Carvedilol, adrenergički blokator, potiskuje sintezu melanina inhibicijom CAMP/CREB signalnog puta u ljudskim melanocitima i ex vivo kulturi ljudske kože

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Myoung Eun Choi 1,†, Hanju Yoo 1,2,†, Ha-Ri Lee 2,3, Ik Joon Moon 1, Woo Jin Lee 1,Youngsup Song 3,*,‡ i Sung Eun Chang 1

Sažetak:Kateholamini funkcioniraju putem receptora povezanih s G proteinom, izazivajući povećanje intracelularnih razina od 30 50-cikličkog adenozin monofosfata (cAMP) u različitim stanicama. Biosinteza kateholamina i -adrenergički receptor postoje umelanociti; prema tome, kateholamini mogu igrati kritičnu ulogu u pigmentaciji kože. Međutim, njihovo djelovanje i mehanizmi koji posreduju melanogenezu u ljudskoj koži još nisu istraženi. Stoga smo ispitali potencijalni antimelanogenetski učinak karvedilola, neselektivnog blokatora sa slabim 1-blokirajućim djelovanjem. Karvedilol smanjuje sadržaj melanina i aktivnost stanične tirozinaze bez ugrožavanja stanične održivosti u normalnog čovjekamelanocitikao i u Mel-Ab besmrtnim mišjim melanocitima. Transkripcijski faktor povezan s karvedilolom (MITF), tirozinaza, protein povezan s tirozinazom (TRP)-1 i TRP-2. Liječenje karvedilolom dovelo je do regulacije fosfor-cAMPresponse element-binding protein (CREB). Štoviše, povećanje razine cAMP-a nakon liječenja forskolinom poništilo je antimelanogeno djelovanje karvedilola. Osim toga, karvedilol je značajno smanjio indeks melanina u kulturama ljudske kože ozračene ultraljubičastim zračenjem. Uzeti zajedno, naši rezultati pokazuju da karvedilol učinkovito potiskuje melanogenezu u ljudimelanocitii ex vivo ljudska koža inhibicijom cAMP/protein kinaze A/CREB signalizacije. Antimelanogeni učinci karvedilola imaju potencijalno značenje za kožuizbjeljivanjeagenti.

Ključne riječi:karvedilol; adrenergički blokator;sinteza melanina; cAMP/CREB signalizacija

Cistanchemože inhibirati sintezu melanina

1. Uvod

Širok raspon pigmentnih poremećaja kože ima značajan psihološki i društveni utjecaj na pacijente. Razvijeni su različiti modaliteti liječenja, uključujući sustavne i lokalne lijekove, kao i lasersku terapiju [1-3]. Međutim, rezultati su često nezadovoljavajući, a nuspojave, kao što su postupalna hiperpigmentacija (PIH) i hipopigmentacija, česte su. Osim toga, liječenje je skupo i dugotrajno [4-6].

Kateholamini, koji uključuju dopamin, epinefrin i norepinefrin, su signalne molekule koje djeluju kao neurotransmiteri i endokrini hormoni. U koži se biosinteza i razgradnja kateholamina odvija u ljudskim keratinocitima, ali je sinteza kateholamina u melanocitima nešto drugačija [7-9]. Kateholamini funkcioniraju putem G protein-spregnutih receptora (GPCR). Vezanje kateholamina na GPCR-e pokreće aktivaciju unutarstanične adenilatciklaze, koja sintetizira 30, 50-ciklički adenozin monofosfat (cAMP) iz ATP-a [10]. Drugi glasnik cAMP ispoljava svoju aktivnost vezanjem R-podjedinice protein kinaze A (PKA), što rezultira fosforilacijom proteina koji veže element odgovora cAMP (CREB). GPCR se aktiviraju aminima i peptidima, uključujući glukagon, paratiroidni hormon, sekretin i kalcitonin [10].

Antagonisti adrenergičkih receptora uključuju -receptor i -receptor antagoniste. -Antagonisti -receptora potkategorizirani su u neselektivne, 1-selektivne i 2-selektivne agense, dok su antagonisti -receptora potkategorizirani kao neselektivni, 1-selektivni i 2-selektivni agenata na temelju njihovih aktivnosti selektivnog blokiranja. Za razliku od neselektivnih antagonista receptora prve generacije, kao što su propranolol, timolol i nadolol, karvedilol je neselektivni blokator treće generacije koji pokazuje vazodilatatorsko djelovanje blokiranjem 1-adrenoreceptora (1-AR) [11]. Stoga je karvedilol neselektivni blokator sa slabim 1-blokirajućim djelovanjem [12]. Uglavnom se koristi kao oralni lijek za kontrolu visokog krvnog tlaka i kongestivne bolesti srca, slično drugim blokatorima [12]. Međutim, blokatori treće generacije pokazuju angiogeno, antioksidativno, antiproliferativno, antihipertrofično i anti-apoptotsko djelovanje koje zahtijeva daljnje razjašnjavanje [11]. U dermatološkom području, zbog svog antioksidativnog i protuupalnog djelovanja, karvedilol se često koristi u oralnim pripravcima za liječenje matotelangiektatične rozaceje [13,14]. Štoviše, antioksidativno djelovanje karvedilola rezultira prevencijom karcinogeneze kože izazvane ultraljubičastim (UV) zračenjem, što ga čini atraktivnim sredstvom za liječenje kožnih bolesti povezanih s UV zračenjem [15-18]. Međutim, kemopreventivni učinci karvedilolara nisu posredovani izravno AR-ima. [19] Iako je točan mehanizam relativno nepoznat, signalni put cAMP/PKA i PKC-δ mogao bi biti povezan sa svojstvima karvedilola protiv metastaza na koži [20].

