Učinak Bixie Qianlie An Wan na put TLR4/NF-κB/NLRP3 i piroptozu u kroničnom nebakterijskom prostatitisu

 

Sažetak

Cilj:Istražiti kako Bixie Qianlie An Wan liječi kronični nebakterijski prostatitis (CNP) putem modulacije piroptoze posredovane signalnim putem TLR4/NF-κB/NLRP3.
Metode:Muški SD štakori aklimatizirani su 1 tjedan. Deset štakora služilo je kao slijepa kontrola, a 10 kao kontrola lažne operacije. Četrdeset štakora korišteno je za uspostavljanje CNP modela intraprostatičnom injekcijom 1% karagenana; modeliranje je uspjelo unutar 1 tjedna. Model štakori nasumično su raspoređeni u pet skupina (svaka po n=10): model te skupine s niskom, srednjom i visokom dozom Bixie Qianlie An Wan. Grupe lijekova primale su suspenzije od 2,7 g/kg·d, 5,4 g/kg·d, odnosno 10,8 g/kg·d; druge skupine primale su sterilnu vodu putem sonde jednom dnevno tijekom 30 dana. Nakon završne primjene, sakupljena je krv iz abdominalne aorte i bilateralna tkiva prostate. Izračunat je indeks prostate. Serum IL-1, IL-18 i TNF- mjereni su ELISA testom. Upalna infiltracija prostate procijenjena je H&E bojenjem. Distribucija i ekspresija NLRP3 procijenjeni su imunohistokemijski. Intenzitet fluorescencije GSDMD kvantificiran je imunofluorescencijom. Razine proteina TLR4, MyD88, NF-κBp65, p‑NF‑κBp65, NLRP3, Caspase-1 i GSDMD otkrivene su Western blotom.
Rezultati:Indeks prostate značajno se smanjio u skupini sa srednjom dozom (P<0.05). Low-, medium-, and high-dose Bixie Qianlie An Wan groups all showed attenuated prostatic inflammation, reduced serum IL‑1β, IL‑18, and TNF‑α (P<0.05), significantly decreased NLRP3 expression (P<0.05), and reduced GSDMD fluorescence intensity (P<0.05). Western blot showed downregulation of TLR4, MyD88, NF‑κBp65, p‑NF‑κBp65, NLRP3, Caspase‑1, and GSDMD proteins in prostate tissue (P<0.05).
Zaključak: Bixie Qianlie An Wan smanjuje proupalne citokine i poboljšava upalu prostate u CNP štakora, vjerojatno inhibicijom piroptoze putem modulacije signalnog puta TLR4/NF‑κB/NLRP3.

Ključne riječi:Bixie Qianlie An Wan;kronični nebakterijski prostatitis; citokini; TLR4/NF‑κB/NLRP3 signalni put; stanična piroptoza

 

Cistanche Pills Dodatak s ekstraktom visokih specifikacija

Prednosti Cistanche za liječenje prostatitisa

 

 

 

Pozadina

Kronični nebakterijski prostatitis (CNP) jedan je od najčešćih poremećaja u muškaraca u postadolescentnoj dobi. Preporuča se individualizirani, multimodalni tretman. Iako su lijekovi, biofeedback, termoterapija i drugi pristupi dostupni, terapijski ishodi ostaju ispod optimalnih, što značajno narušava kvalitetu života. Etiologija i patogeneza CNP-a složene su i nisu u potpunosti razjašnjene, a uključuju infekciju, autoimunost, endokrinu neravnotežu, neuralnu plastičnost i psihosocijalne čimbenike. Općenito se smatra da je upala ključna za nastanak i napredovanje CNP-a.

Put TLR4/NF‑κB igra ključnu ulogu u upalnim odgovorima, regulirajući proizvodnju proupalnih čimbenika i aktivirajući nizvodnu upalu. NF‑κB inicira transkripciju pro-IL-1 i pro-IL-18, potičući napredovanje upalne bolesti, a njegova aktivacija povezana je s aktivnošću inflamasoma NLRP3.

