uzeti zajedno, ovi podaci sugeriraju da je SUMO1 izravna transkripcijska meta KLF15.

3.5|Probir P53 kao SUMOilacijskog supstrata SUMO1

SUMO modifikacije su široko izražene posttranslacijske modifikacije u eukariota. Reverzibilna konjugacija ovih modifikacija na supstratne proteine ​​također je poznata kao SUMOilacija, koja ima važnu ulogu u regulaciji funkcija ciljnih proteina i dalje sudjeluje u raznim biološkim procesima, kao što su nukleocitoplazmatski transport, regulacija transkripcije, apoptoza, stabilizacija proteina, odgovori na stres i napredovanje staničnog ciklusa.27 Kako bismo istražili nizvodne signalne molekule izravno konjugirane sa SUMO1, izvršili smo mrežnu analizu SUMO1 koristeći IPA bazu podataka, a podaci su pokazali da se SUMO1 može izravno konjugirati s P53, APP, JUN i AKT, među ostalim proteini (Slika 4A-C). U početku smo odabrali P53 kao nizvodnu molekulu SUMO1 jer je to dobro poznati protein koji je usko povezan sa staničnom proliferacijom.28.29 Nadalje, koristili smo SUMOsp softver za predviđanje mogućih SUMOilacijskih sekvenci P53 različitih vrsta i otkrili da P53 ima SUMOilacijski slijed（ Slika 4D). Kako bismo utvrdili je li P53 doista modificiran SUMOilacijom, privremeno smo transficirali HRMC-ove SUMO1 prekomjerno ekspresijskim plazmidom ili SUMO1 siRNA. I IP i rezultati Western blota otkrili su trendove u promjenama ekspresije SUMO1-P53 i P53 koji su bili u skladu s promjenama u SUMO1 (Slika 4E-J). Ovi podaci pokazuju da je P53 SUMOilacijski supstrat SUMO1.

3.6 |KLF15 inhibira proliferaciju MC promicanjem SUMO1 ekspresije i P53 SUMOilacije

Kako bismo uspostavili regulaciju SUMOilacije P53 i proliferacije MC pomoću KLF15 i SUMO1, intervenirali smo ekspresijom KLF15 ili SUMO1 u HRMC-ovima i tretirali HRMC-ove s PDGF-BB. Među HRMC-ovima tretiranim s PDGF-BB, stanice transficirane plazmidom prekomjerne ekspresije KLF15 pokazale su veću ekspresiju SUMO1-P53, P53, KLF15 i SUMO1 nego stanice transficirane kontrolnim plazmidom KLF15. Iste promjene u SUMO1-P53, P53 i SUMO1 pronađene su u stanicama transfektiranim plazmidom prekomjerne ekspresije SUMO1, dok je ekspresija KLF15 bila nepromijenjena u tim stanicama (Slika 5A-F). PDGF-BB je jedan od najučinkovitijih faktora rasta MC-a opisanih do sada, a opažen je i proliferativni odgovor HRMC-a na PDGF-BB. Kao što je prikazano na slici 5G, H, postotak EdU-pozitivnih stanica značajno je povećan primjenom rekombinantnog PDGF-BB. Rezultati EdU bojenja pokazali su da prekomjerna ekspresija i KLF15 i SUMO1 inhibira staničnu proliferaciju izazvanu PDGF-BB (Slika 5G, H).

Kako bismo stekli daljnji uvid u uloge KLF15 i SUMO1 u proliferaciji HRMC-a, transficirali smo stanice samo SUMO1 siRNA ili ih kotransficirali SUMO1 siRNA i KLF15 prekomjerno ekspresijskim plazmidom. Niža regulacija SUMO1 nije utjecala na ekspresiju KLF15, ali su razine ekspresije SUMO1-P53 i P53 očito smanjene nakon transfekcije siRNA SUMO1 (Slika 6A-C). Osim toga, kada je ekspresija SUMO1 bila inhibirana, razine ekspresije SUMO1-P53 i P53 također su bile potisnute čak iu stanicama koje su prekomjerno eksprimirale KLF15 (Slika 6D-F). Zatim je proliferacija MC procijenjena korištenjem EdU testa bojenja. SUMO1 RNAi pojačao je proliferativni učinak PDGF-BBon HRMC-ova, a skupina kotransficirana s KLF15 prekomjerno ekspresijskim plazmidom i SUMO1 siRNA imala je više EdU-pozitivnih stanica nego skupina kotransficirana s prekomjerno ekspresijskim plazmidom i hibridnom siRNA za kontrolu sekvence (Slika 6G, H) . Stoga zaključujemo da KLF15 potiskuje proliferaciju MC pojačavanjem SUMOilacije P53.