U ranim fazama istraživanja pigmentacije, ljudskamelanocitiutvrđeno je da izražavaju -1-AR signalizaciju nakon izvanstanične indukcije noradrenalinom. Međutim, -AR nisu pronađeni nakon stimulacije s adrenergičkim signaliziranjemmelanociti[8]. Nasuprot tome, Cillbro et al. kasnije je pokazao da specifični funkcionalni 2-AR signal postoji u ljudskim melanocitima i da 2-AR stimulacija dovodi do pigmentacije kroz 2-AR/cAMP put [7]. Stoga je predložena uloga kateholamina u kontroli pigmentacije, a cAMP se smatra glavnom osi za kontrolu kateholamina u melanogenezi.

Melanogeneza je složen proces koji uključuje brojne putove. Tirozinaza, protein 1 srodan tirozinazi (TRP-1) i TRP-2, također nazvan dopakrom tautomeraza (DCT), tri su glavna enzima specifična za melanocite uključena usinteza melanina[21]. Melanogenezu induciraju ili inhibiraju brojni čimbenici, uključujući hormone, citokine, neurotransmitere, čimbenike rasta i mikromolekule [21-23].

Najvažniji pozitivni regulator je melanokortin-1 receptor i njegovi ligandi, melanokortini i adrenokortikotropni hormon [23]. Međutim, različiti čimbenici uključeni u melanogenezu su endorfini, estrogeni, androgeni, vitamin D3 i kateholamini [23]. Kumulativni dokazi sugeriraju da L-tirozin i L-DOPA, koji su supstrati i intermedijeri melanogeneze, djeluju kao induktori i pozitivni regulatori melanogenog puta, uz regulatore drugih staničnih funkcija [24]. Štoviše, Jeff Howe et al. sugerirali su da je indukcija i regulacija melanogeneze L-tirozinom posredovana izravnom aktivacijom adrenergičkih receptora L-tirozinom, a ne uzrokovana njegovim metaboličkim produktima kao što su kateholamini [25]. U njihovim studijama norepinefrin i epinefrin stimuliraju aktivnost tirozinaze, ali njihov induktivni učinak nasinteza melaninabio je relativno niži od L-tirozina [25].

Kateholamini mogu igrati važnu ulogu u sustavu pigmentacije kože; međutim, njihovi učinci na melanogenezu u odnosu na djelovanje neselektivnog β-blokatora treće generacije još nisu istraženi. Stoga smo u ovoj studiji imali za cilj istražiti utječe li karvedilol na melanogenezu i istražili njegove mehanizme djelovanja u ljudimelanocitii ex vivo ljudska koža i njezina potencijalna uporaba kaoizbjeljivanjeproizvod.

inhibiraju stvaranje melanina saherba cistanches

2. Rezultati

2.1. Karvedilol potiskuje melanogenezu

Citotoksičnost karvedilola protiv normalnih ljudimelanociti(NHMs) i Mel-ab stanice procijenjene su testom proliferacije WST stanica. Koncentracija karvedilola od 10 µM počela je pokazivati ​​citotoksičnost protiv NHM i Mel-ab stanica (Slika 1A, B). Stoga smo u daljnjim procjenama koristili 8 µM karvedilola, koji nije citotoksičan za NHM.

Liječenje karvedilolom smanjilo je sadržaj melanina na način ovisan o dozi bez utjecaja na održivost NHM (Slika 1C). Sadržaj melanina smanjen je za 28,36 posto nakon tretmana karvedilolom od 96 sati 8 µM (Slika 1C). Dodatak 100 mg/mL arbutina smanjio je sadržaj melanina u manjoj mjeri nego karvedilol (Slika 1C). Nakon 4 dana liječenja karvedilolom, sadržaj melanina smanjio se ovisno o vremenu (Slika 1D). Međutim, liječenje forskolinom (FSK) tijekom 4 dana nakon prethodnog liječenja karvedilolom izazvalo je povećanje sadržaja melanina (Slika 1E). FSK povećava transkripciju MITF-a u najvećem stupnju nakon 2 sata u NHM-ovima i vjeruje se da funkcionira preko cAMP-a. /PKA/CREB put (Slika 1F).

2.2. Karvedilol inhibira ekspresiju MITF-a i njegovih ciljnih gena i smanjuje razine fosfo-CREB-a u NHM-ovima

Budući da je karvedilol smanjio nakupljanje melanina, istražili smo aktivnost stanične tirozinaze. Liječenje karvedilolom smanjilo je aktivnost stanične tirozinaze na način ovisan o dozi u NHM (Slika 2A). Aktivnost tirozinaze smanjila se za 28,48 posto nakon 96 sati liječenja karvedilolom od 8 µM (Slika 2A). Zatim smo utvrdili utječe li karvedilol na ekspresiju MITF-a, koji igra ključnu ulogu u regulaciji tirozinaze i nizvodno melanogenih gena. Liječenje FSK-om povećalo je unutarstanične razine cAMP-a i poništilo antimelanogeno djelovanje karvedilola. Karvedilol je značajno smanjio razinu proteina MITF-a, središnjeg transkripcijskog faktora melanogeneze, nakon 72 sata (Slika 2B). Nadalje, ekspresija njegovih ciljnih gena, kao što su tirozinaza i TRP-1, smanjena je nakon liječenja karvedilolom (Slika 2B). Ovi rezultati pokazuju da karvedilol inhibira melanogenezu smanjenjem MITF signalizacije.

