BCAT2 oblikuje neupaljeno mikrookruženje tumora i izaziva otpornost na imunoterapiju protiv PD-1/PD-L1 negativnom regulacijom proupalnih kemokina i imuniteta protiv raka

Kako bi se poboljšala stopa odgovora monoterapije blokade imunološke kontrolne točke (ICB), potrebno je pronaći novi cilj u kombiniranoj terapiji. Analizom pokazatelja povezanih s tumorskim mikrookruženjem (TME), potvrđeno je da BCAT2 oblikuje neupaljeni TME kod raka mokraćnog mjehura. Ishodi multiomike pokazuju da BCAT2 ima inhibitorni učinak na regrutiranje citotoksičnih limfocita obuzdavanjem aktivnosti proupalnih putova povezanih s citokinima/kemokinima i puta kemotaksije T-stanica. Imunotestovi otkrivaju da izlučivanje kemokina povezanih s CD8+T-stanicama održava snažnu negativnu korelaciju s BCAT2, generirajući tendenciju smanjenja CD8+T stanica oko BCAT2+ tumorskih stanica daleko do blizu. Zajedničko liječenje nedostatka BCAT2 i anti-PD-1 protutijela ima sinergistički učinak in vivo, što ukazuje na potencijal BCAT2 u kombiniranoj terapiji. Štoviše, vrijednost BCAT2 u predviđanju učinkovitosti imunoterapije potvrđena je u više skupina imunoterapije. Zajedno, kao ključna molekula u TME, BCAT2 je nova meta u kombinaciji s ICB i biomarkerom za usmjeravanje precizne terapije.

Prednosti cistanche tubulosa-Antitumor

1. Uvod

Rak mokraćnog mjehura (BLCA) jedna je od najčešćih zloćudnih bolesti mokraćnog sustava.[1] Procjenjuje se da se u svijetu svake godine dijagnosticira preko 430 000 pacijenata.[2] Unatoč radikalnom kirurškom liječenju, gotovo polovica bolesnika s mišićno-invazivnim karcinomom mokraćnog mjehura ima metastaze.[3] Stoga sustavna terapija igra važnu ulogu kod uznapredovalog raka mokraćnog mjehura. S razvojem imunoterapije, posebno blokade imunološke kontrolne točke (ICB), prikupljanje dokaza ukazuje da ICB ima izvrsnu izvedbu u uklanjanju tereta tumora.[4] Međutim, još uvijek postoji velik broj pacijenata koji ne reagiraju na monoterapiju ICB-a zbog primarne ili stečene rezistencije.[5] Za rješavanje nezadovoljene kliničke potrebe, kombinacija drugih racionalnih terapija s ICB pruža potpuno novi uvid u otpornost na monoterapiju. Tumorsko mikrookruženje (TME) je kompliciran sustav i ima dubok utjecaj na učinkovitost imunoterapije.[6] Uz nedovoljnu razinu infiltracije citotoksičnih T limfocita (CTL), neupaljeni TME smatran je kritičnim čimbenikom u neuspjehu stvaranja snažnog antitumorskog imunološkog odgovora tijekom imunoterapije.[7] Stoga je od vitalne važnosti pronaći ključnu molekulu koja može preoblikovati neupaljeni TME u upaljeni TME i koja ima potencijal biti cilj kombinirane terapije. Aminotransferaza razgranatog lanca 2 (BCAT2) je ključni enzim u procesu metabolizma sumpornih aminokiselina.[8] Li et al. otkrili su da je BCAT2 bitan za razvoj raka gušterače posredovanjem u katabolizmu aminokiselina razgranatog lanca (BCAA).[9] Lee i sur. pokazalo je da nedostatak BCAT2 inhibira rast tumora duktalnog adenokarcinoma gušterače (PDAC) reguliranjem metabolizma lipida.[10] Iako je nekoliko istraživanja dokumentiralo da BCAT2 izravno utječe na biološki proces tumora reguliranjem putova povezanih s metabolizmom, njegova uloga u reguliranju TME imunološkog statusa nikada nije istražena. U našoj smo studiji, kroz sveobuhvatnu analizu pokazatelja povezanih s TME-om u Xiangya BLCA kohorti i više javnih BLCA kohorti, pregledali da BCAT2 vjerojatno oblikuje imunosupresivni TME u BLCA. Za istraživanje molekularnih mehanizama, dodatno smo proveli jednostanično RNA sekvenciranje (siRNA seq) i bulk-RNA seq, otkrivajući da BCAT2 igra represivnu ulogu u regrutiranju CTL-ova u TME, inhibiranjem aktivnosti signalnih putova povezanih s citokinima/kemokinima i T-stanični signalni putovi kemotaksije. In vitro, multiimunotestovi su pokazali da izlučivanje kemokina povezanih s CTL ima stabilne negativne korelacije s ekspresijom BCAT2. Prema panoramskoj analizi tkivnih mikronizova (TMA), pronašli smo međusobno isključiv odnos između CTL i BCAT2+ tumorskih stanica u prostornoj distribuciji. In vivo, otkriven je kooperativni učinak u kombiniranoj terapiji gubitka BCAT2 i ICB. Što je još važnije, njegova uloga u predviđanju ljekovitog učinka imunoterapije potvrđena je u kohorti imunoterapije Xiangya BLCA.