3.7|Globalna ekspresija SUMO1 i P53 u glomerularnim MC negativno je povezana s proliferacijom MC u Thy-1 nefritisu štakora

Anti-Thy1 nefritis je klasični model samoograničenog mezangijskog proliferativnog glomerulonefritisa s proliferativnom fazom i fazom oporavka. Ubrizgali smo Thy1 antitijelo Wistar štakorima kako bismo stvorili ovaj model. Ni dušik uree u serumu ni kreatinin nisu imali značajne promjene između kontrolnih štakora i štakora modela (Slika S1). Izražena mezangijska proliferacija i nakupljanje ECM-a primijećeni su tijekom proliferativne faze (5. i 7. dan) u modelu štakora, a broj MC-a smanjio se tijekom faze oporavka 10. dana (Slika 7A). Također smo otkrili promjene ekspresije u markeru stanične proliferacije PCNA pomoću IHC (Slika 7A, B). Razine PCNA bile su povećane 5. dana, dosegle vrhunac 7. dana i smanjene 10. dana (Slika 7F). Western blot analiza pokazala je da je ekspresija proteina P53, SUMO1 i KLF15 u izoliranim glomerulima niža u modelnim skupinama nego u kontrolnoj skupini (Slika 7C, D), u skladu s imunohistokemijskim rezultatima (Slika 7E, F). Ovi rezultati pokazuju da je abnormalna proliferacija MC-a u štakorima modela anti-Thy1 povezana s niskom razinom ekspresije KLF15 i SUMO1. Očekuje se da će ometanje ekspresije ovih molekula ublažiti patološki fenotip u štakora.

4 RASPRAVA

Theglomerulisu jedinice za filtriranjebubreg. Poremećaj glomerularne funkcije može biti uzrokovan primarnom glomerularnom patologijom ili može biti sekundaran zbog sistemskih bolesti. Promjene mezangija viđene su nakon ozljede glomerula uključujući hiperproliferaciju MC-a praćenu prekomjernom proizvodnjom ECM-a (ekspanzija mezangija) i proizvodnjom kemoatraktanta za upalne stanice. Stoga je modulacija MC odgovora, posebice abnormalne proliferacije, novi terapijski pristup. KLF15 je protein koji ima regulatornu ulogu kao faktor transkripcije tako što se veže na specifične sekvence DNA. Mnoge studije su izvijestile da je KLF15 uključen u regulaciju stanične proliferacije. Na primjer, otkriveno je da KLF15 sudjeluje u inhibiciji signalnih putova povezanih s proliferacijom MC,15,30 ali njegov izravni ciljni gen nije prijavljen u literaturi. Stoga je ova studija uključivala uglavnom zajednički pregled razina transkripcije i translacije kako bi se identificirao izravni ciljni gen KLF15.

KLF15 regulira različite gene u različitim vrstama te u različitim tkivima i organima. U procesu regulacije proliferacije MC-a, KLF15 utječe na ekspresiju više gena i sudjeluje u višestrukim putevima.131,32 Kako bismo istražili izravne ciljane gene KLF15, koristili smo ChIP-Seg. Klein RH i njegovi kolege koristili su ChlP-seq tehnologija za proučavanje regulacije KLF7 na diferencijaciju epitelnih stanica rožnice.33 Ying M i suradnici koristili su ovu tehniku ​​za proučavanje inhibitornog učinka KLF9 na pluripotentnost glioblastoma.34 U usporedbi s ChlP-čipom, ChIP-Seq omogućuje pravu analizu cijelog genoma s višom rezolucijom, većom osjetljivošću detekcije i manjom potražnjom za veličinom uzorka.35 Koristili smo ChP za dobivanje fragmenata DNK izravno vezanih s KLF15, a nakon usporedbe i analize s GenBank, pregledali smo 2478 mogućih ciljnih gena. Kroz GO i analizu puta identificirali smo mnoge ciljne gene uključene u stanični ciklus i procese proliferacije.

ChlP-Seq eksperimenti zahtijevaju PCR za pojačanje detekcijskog signala, a određeni stupanj pristranosti tijekom procesa pojačanja je neizbježan. Osim toga, ChIP-Seq dobiva samo gene koje KLF15 može vezati i ne ukazuje na promjene koje se događaju u ekspresiji tih gena kada se ekspresija KLF15 promijeni. Koristili smo SILAC-LC/MS proteomičku analizu kako bismo nadoknadili ove nedostatke. Ova tehnika pruža informacije o svim proteinima čija se ekspresija mijenja nakon regulacije pomoću KLF15, uključujući proteine ​​koje izravno regulira KLF15 i proteine ​​koji su neizravno regulirani ili post-translacijski modificirani. HRMC su uzgojeni korištenjem SILAC-a, a KLF15 je prekomjerno eksprimiran u stanicama putem transfekcije plazmida. Proteini su sakupljeni za LC/MS detekciju, te je dobiveno 1357 različito eksprimiranih proteina. GO i analize puta otkrile su da su neki od različito izraženih proteina uključeni u ubikvitinaciju. Podaci o genima i proteinima su presječeni. Uklonjeni su geni koji nisu povezani sa svrhom istraživanja i geni koji nisu izravno regulirani KLF15; u konačnici, 52 gena su pretražena. Među njima je odabrano pet gena s najočiglednijim razlikama u ekspresiji koji su bili najuže povezani s proliferacijom. S obzirom na kombinirane rezultate analize putanje, SUMO1 i analize ekspresije KLF15 u proliferirajućim HRMCs, ChlP-PCR i dual-luciferaze reporter testova, protein SUMO1 odabran je kao ciljni gen za KLF15.