Zatim smo istražili unutarstanične signalne putove melanogeneze, koji reguliraju transkripciju MITF, mjerenjem razina ekspresije fosfo-CREB i fosfo-ERK. Fosfo-ERK razine nisu se mijenjale tijekom vremena nakon liječenja karvedilolom; međutim, razine fosfo-CREB bile su smanjene (Slika 2B). U skladu s prethodnim opažanjima, naši su rezultati otkrili da karvedilolin inhibira melanogenezu inhibicijom cAMP/PKA/CREB signalnog puta. Štoviše, liječenje FSK-om poništilo je antimelanogeno djelovanje karvedilola povećanjem razine cAMP-a.

2.3. Indeks melanina i imunohistokemijsko bojenje u ex vivo kulturi ljudske kože

Gustoća epidermalnih melanocita i indeks melanina u ex vivo dijelovima tkiva kulture ljudske kože detektirani su Melan-A i Fontana-Massonovim bojanjem. Karvedilol nije utjecao na broj Melan-A ( plus )melanocitiu uzorku tretiranom karvedilolom plus UV zračenjem (UVR) u usporedbi s onim u uzorku tretiranom samo UVR (Slika 3A). HMB45(plus)melanociti mogu ukazivati ​​na to da se melanocitna aktivnost povećala nakon tretmana UVR-om i bila obrnuto smanjena nakon tretmana karvedilolom (Slika 3B). Međutim, sadržaj melanina bio je značajno smanjen u uzorcima tretiranim karvedilolom plus UVR u usporedbi s onim u uzorcima tretiranim samo UVR (Slika 3C). Za izračun melaninskog indeksa izračunat je i uspoređen udio Fontana–Massonove stainedarea preko ukupne površine između uzorka izloženog UVR-u i karvedilolu plus UVR-u (Slika 3D). Stanični lizati svakog uzorka analizirani su Western blota testom, koji je otkrio da su tirozinaza, TRP1 i DCT povećani UVR-om i smanjeni tretmanom karvedilolom (Slika 3E). Kao rezultat toga, karvedilol je značajno smanjio indeks melanina i proteine ​​povezane s melanogenezom, pokazujući svoj antimelanogeni učinak na ljudskoj koži tretiranoj UV zračenjem.

3. Rasprava

Melanin je pigment odgovoran za boju kože i kose, a sintetizira se u melanosomimamelanociti. Iako epidermalni melanin igra važnu zaštitnu ulogu protiv UVR-a, prekomjerna proizvodnja i nakupljanje melanina u koži uzrokuje problematične hiperpigmentarne poremećaje kože, kao što su PIH, dispigmentacija povezana s fotostarijenjem, melazma i solarni lentigin [18,26]. Stoga je inhibicija melanogeneze u središtu pozornosti medicinskih i kozmetičkih tretmana za ljepotu i zdravlje kože. Uloženi su znatni napori da se identificiraju nova i učinkovita sredstva protiv pigmentacije. Međutim, mehanizmi anti-melanogeneze specifičnih agenasa trenutno su neizvjesni i općenito su procijenjeni u mišjim stanicama, što daje rezultate koji nisu uvijek u skladu s onima iz ispitivanja na ljudskoj koži [27,28]. Štoviše, budući da je melanogeneza melanocita strogo regulirana keratinocitima i drugim susjednim stanicama, kokultivirane ljudske stanice ili ex vivo ljudska koža pouzdanije su eksperimentalne postavke za istraživanje učinkovitihizbjeljivanjeagenti [29]. Većina sredstava za izbjeljivanje kože, bilo prirodnog ili kemijskog podrijetla, može uzrokovati toksičnost ili iritaciju kože, što se do određene mjere može predvidjeti korištenjem in vitro testova vitalnosti stanica s melanocitima. U našem istraživanju, karvedilol nije pokazao citotoksičnost kada se koristio u umjerenim dozama.

cistanche bienfaits

Topikalne kreme s hidrokinonom mogu rezultirati neželjenim poremećajima hipopigmentacije i kožnom toksičnošću [30-32]. Nadalje, nekiizbjeljivanjekozmetika ima katastrofalne posljedice izazivanjem hipopigmentacije kroz razgradnju proteina tirozinaze [33-35]. Sredstva za izbjeljivanje mogu se koristiti u većim dozama, ovisno o korisniku, kako bi se maksimalno povećalo izbjeljivanje hiperpigmentarnih lezija. Stoga se kontinuirano istražuju napori da se otkriju sigurna i zdrava sredstva za izbjeljivanje kože.

Stoga je ova studija osmišljena za provođenje u normalnim ljudskim stanicama i ex vivo ljudskoj koži. Nadalje, na temelju utvrđenog mehanizma djelovanja kateholamina G signalizacije, koji povećava staničnu razinu cAMP-a, vjerovali smo da bi adrenergički blokator mogao smanjiti razine cAMP-a i inhibirati UVR/cAMP/CREB signalni put, koji je glavni mehanizam za UV-induciranu hiperpigmentaciju kože [36,37]. Stoga smo pretpostavili da adrenergički blokatori koji smanjuju razinu cAMP smanjujusinteza melanina.