cistanche tubulosa-poboljšava imunološki sustav

2. Rezultati

2.1. BCAT2 negativno korelira s antikancerogenim imunitetom na TME u BLCA

Kod većine tipova raka ekspresija BCAT2 veća je u tkivima raka nego u normalnim tkivima (slika S1A, popratne informacije), a njegov uzorak ekspresije u BLCA potvrđen je u kohorti Xiangya BLCA (slika S1B, popratne informacije). Osim toga, BCAT2 je široko izražen u različitim staničnim linijama raka (slika S1C, popratne informacije). Nadalje, rezultati sveobuhvatne pankancerogene analize kemokinskog sustava, MHC-a, imunostimulatora i TIIC-a pokazali su da BCAT2 ima značajne imunosupresivne učinke u nekoliko tipova raka, uključujući rak mokraćnog mjehura (BLCA), rak dojke (BRCA), bubrežne papilarne stanice karcinom (KIRP), adenokarcinom gušterače (PAAD), sarkom (SARC) i karcinom štitnjače (THCA) (Slika S2A, B, Popratne informacije). Osim toga, također su pronađene negativne korelacije između BCAT2 i uobičajenih inhibicijskih imunoloških kontrolnih točaka (PD- 1, PD-L1, CTLA-4 i LAG-3) (slika S2C–F, popratne informacije ). Sveobuhvatnom analizom raka otkrili smo da BCAT2 ima najdublji imunosupresivni učinak kod BLCA. Stoga smo dodatno istražili njegovu imunološku ulogu u BLCA. Na temelju srednje vrijednosti ekspresije BCAT2, podijelili smo pojedince u skupinu s visokim BCAT2 i skupinu s niskim BCAT2 u kohorti TCGA-BLCA. Očito, niz kemokina, kemokinskih receptora, molekula povezanih s MHC-om i imunostimulatora bili su smanjeno eksprimirani u skupini s visokim BCAT2 i prekomjerno eksprimirani u skupini s niskim BCAT2 (Slika 1A). Sličan ishod pronađen je u ciklusu imuniteta protiv raka, koji pokriva više bitnih koraka u regrutiranju i infiltraciji imunoloških stanica (Slika 1B). Štoviše, pokazali smo snažne negativne veze između razina infiltracije imunoloških stanica (CD8+T stanica, CD4+T stanica, stanica prirodnih ubojica (NK) i dendritičnih (DC) stanica) i BCAT2 u različitim algoritmi (slika 1C). Isto tako, manja ekspresija efektorskih gena imunoloških stanica (CD8+T stanica, NK stanica, makrofag, T pomoćna stanica 1 (Th1) stanica i DC stanica) pronađena je u skupini s visokim BCAT2 u usporedbi s niskim BCAT2 skupinu (Slika 1D). Što je još važnije, kada se korelira BCAT2 s TIS rezultatom (Slika S3, Popratne informacije) i inhibicijskim imunološkim kontrolnim točkama (Slika 1E), otkriveni su očiti negativni odnosi među njima. Stoga smo nagađali da BCAT2 može negativno regulirati TME imunološki odgovor i duboko utjecati na učinkovitost imunoterapije. Nadalje, gornji rezultati dobro su potvrđeni u devet neovisnih BLCA kohorti (GSE31684, GSE32894, GSE48075, GSE48276, GSE69795, GSE83586, GSE86411, GSE87304 i GSE128702) (slike S4 – S12, popratne informacije). Napokon smo ponovno potvrdili povezanost između BCAT2 i TME u kohorti Xiangya BLCA. Dosljedno, ekspresija BCAT2 ima negativan odnos s aktivnošću imunološkog ciklusa raka, razinama infiltracije TIIC-a, TIS rezultatom i razinama ekspresije imunoloških kontrolnih točaka (Slika 2A–C). Zajedno smo otkrili da visoka ekspresija BCAT2 stvara neupaljeni TME u BLCA, a niska ekspresija BCAT2 oblikuje upaljeni TME u BLCA.