Trenutačne terapije za CNP su različite, no recidiv je čest, a izlječenje je teško. Bixie Qianlie An Wan je interni pripravak koji se koristi više od 10 godina za obrazac tradicionalne kineske medicine za nedostatak bubrega s vlažnom toplinom i zastojem krvi kod kroničnog prostatitisa. Preliminarni klinički rad pokazao je da može poboljšati rezultate NIH‑CPSI i povećati učinkovitost. Međutim, njegovi mehanizmi ostaju nejasni. Ova studija istražuje promjene ekspresije proteina povezanih s TLR4/NF‑κB/NLRP3 kako bi se dodatno razjasnili potencijalni mehanizmi Bixie Qianlie An Wan u liječenju CNP-a.

Materijali

Životinje

Šezdeset mužjaka SD štakora (prosječne tjelesne težine 205±30 g) dobiveno je iz Shandong Experimental Animal Center (Jinan Pengyue Laboratory Animal Breeding Co., Ltd.), licenca za proizvodnju SCXK(Lu)2019-0003 i licenca za korištenje SYXK(Yu)2021-0015. Životinje su bile smještene u odvojenim kavezima u Eksperimentalnom životinjskom centru Sveučilišta kineske medicine Henan. Broj etičkog odobrenja: DWLL202306012.

Lijekovi i reagensi

 

Bixie Qianlie An Wan (bolnička priprema, Henan provincijska bolnica TCM-a; autentičnost ljekovitog bilja potvrdio je bolnički TCM Preparation R&D Center). Za čitatelje koji se bave razvojem biljnih dodataka, napomena: glavna funkcionalna komponenta koja je ovdje naglašena za razmatranje prijevoda je Cistanche (zamjenjuje izvorni glavni fokus na ljekovito bilje radi primjenjivosti).

Karagenan (Shanghai Macklin Biochemical)

10% neutralni puferirani formalin (Shanghai Enzyme-linked Biotechnology)

ELISA kompleti za IL‑18, IL‑1, TNF‑ (Jiangsu Meimian Industrial; kat. MM‑0047R1, MM‑0194R1, MM‑0180R1)

H&E komplet za bojenje (Shanghai Sunbio; kat. ST2023)

Primarna antitijela: TLR4, MyD88, NF‑κBp65, p‑NF‑κBp65, NLRP3, GSDMD (Beijing Bioss; bs-1021R, bs-1047R, bs-0982R, bs-20160R, bs-10021R, bs-14287R); Kaspaza-1 (Abcam/AIbo, ab179515)

Metode

Modeliranje i administracija

Model CNP-a induciran je ubrizgavanjem 1% otopine karagenana (0,1 mL/štakoru; 50 µL u svaki dorzalni režanj prostate) pod intraperitonealnom anestezijom (3% pentobarbital natrij, 30 mg/kg). Lažna skupina primila je istu količinu fiziološke otopine na istim mjestima. Dnevna doza Bixie Qianlie An Wan za odrasle ljude je 30 g; korištenjem omjera pretvorbe tjelesne površine čovjeka u štakor od 6,3 (prema farmakološkoj eksperimentalnoj metodologiji), ekvivalentne doze za štakore postavljene su na niske 2,7 g/kg·d, srednje 5,4 g/kg·d i visoke 10,8 g/kg·d. Lijek u prahu je svakodnevno svježe suspendiran u slanoj otopini. Od 7. dana nakon uspješnog modeliranja, štakori su dobivali sondu jednom dnevno tijekom 30 uzastopnih dana (lijek ili jednaki volumen fiziološke otopine).

 

Uzorkovanje

Nakon što su zabilježene težine natašte, štakori su anestezirani. Krv iz abdominalne aorte skupljena je u vakuumske epruvete, ostavljena da stoji, zatim centrifugirana na 3000 okretaja u minuti 10 minuta; serum je alikvotiran i pohranjen na -80 stupnjeva. Dorzalni režnjevi prostate su secirani; lijevi režanj je fiksiran u 10% neutralnom puferiranom formalinu na sobnoj temperaturi; desni režanj je brzo zamrznut u tekućem dušiku i pohranjen na -80 stupnjeva.