Osim toga, razviti siguranizbjeljivanjeagenasa, paralelno treba tražiti pouzdane i ponovljive mehanizme anti-melanogeneze. Fiziološki najznačajniji podražaj je UV, a među UVR signalizira epidermumelanocitiCREB os je najutvrđeniji put za regulaciju melanogeneze u ljudskom epidermisu [29]. Izloženost UV zračenju sukcesivno aktivira proizvodnju scAMP, PKA i transkripcijski faktor CREB, koji zauzvrat inducira ekspresiju MITF i nizvodno ciljanih melanogenih gena [38,39]. Uz fosforilaciju CREB pomoću PKA, nedavne studije su pokazale da je regrutiranje CREB-reguliranog koaktivatora transkripcije (CRTC) 3 u CREB transkripcijski kompleks također potrebno za MITF stimuliran cAMP-om. MITF ima najvažniju ulogu u regulacijisinteza melaninai rezultirajuća transkripcija melanogenih enzima [26,40,41]. Tijekom ovog procesa unutarstanične signalizacije, melanogenezu reguliraju ključni enzim, tirozinaza, i dodatni enzimski proteini, kao što su TRP-1 i DCT [1-4]. U ovoj studiji, karvedilol je učinkovito smanjio fosforilaciju CREB-a, što pokazuje da je smanjio MITF i proteine ​​tirozinaze inhibicijom MITF transkripcije (Slika 4). Uzimajući u obzir da je regulacija MITF mRNA gena složeno kontrolirana i spašavana drugim unutarstaničnim signalnim molekulama i koaktivatorima, regulacija razine transkripcije MITF-a je obećavajuća strategija za istraživanje zdravih sastojaka za izbjeljivanje kože jer je funkcija preživljavanja MITF-a očuvana i spašena [1,38,40]. Doista, kada smo istraživali FSK-induciranu transkripciju MITF-a, otkriveno je da MITF mRNA ima vlastitu vršnu krivulju odgovora za melanogenezu i stanično preživljavanje za staničnu homeostazu. Biološke funkcijemelanocitičini se da je intrinzično reguliran drugim povratnim signalima u ljudskim melanocitima. Štoviše, karvedilol ima manji rizik od nuspojava hipopigmentacije jer smanjuje aktivnost stanične tirozinaze tijekom vremena, a ne naglo.

Kateholamini uključuju dopamin, epinefrin i norepinefrin, a sintetiziraju se iz tirozina iz hrane djelovanjem enzima [42]. Biosinteza i razgradnja kateholamina odvija se u širokom rasponu stanica, uključujući neurone simpatičkih živaca i mozga, adrenomedularne stanice, endotelne stanice, neutrofile i mononuklearne stanice [43-45]. U ljudskoj koži, sinteza kateholamina odvija se u keratinocitima. Suprotno tome, melanociti također eksprimiraju mRNA i enzime za autokrinu sintezu norepinefrina, ali ne i epinefrina [7,42]. U ljudskimmelanociti, -1-AR može biti važan u reakciji na norepinefrin, alisinteza melaninatakođer je pod utjecajem funkcionalnog 2-AR signaliziranja [7,8]. Zanimljivo je da pacijenti s vitiligom imaju povećanu gustoću 2-AR u keratinocitima [46]. Povećane razine norepinefrina nalaze se u urinu i plazmi pacijenata s nesegmentalnim vitiligom, što ukazuje da bi metabolizam kateholamina mogao biti povezan s razvojem i napredovanjem vitiliga. [47]. Štoviše, uz klasične neurotransmitere stresa, melanociti proizvode neuropeptide i hormone, kao što su faktor oslobađanja kortikotropina i proopiomelanokortin. Tu proizvodnju stimuliraju UVR i drugi agensi koji djeluju unutar neuroendokrinog sustava kože [48]. Stoga su djelovanje kateholamina i melanocitna funkcija usko povezani u nizu složenih putova. Nadalje, karvedilol bi mogao interferirati s kemijskim reakcijama u melanogenom putu i tu bi mogućnost trebalo dodatno proučiti. Karvedilol može imati prednosti jer ima istodobne protuupalne učinke, budući da je većina hiperpigmentarnih poremećaja klinički ili subklinički PIH u tamnoputih pacijenata. Budući da je prodiranje karvedilola kroz kožu proučavano i in vitro i ex vivo, karvedilol se može razviti kao lokalniizbjeljivanjeagent u budućnosti [49–51].

Sustavna primjena karvedilola može uzrokovati bradikardiju, vrtoglavicu, hipotenziju, glavobolju i ošamućenost. Lokalna primjena karvedilola obično ne uzrokuje sustavne simptome; međutim, trebali bismo obratiti posebnu pozornost na te simptome kada ga primjenjujemo na pacijente s oštećenom kožnom barijerom, poput onih s atopijskim dermatitisom. Štoviše, ekcem, svrbež i lihenoidna erupcija prijavljeni su u rijetkim slučajevima pri uzimanju karvedilola. Ove dermatološke nuspojave, kao i kontaktni dermatitis također treba uzeti u obzir kada se karvedilol primjenjuje kao topikalizbjeljivanjeagent.

Zaključno, pokazali smo da karvedilol učinkovito smanjuje melanogenezu u ljudimelanocitii ex vivo ljudsku kožu inhibiranjem cAMP/CREB/MITF puta, što sugerira njegovu potencijalnu upotrebu kao učinkovito sredstvo za izbjeljivanje. Trebala bi uslijediti daljnja istraživanja funkcionalne uključenosti adrenergičnih receptora karvedilola u ljudske melanocite.