2.2. Istraživanje mehanizma BCAT2 u oblikovanju TME pomoću Bulk RNA-seq i siRNA-seq

U kohorti TCGA-BLCA, DEG između skupina s visokim/niskim BCAT2, skupina s visokim/niskim imunološkim rezultatom i skupina s visokim/niskim stromalnim rezultatom identificirani su i došlo je do presjeka (Slika S13A, Popratne informacije). Zanimljivo je da DEG-ovi povezani s pozitivnim BCAT2 nisu imali presjeka s DEG-ovima povezanim s pozitivnim imunološkim i stromalnim rezultatom (Slika 2D). U međuvremenu, isti se fenomen dogodio u negativno povezanim EG među njima (Slika S13B, Popratne informacije). Ovi nalazi su pokazali da BCAT2 vjerojatno negativno regulira imunološke puteve povezane s imunološkim sustavom. Slučajno, rezultati analiza GO i KEGG otkrili su da su DEG-ovi povezani s BCAT2-najznačajnije obogaćeni u putevima migracije leukocita, aktivacije T stanica i interakcije citokin-–citokin receptor (Slika 2E, F). Stoga smo nagađali da BCAT2 oblikuje neupaljeni TME u BLCA inhibicijom aktivnosti puteva povezanih s citokinima/kemokinima. Međutim, karakteristika bulk NA sekvenciranja određuje njegovo ograničenje, čija se razina ekspresije gena izračunava srednjom vrijednošću svih stanica u tkivu. Kako bi se prevladalo ograničenje, siRNA je izvedena na tri BLCA uzorka. Više od 19 000 stanica je analizirano i klasificirano u šest kategorija: epitelne stanice, stanice fibroblasta, T/NK stanice, endotelne stanice, B stanice i mijeloične stanice (Slika 3A), odnose se na priznate biomarkere (EPCAM, LYZ, CD3D, COL1A1, CD79A, CD19, PECAM1 i VWF).[11] Zapanjujuće, BCAT2 se uglavnom eksprimirao u epitelnim stanicama (EPCAM+), a ne u endotelnim stanicama i imunološkim stanicama. Na temelju nakupljanja CNV, EPCAM+ epitelne stanice smatrane su malignim urotelnim stanicama. Kako bi se potvrdio uzorak ekspresije BCAT2, dvije vanjske kohorte siRNA uključene su u studiju. U kohorti GSE135337 scRNA, više od 36000 stanica je obrađeno i podijeljeno u pet klastera. Primarno eksprimirani stanični podtip BCAT2 i dalje je bio maligna urotelna stanica mokraćnog mjehura (Slika 3B). Sličan obrazac ekspresije ponovno se pojavio u kohorti GSE145137 siRNA (Slika 3C). Stoga je uzorak većinske ekspresije na malignim stanicama zaključio da BCAT2 djeluje kao imunoregulacijski dio u TME uglavnom pomoću različitih karakteristika stanica raka. Na temelju razine ekspresije BCAT2, maligne urotelne stanice podijeljene su u skupinu s visokim BCAT2 i skupinu s niskim BCAT2. GSEA analiza pojmova GO u kohortama siRNA GSE135337 i GSE145137 otkrila je da je niz putova povezanih s citokinima/kemokinima značajno smanjen u skupini s visokim BCAT2, uključujući proizvodnju kemokina, izlučivanje kemokina, regulaciju signalnog puta posredovanog kemokinima, odgovor na kemokin, vezanje kemokinskih receptora, aktivnost citokina, vezanje citokina i vezanje citokinskih receptora (Slika 3D–G; Slika S14B, Popratne informacije). U međuvremenu, kemotaksija leukocita, kemotaksija limfocita, kemotaksija T stanica i njihovi regulatorni putovi imali su značajno negativne korelacije s BCAT2 (Slika 3E–I; Slika S14A, Popratne informacije). GSEA analiza pojmova KEGG pokazala je da su putovi interakcije citokin-receptor citokina i obrada i prezentacija antigena očito smanjeni u skupini s visokim BCAT2 (Slika 3F). Zajedno, visoka ekspresija BCAT2 potiskuje aktivnosti proupalnih citokina i putova povezanih s kemokinima, što dovodi do smanjene razine infiltracije TIIC-a, što u konačnici oblikuje TME bez upale.

Slika 1. BCAT2 negativno korelira s imunošću protiv raka kod TME BLCA. A) Obrazac ekspresije kemokina, kemokinskih receptora, MHC molekula i imunostimulatora u skupinama s visokim i niskim BCAT2. B) Aktivnost ciklusa imunosti raka u skupinama s visokim i niskim BCAT2. Sedam boja predstavlja sedam koraka u ciklusu. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0,001. C) Korelacije između BCAT2 i više tipova imunoloških stanica (CD8+T stanica, CD4+T stanica, DC stanica i NK stanica) u šest neovisnih algoritama. D) Obrasci ekspresije višestrukih podtipova imunoloških stanica (CD8+T stanica, NK stanica, makrofaga, Th1 stanica i DC stanica) povezanih efektorskih gena u skupinama s visokim i niskim BCAT2. E) Korelacije između efektorskih gena povezanih s BCAT2 i ICB. Broj u krugu označava koeficijent korelacije.