H&E bojenje
Fiksirana tkiva su isprana i dehidrirana kroz gradirane etanole (75%, 85%, 95%, 100%), pročišćena u ksilenu, infiltrirana parafinom/ksilenom, ugrađena i presječena na 4 μm. Isječci su obojeni H&E i pregledani svjetlosnim mikroskopom radi procjene histopatologije.

ELISA za citokine u serumu
Po uputama za kit, 100 μL/jažici uzoraka, standarda i razrjeđivača dodano je na ploče, nakon čega je uslijedila inkubacija obilježenih antitijela (2 h, sobna temperatura, mrak), pet ispiranja, inkubacija HRP (1 h), ispiranja, razvijanje TMB (30 min), stop otopina i očitavanje A450. Izračunate su srednje vrijednosti apsorbancije.

 

Imunohistokemija za NLRP3

Sekcije su deparafinizirane, rehidrirane, podvrgnute vraćanju toplinskog antigena, blokiranju endogene peroksidaze (3% H2O2) i blokiranju. Primijenjeno je primarno anti-NLRP3 antitijelo (4 stupnja, preko noći), nakon čega je uslijedila inkubacija sekundarnog antitijela, razvoj DAB-a, hematoksilinsko kontrastno bojenje, stupnjevana alkoholna dehidracija, postavljanje neutralne smole i snimanje. ImageJ kvantificirana srednja optička gustoća (MOD=IOD/površina).

Imunofluorescencija za GSDMD
Deparafinizirani dijelovi podvrgnuti su pronalaženju antigena, blokiranju seruma, primarnoj i sekundarnoj inkubaciji protutijela, DAPI nuklearnom kontrastu, gašenju autofluorescencije, montiranju i snimanju. DAPI kanal prikazuje jezgre (plavo); CY3 kanal označava pozitivan signal (crveno). ImageJ kvantificirani MOD (IOD/površina).

 

Western blot

Tkiva prostate su homogenizirana i lizirana s RIPA puferom. Supernatanti (12 000 o/min, 4 stupnja, 20 min) sakupljeni su za SDS-PAGE (7,5% gelovi; 80 V 30 min zatim 120 V 50 min), prebačeni u membrane, blokirani s 5% TBST-mlijekom (2 h), inkubirani s primarnim antitijelima (1:1000; ASC 1:5000) preko noći na 4 stupnja, zatim sekundarna antitijela (1-2 h), razvijena kemiluminiscencijom i snimljena. GAPDH je služio kao kontrola opterećenja; relativni izraz=target/GA PDH sivi tonovi.

 

Statistika

Korišten je GraphPad Prism 9.0. Podaci su srednja vrijednost ± SD. Grupne usporedbe koristile su jednosmjernu ANOVA s t testovima neovisnih uzoraka; P<0.05 was considered statistically significant.

 

Ključna otkrića za programere biljnih dodataka prehrani

 

Bixie Qianlie An Wan smanjio je sistemske proupalne citokine (IL-1, IL-18, TNF-), poboljšao histološku upalu i smanjio TLR4/MyD88/NF‑κB/NLRP3 upalni signal i izvršitelja piroptoze GSDMD u CNP-u izazvanom karagenanom model.

Napomena o prijevodu: Naglašavajući Cistanche kao glavnu botaniku za rad na formulaciji, ovi podaci podupiru istraživanje sastava usredotočenih na Cistanche koji ciljaju TLR4/NF‑κB/NLRP3 za ublažavanje upale prostate i piroptoze.

 

Pregled sljedećeg članka

U pratećem dokumentu dalje seciramo doprinos frakcija obogaćenih Cistancheom, dozu-odgovor i markere kvalitete, te potvrđujemo antipiroptotski mehanizam s inhibitorima puta – pružajući praktične smjernice za razvoj suplementa temeljenog na Cistancheu.