4. Materijali i metode

4.1. Materijali

Karvedilol, 3,4-dihidroksi-L-fenilalanin (L-DOPA), toksin kolere (CT) i 12-otetradekanoilforbol-13-acetat (TPA) kupljeni su od tvrtke Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, SAD). Dulbeccov modificirani Eagleov medij (DMEM) i Dulbeccova fiziološka otopina s fosfatnim puferom kupljeni su od WelGENE (Daegu, Koreja). Fetalni goveđi serum (FBS), antibiotik-antimikotik i tripsin-EDTA kupljeni su od Gibco (Grand Island, NY, SAD). Medij 254 (CascadeBiologicks, Portland, OR, SAD) i FSK ([3R-(3,4a,5,6,6a,10,10a,10b)]-5-(acetiloksi)-3-etenildodekahidro{ {24}},10,10b-trihidroksi-3,4a,7,7,10a-pentametil-1H-nafto[2,1-b]piran-1-on ) kupljeni su od Tocris Bioscience (Bristol, UK).

4.2. Stanične linije i kultura stanica

Primarni NHM dobiveni od Invitrogena (Carlsbad, CA, SAD) održavani su u Medijumu 254 (Thermo Fisher, Waltham, MA, SAD) dopunjenom dodatkom za rast ljudskih melanocita (Thermo Fisher). Mel-ab stanice, spontano besmrtne stanične linije melanocita dobivene iz miša, dobivene su iz Korejske banke staničnih linija (KCLB, Seul, Koreja) i održavane u DMEM-u dopunjenom s 10 posto FBS-a, penicilin-streptomicina, 100 nM TPA i 1 nM CT. Sve su stanice rutinski održavane na 37 ◦C u vlažnom okruženju s 5 posto CO2.

4.3. Antitijela i Western Blots

Stanice su jednom isprane hladnim PBS-om i lizirane u puferu za lizu proteina (1 posto SDS u 10 mMTris i 5 mM EDTA, pH 7,4), nakon čega je uslijedila inkubacija na 98 ◦C tijekom 10 minuta. Uzorci proteina odvojeni su elektroforezom u 8-postotnom SDS-poliakrilamidnom gelu, naneseni na nitrocelulozne membrane (GE Healthcare Life Sciences, Chicago, IL, SAD), a zatim blokirani s Tris-puferiranom fiziološkom otopinom koja sadrži 0,5 posto Tween 20 i 5 posto BSA, i podvrgnuti imunoblotingu. Antitijela na tirozinazu i TRP-1 kupljena su od Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, SAD), a MITF je kupljen od Abcam (Cambridge, UK). -tubulin (Gentex, Nizozemska, MI, SAD) korišten je kao interna kontrola opterećenja.

4.4. Sadržaj melanina

Citotoksični učinak karvedilola procijenjen je korištenjem kompleta Ez-Cytox Cell Viability Assay Kit (Dogen-Bio Co., Ltd., Seoul, Koreja) u skladu s uputama proizvođača. Mel-Ab stanice i NHM-ovi nasađeni su u ploče sa šest jažica pri gustoći od 6 × 105 odnosno 3 × 105 stanica/jažici. Stanice su tretirane karvedilolom, kao što je prikazano na slikama, 3 ili 5 dana (d). Prije mjerenja sadržaja melanina, stanice su promatrane pod fazno-kontrastnim mikroskopom i fotografirane (Olympus, Tokyo, Japan). Stanice su otopljene u 550 µL 1 N NaOH na 100 ◦C tijekom 30 minuta i centrifugirane na 13,000 okretaja u minuti tijekom 5 minuta. Apsorbancija supernatanta izmjerena je na 405 nm čitačem mikropločica. Unutarstanični sadržaj melanina predstavljen je kao postotak u odnosu na netretiranu kontrolu stanica. Kao pozitivna kontrola korišten je arbutin (100 mg/mL).

4.5. Aktivnost stanične tirozinaze

Aktivnost tirozinaze procijenjena je mjerenjem brzine stvaranja dopakroma L-DOPA. Nakon inkubacije s karvedilolom, stanice su isprane u ledeno hladnom PBS-u i lizirane u puferu za lizu tirozinaze (fosfatni pufer, pH 6,8, koji sadrži 1 posto Triton X{ {5}}) s ponovljenim ciklusima zamrzavanja/odmrzavanja. Lizati su pročišćeni centrifugiranjem na 15,000 okretaja u minuti na 4 ◦C tijekom 10 minuta. Nakon kvantificiranja razine proteina u lizatu i prilagođavanja koncentracije proteina puferom za lizu, 90 µL supernatanta pomiješanog s 10 µL 10 mM L-DOPA u puferu za lizu tirozinaze je inkubirano na 37 ◦C. Aktivnost stanične tirozinaze mjerena je očitavanjem apsorbancije na 475 nm pomoću čitača mikroploča svakih 10 min tijekom najmanje 1 h. Arbutin (100 mg/mL) korišten je kao pozitivna kontrola.

herba cistanches

4.6. Imunohistokemijska analiza

Tkiva ljudske kože umetnuta u parafin izrezana su na dijelove debljine 6-µm i obojena Melan-A (Novocastra, Newcastle, UK), Fontana-Masson kitovima (ID labs, London, ON, Kanada) i HMB45 (Santa Clara , CA, SAD), prema uputama proizvođača. Indeks melanina određen je mjerenjem postotka obojene površine u odnosu na ukupnu površinu tkiva pomoću softvera ImageJ 1.52a (National Institutes of Health, Bethesda, MD, SAD).