Uz ubikvitin, identificira se sve veći broj UBLproteina,3637 uključujući SUMO,38, gen 8(NEDD8)3940 s ekspresijom neuralnih prekursorskih stanica, razvojno smanjen gen 15(ISG15),41 stimuliran interferonom. Ovi modificirajući proteini snažno reguliraju niz bioloških procesa. Kovalentno dodavanje SUMO-a supstratima, nazvano SUMOilacija, post-translacijska je modifikacija uključena u niz staničnih procesa, uključujući nuklearno-citosolni transport, regulaciju transkripcije, apoptozu, kontrolu stabilnosti proteina, reakcije na stres i progresiju staničnog ciklusa.27SUMO je tipično vezan za akceptorske lizinske ostatke proteinskih supstrata koji sadrže konsenzusnu sekvencu i pridonosi regulaciji interakcija protein-protein kao i subcelularnoj kompartmentalizaciji i stabilnosti proteina.2 sUMO1, kao član obitelji SUMOS, može utjecati na staničnu proliferaciju modificiranjem supstrata i stabiliziranje regulatornih proteina staničnog ciklusa.43 Stoga, u kombinaciji s literaturnim izvješćem i sveobuhvatnim rezultatima pregleda i analize, usredotočili smo se na to kako KLF15 regulira učinak SUMO1 na proliferaciju mezangijskih stanica.

Kako bismo identificirali supstrate SUMO1, izvršili smo mrežnu analizu SUMO1 koristeći IPA bazu podataka i SUMOsp softver. U kombinaciji s objavljenim istraživanjem P53, naši početni podaci o probiru sugerirali su P53 kao nizvodnu molekulu SUMO1 sa SUMOilacijskom sekvencom YKxD/E. Prethodne studije pokazale su da je P53 bio supstrat SUMOilacije,45 a pojačana konjugacija P53 SUMO1 promicala je stabilnost i aktivnost P53 i inducirala se-nescenciju.46 U našoj studiji, interferencija s ekspresijom SUMO1 u HRMC-ima proizvela je iste trendove promjena u SUMO1-P53 i P53, što ukazuje da je P53 bio SUMOilacijski supstrat SUMO1.

Novi dokazi ukazuju na to da SUMOilacija i de-SUMOilacija igraju ulogu u brojnim nefropatskim bolestima, kao što su bubrežna disgeneza, bubrežni karcinom, glomerularna bolest, apoptoza podocita i hipertonus medule bubrega, akutna ozljeda bubrega i nefrolitijaza.7-51 Da pojasnimo odnosa između KLF15, SUMO1, P53 SUMOilacije i proliferacije MC, izveli smo niz tretmana transfekcijom na stanicama koje su bile podvrgnute proliferaciji izazvanoj PDGF-BB. Prekomjerna ekspresija KLF15 pojačala je ekspresiju SUMO1, dok prekomjerna ekspresija SUMO1 nije utjecala na ekspresiju KLF15. Prekomjerna ekspresija KLF15 ili SUMO1 povećala je SUMOilaciju P53 i antagonizirala proliferaciju stanica induciranu PDGF-BB. Kada je ekspresija SUMO1 bila inhibirana, SUMOilacija P53 je također bila inhibirana, a KLF15 je izgubio svoj antagonistički učinak na staničnu proliferaciju. In vivo. proliferacija MC postupno se povećavala s pogoršanjem mezangijskog proliferativnog nefritisa, dok se ekspresija KLF15, SUMO1 i P53 značajno smanjila. Uzimajući u obzir integrirana opažanja u stanicama i tkivima, preliminarno zaključujemo da KLF15 regulira SUMOilaciju P53 preko SUMO1, čime inhibira proliferaciju MC.

5. ZAKLJUČCI

Neka su istraživanja pokazala da KLF15 igra važnu ulogu u regulaciji proliferacije MC-a. U ovom smo radu istražili mehanizme supresije proliferacije MC posredovane ovim transkripcijskim faktorom. Identificirali smo SUMO1 kao primarni cilj KLF15 u MC putem bioinformatičkih analiza koje uključuju ChIP-Seq i SILAC-LC/MS. Nadalje, uz pomoć IPA baze podataka i SUMOsp softvera, utvrdili smo da je P53 izravni supstrat SUMO1. In vitro i in vivo eksperimenti potvrdili su da KLF15 može pospješiti ekspresiju SUMO1 i SUMOilaciju P53, a zatim inhibirati proliferaciju MC-a (Slika S2). Ovi rezultati pridonose razumijevanju regulatorne uloge KLF15 u proliferaciji MC-a i daju teorijsku osnovu za pronalaženje novih tretmana za bubrežne bolesti povezane s proliferacijom MC-a.