4.7. Statistička analiza

Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± standardna pogreška srednje vrijednosti (SEM), a statistička značajnost određena je neuparenim Studentovim t-testom korištenjem softvera GraphPad Prism5 (San Diego, CA, SAD). U ovoj studiji, p < 0.05,="" p="">< 0.01="" i="" p="">< 0.001="" smatrani="" su="" statistički="" značajnim="" i="" predstavljeni="" su="" sa="" *,="" **="" i="" ***,="">

Reference

1. Gillbro, JM; Olsson, MJ Melanogeneza i mehanizmi agenasa za posvjetljivanje kože—Postojeći i novi pristupi. Int. J. Cosmet. Sci. 2011, 33, 210–221. [CrossRef] [PubMed]

2. Lee, YJ; Shin, HJ; Ne, TK; Choi, KH; Chang, SE Liječenje melazme i postupalne hiperpigmentacije pikosekundnim 755-nm aleksandritnim laserom u azijskih pacijenata. Ann. Dermatol. 2017, 29,779–781. [CrossRef] [PubMed]

3. Lee, YJ; Park, JH; Lee, DY; Lee, JH Stečena bilateralna dispigmentacija na licu i vratu: klinički prikladni pristupi. J. Korean Med. Sci. 2016, 31, 2042–2050. [CrossRef] [PubMed]

4. Kang, HJ; Na, JI; Lee, JH; Roh, MR; Ko, JY; Chang, SE Postupalna hiperpigmentacija povezana s liječenjem solarnih lentigina korištenjem Q-Switched 532-nm Nd:YAG lasera: multicentrično ispitivanje.J. Dermatolog. Liječiti. 2017, 28, 447–451. [CrossRef] [PubMed]

5. Kato, H.; Araki, J.; Eto, H.; Doi, K.; Hirai, R.; Kuno, S.; Higashino, T.; Yoshimura, K. Prospektivna randomizirana kontrolirana studija oralne traneksamične kiseline za sprječavanje postupalne hiperpigmentacije nakon Q-switched rubin lasera. Dermatol. Surg. 2011, 37, 605–610. [CrossRef] [PubMed]

6. Taylor, CR; Anderson, RR Neučinkovito liječenje refraktorne melazme i postinflamatorne hiperpigmentacije rubin laserom s Q-sklopkom. J. Dermatol. Surg. Oncol. 1994, 20, 592–597. [CrossRef]

7. Gillbro, JM; Marles, LK; Hibberts, NA; Schallreuter, KU Autokrina biosinteza kateholamina i signal beta-adrenoreceptora potiču pigmentaciju u ljudskim epidermalnim melanocitima. J. Istraživanje. Dermatol.2004, 123, 346–353. [CrossRef]

8. Schallreuter, KU; Korner, C.; Pittelkow, MR; Swanson, NN; Gardner, ML Indukcija sustava prijenosa signala alfa-1-adrenoceptora na ljudskim melanocitima. Exp. Dermatol. 1996., 5, 20–23. [Usp. Ref.]

10. Sivamani, RK; Shi, B.; Griffiths, E.; Vu, SM; Lev-Tov, HA; Dahle, S.; Chigbrow, M.; La, TD; Mashburn, C.; Peavy, TR; et al. Akutna ozljeda mijenja beta2-adrenergičku signalizaciju i sintetske putove kateholamina u keratinocitima. J. Istraživanje. Dermatol. 2014., 134, 2258–2266. [CrossRef]

10. Emery, AC Kateholaminski receptori: Prototipovi za otkrivanje lijekova temeljenih na GPCR-u. Adv. Pharmacol. 2013, 68, 335–356.

11. Do Vale, GT; Ceron, CS; Gonzaga, NA; Simplicio, JA; Padovan, JC Tri generacije beta-blokatora: povijest, klasne razlike i klinička primjenjivost. Curr. hipertenzije. Rev. 2019, 15, 22–31. [PubMed]

12. McTavish, D.; Campoli-Richards, D.; Sorkin, EM Carvedilol: Pregled njegovih farmakodinamičkih i farmakokinetičkih svojstava i terapijske učinkovitosti. Lijekovi 1993, 45, 232–258. [CrossRef] [PubMed]

13. Hsu, CC; Lee, JY Izraženo crvenilo lica i uporni eritem rosacee učinkovito liječeni karvedilolom, neselektivnim beta-adrenergičkim blokatorom. J. Am. Akad. Dermatol. 2012, 67, 491–493. [CrossRef][PubMed]

14. Pietschke, K.; Schaller, M. Dugoročno liječenje izrazitog crvenila lica i perzistentnog eritema rozaceje liječenjem karvedilolom. J. Dermatolog. Liječiti. 2018, 29, 310–313. [CrossRef] [PubMed]

15. Chang, A.; Yeung, S.; Thakkar, A.; Huang, KM; Liu, MM; Kanassatega, RS; Parsa, C.; Orlando, R.; Jackson, EK; Andresen, BT; et al. Prevencija karcinogeneze kože beta-blokatorom karvedilolom. RakPrev. Res. 2015, 8, 27–36. [CrossRef] [PubMed]

16. Chen, M.; Liang, S.; Shahid, A.; Andresen, BT; Huang, Y. Beta-blokator karvedilol spriječio je oštećenje mišjih epidermalnih stanica posredovano ultraljubičastim zračenjem i 3D rekonstruiranu ljudsku kožu. Int. J.Mol. Sci. 2020, 21, 798. [CrossRef] [PubMed]

18. Huang, KM; Liang, S.; Yeung, S.; Oiyemhonlan, E.; Cleveland, KH; Parsa, C.; Orlando, R.; Meyskens, FL, Jr.; Andresen, BT; Huang, Y. Lokalno primijenjeni karvedilol smanjuje karcinogenezu kože izazvanu solarnim ultraljubičastim zračenjem. Rak Pret. Res. 2017, 10, 598–606. [CrossRef]

18. Brenner, M.; Sluh, VJ Zaštitna uloga melanina protiv UV oštećenja ljudske kože. Photochem. Photobiol. 2008, 84, 539–549.

19. Cleveland, KH; Liang, S.; Chang, A.; Huang, KM; Chen, S.; Guo, L.; Huang, Y.; Andresen, BT Carvedilolin inhibira stvaranje kolonija JB6 P plus posredovano EGF-om kroz mehanizam neovisan o adrenoreceptorima. PLoS ONE 2019, 14, e0217038. [CrossRef]

20. Dzong, G.; Zhongbing, M.; Qinye, F.; Zhigang, Y. Carvedilol suzbija migraciju i invaziju malignih stanica dojke inaktivacijom Src uključujući cAMP/PKA i PKCdelta signalni put. J. Cancer Res. Ther.2014, 10, 998–1003.

22. Rzepka, Z.; Bussman, E.; Beberok, A.; Wrzesniok, D. Od tirozina do melanina: signalni putovi i čimbenici koji reguliraju melanogenezu. Postepy Hig. Med. Dosw. Online 2016, 70, 695–708. [CrossRef]

22. Kim, Y.; Cho, JY; Oh, SW; Kang, M.; Lee, SE; Jung, E.; Park, YS; Lee, J. Globularni adiponektin djeluje kao melanogeni signal u ljudskim epidermalnim melanocitima. Br. J. Dermatol. 2018, 179, 689–701. [CrossRef][PubMed]

24. Slominski, A.; Tobin, DJ; Shibahara, S.; Wortsman, J. Pigmentacija melanina u koži sisavaca i njezina hormonska regulacija. Physiol. Rev. 2004, 84, 1155–1228. [PubMed]

25. Slominski, A.; Zmijewski, MA; Pawelek, J. L-tirozin i L-dihidroksifenilalanin kao hormonski slični regulatori funkcija melanocita. Melanoma pigmentnih stanica Res. 2012, 25, 14–27. [CrossRef] [PubMed]

25. Howe, J.; Costantino, R.; Slominski, A. O navodnom mehanizmu indukcije i regulacije melanogeneze L-tirozinom. Acta Derm Venereol. 1991, 71, 150–152.

26. D'Mello, SA; Finlay, GJ; Baguley, BC; Askarian-Amiri, ME Signalni putovi u melanogenezi. Int. J.Mol. Sci. 2016, 17, 1144. [CrossRef]

27. Jung, JA; Kim, BJ; Kim, MS; Ti, HJ; Yoon, ES; Dhong, ES; Park, SH; Kim, DW Zaštitni učinak botulinum toksina protiv pigmentacije kože izazvane ultraljubičastim zračenjem. Plast. Rekonstr. Surg. 2019, 144, 347–356.[CrossRef]

28. Jeong, YM; Oh, WK; Tran, TL; Kim, WK; Sung, SH; Bae, K.; Lee, S.; Sung, JH Aglycone od Rh4 inhibira sintezu melanina u stanicama melanoma B16: Moguće uključivanje puta protein kinaze A. Biosci. biotehnologija. Biochem. 2013, 77, 119–125. [CrossRef]

29. Kim, YH; Kim, D.; Hong, AR; Kim, JH; Yoo, H.; Kim, J.; Kim, I.; Kang, JZ; Chang, SE; Song, Y. Terapeutski potencijal Rottlerina za kožne hiperpigmentarne poremećaje inhibicijom transkripcijske aktivnosti CREB-reguliranih koaktivatora transkripcije. J. Istraživanje. Dermatol. 2019, 139, 2359-2367.e2.[CrossRef]

30. Das, A.; Ghosh, A.; Kumar, P. Kemijska leukoderma zbog hidrokinona: neobičan fenomen. Indijski J.Dermatol. Venereol. Leprol. 2019, 85, 567. [CrossRef]

31. Jow, T.; Hantash, BM Depigmentacija izazvana hidrokinonom: Prikaz slučaja i pregled literature. Dermatitis 2014, 25, e1–e5. [CrossRef]

32. Kersey, P.; Stevenson, CJ Vitiligo i profesionalna izloženost hidrokinonu od servisiranja strojeva za samofotografiranje. Kontaktirajte Dermat. 1981, 7, 285–287. [CrossRef] [PubMed]

33. Sasaki, M.; Kondo, M.; Sato, K.; Umeda, M.; Kawabata, K.; Takahashi, Y.; Suzuki, T.; Matsunaga, K.; Inoue, S. Rhododendron, fenolni spoj koji izaziva depigmentaciju, ispoljava citotoksičnost melanocita putem mehanizma ovisnog o tirozinazi. Melanoma pigmentnih stanica Res. 2014, 27, 754–763. [CrossRef] [PubMed]

34. Yoshikawa, M.; Sumikawa, Y.; Hida, T.; Kamiya, T.; Kase, K.; Ishii-Osai, Y.; Kato, J.; Kan, Y.; Kamiya, S.; Sato, Y.; et al. Klinička i epidemiološka analiza u 149 slučajeva leukodermije izazvane rododendronom.J. Dermatol. 2017, 44, 582–587. [CrossRef] [PubMed]

35. Harris, JE Kemijski izazvan vitiligo. Dermatol. Clin. 2017, 35, 151–161. [CrossRef] [PubMed]

36. Li-Sha, G.; Yi-He, C.; Na-Dan, Z.; Teng, Z.; Yue-Chun, L. Učinci liječenja karvedilolom na ekspresiju i fosforilaciju proteina koji veže kardijalni cAMPresponse element u akutnom miokarditisu izazvanom coxsackievirusom B3-. BMC Cardiovasc. Nered. 2013, 13, 100. [CrossRef] [PubMed]

37. Zhang, F.; Steinberg, SF S49G i R389G polimorfizmi beta(1)-adrenergičkog receptora utječu na signalizaciju putem cAMP-PKA i ERK puteva. Physiol. Genom. 2013, 45, 1186–1192. [CrossRef]

38. Lee, AY; Noh, M. Regulacija epidermalne melanogeneze putem cAMP i/ili PKC signalnih putova: Uvid u razvoj hipopigmentiranih agenasa. Arh. Pharm. Res. 2013, 36, 792–801. [CrossRef]

39. Garcia-Borron, JC; Abdel-Malek, Z.; Jimenez-Cervantes, C. MC1R, cAMP put i odgovor na sunčevo UV zračenje: proširenje horizonta izvan pigmentacije. Melanoma pigmentnih stanica Res. 2014, 27, 699-720.[CrossRef]

40. Lin, CB; Babiarz, L.; Liebel, F.; Roydon Price, E.; Kizoulis, M.; Gendimenico, GJ; Fisher, DE; Seiberg, M. Modulacija ekspresije gena faktora transkripcije povezane s mikroftalmijom mijenja pigmentaciju kože.J. Istražite. Dermatol. 2002., 119, 1330–1340. [CrossRef]

41. Kim, JH; Hong, AR; Kim, YH; Yoo, H.; Kang, JZ; Chang, SE; Song, Y. JNK potiskuje melanogenezu interferencijom s CREB-reguliranom koaktivatorom transkripcije 3-ovisnom o MITF ekspresiji. Theranostics 2020, 10, 4017–4029. [CrossRef] [PubMed]

43. Rios, M.; Habecker, B.; Sasaoka, T.; Eisenhofer, G.; Tian, ​​H.; Landis, S.; Chikaraishi, D.; Roffler-Tarlov, S. Sinteza kateholamina je posredovana tirozinazom u odsutnosti tirozin hidroksilaze. J. Neurosci. 1999, 19, 3519-3526. [CrossRef] [PubMed]

44. Cosentino, M.; Marino, F.; Bombelli, R.; Ferrari, M.; Lecchini, S.; Frigo, G. Endogena kateholaminska sinteza, metabolizam, skladištenje i unos u ljudskim neutrofilima. Life Sci. 1999, 64, 975–981. [CrossRef]

45. Marino, F.; Cosentino, M.; Bombelli, R.; Ferrari, M.; Lecchini, S.; Frigo, G. Endogena kateholaminska sinteza, skladištenje metabolizma i unos u mononuklearne stanice ljudske periferne krvi. Exp. Hematol. 1999, 27, 489-495. [CrossRef]

45. Sorrento, D.; Santulli, G.; Del Giudice, C.; Anastasio, A.; Trimarco, B.; Iaccarino, G. Endotelne stanice sposobne su sintetizirati i oslobađati kateholamine i in vitro i in vivo. Hypertension 2012, 60, 129-136 [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Cucchi, ML; Frattini, P.; Santagostino, G.; Preda, S.; Orecchia, G. Kateholamini se povećavaju u urinu nesegmentalnog vitiliga, posebno tijekom njegove aktivne faze. Pigment Cell Res. 2003, 16, 111–116. [CrossRef][PubMed]

47. Salzer, BA; Schallreuter, KU Ispitivanje strukture osobnosti u bolesnika s vitiligom i moguća povezanost s poremećenim metabolizmom kateholamina. Dermatologija 1995, 190, 109–115. [CrossRef][PubMed]

48. Slominski, A. Neuroendokrina aktivnost melanocita. Exp. Dermatol. 2009, 18, 760–763. [CrossRef]

50. Gannu, R.; Vishnu, YV; Kišan, V.; Rao, YM In vitro prodiranje karvedilola kroz svinjsku kožu: Učinak nosača i pojačivača prodiranja. PDA J. Pharm. Sci. Technol. 2008, 62, 256–263.

50. Kshirsagar, SJ; Bhalekar, MR; Mohapatra, SK Razvoj i procjena transdermalnog sustava za isporuku lijekova s ​​karvedilolom: In-vitro i in-vivo studija karakterizacije. Drug Dev. Ind. Pharm. 2012, 38, 1530–1537. [CrossRef]

51. Tanwar, YS; Chauhan, CS; Sharma, A. Razvoj i procjena transdermalnih flastera s karvedilolom. Acta Pharm. 2007., 57, 151–159. [CrossRef] [PubMed]