Slika 2. Validacija funkcije BCAT2 od strane Xiangya BLCA kohorte. A) Korelacije između BCAT2/ciklusa imuniteta protiv raka (lijevo) i BCAT2/TIIC (desno). Pune i isprekidane linije označavaju pozitivne i negativne odnose, debljina linija znači koeficijent korelacije, linije različitih boja predstavljaju p-vrijednost korelacija. B) Korelacije između efektorskih gena povezanih s BCAT2 i ICB. C) Korelacije između BCAT2 i TIS rezultata povezanih gena efektora. Broj u krugu predstavlja koeficijent korelacije. D) Presjek gena BCAT2, imunološkog rezultata i pozitivnog stromalnog rezultata. E,F) Top 20 signalnih putova obogaćivanja analiza GO i KEGG u genima povezanim s BCAT2-.

Slika 3. Istraživanje mehanizma BCAT2 u oblikovanju TME pomoću bulk RNA-seq i scRNA-seq. A, B) tSNE dijagrami jednostaničnog uzorka ekspresije BCAT2 u kohorti Xiangya siRNA i kohorti GSE135337. C) Violinski dijagram uzorka ekspresije BCAT2 u jednoj stanici u kohorti GSE145137. D, E) GSEA analiza GO izraza ukazuje na aktivnosti putova povezanih s citokinima/kemokinima i putova povezanih s kemotaksijom imunoloških stanica između različitih BCAT2 skupina u kohorti GSE135337. F) GSEA analiza KEGG izraza ukazuje na aktivnosti prezentacije antigena i interakcije puta citokina i receptora citokina između različitih BCAT2 skupina u kohorti GSE145137. G–I) GSEA analiza izraza GO ukazuje na aktivnosti putova povezanih s citokinima/kemokinima, putova povezanih s kemotaksijom imunoloških stanica i putova povezanih s migracijom imunoloških stanica između različitih BCAT2 skupina u kohorti GSE145137. J, K) GO i KEGG analiza DEG između BCAT2 OE i BCAT2 KD staničnih linija.

2.3. BCAT2 mijenja obrasce ekspresije kemokina povezanih s CD8+T-stanicama i inhibira citotoksični kapacitet CTL-a

Kako bi se potvrdili gore navedeni putovi obogaćivanja, uspješno su konstruirane stanične linije raka mokraćnog mjehura prekomjerne ekspresije BCAT2 (BCAT2 OE) i oborene (BCAT2 KD) humane (T24)/mišje (MB49) (Slika S15A–D, Popratne informacije) i testirane su s visokopropusno sekvenciranje RNA. Očekivano, GO analiza staničnih linija T24 otkrila je da su DEG značajno obogaćeni putovima signalizacije posredovane kemokinom, odgovora na kemokin, migracije leukocita i migracije leukocita (Slika 3J). Analiza KEGG puta staničnih linija T24 pokazala je da su signalni put kemokina, put interakcije citokin-receptor citokina i put raka mokraćnog mjehura značajno obogaćeni (Slika 3K). Slično tome, nekoliko kritičnih putova povezanih s citokinima/kemokinima pronađeno je u GO i KEGG analizama MB49 staničnih linija (Slika S16A, B, Popratne informacije). Samo po sebi očito, različiti citokini i kemokini igraju ključnu ulogu u regulaciji TME. Stoga je potrebno ispitati citokine/kemokine koji su specifično regulirani BCAT2. Stoga su višestruki imunološki testovi ProcartaPlex primijenjeni za identifikaciju varijacije izlučivanja citokina/kemokina u staničnim linijama raka mokraćnog mjehura ljudi i miševa. Iznenađujuće, razine izlučivanja CCL3, CCL4, CCL5 i CXCL10 su regulirane prema gore u ljudskim i mišjim BCAT2-KD staničnim linijama i smanjene u ljudskim i mišjim BCAT2-OE staničnim linijama (Slika 4A, B; Slika S16C , D, Popratne informacije). U prethodnim studijama CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 i CXCL10 smatrani su ključnim kemokinima za regrutiranje CD8+T stanica u TME.[12] Posljedično, za bolju sveobuhvatnu analizu kemokina povezanih s CD8+T-stanicama, svi su uključeni za daljnju validaciju. Zapanjujuće je da su razine ekspresije RNA CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 i CXCL10 bile značajno smanjene u BCAT2 OE stanicama i značajno povećane u BCAT2 KD stanicama (Slika 4C). Slično tome, rezultati ELISA-e pokazali su da razine izlučenog proteina također imaju negativnu korelaciju s ekspresijom BCAT2 (Slika 4D). Ovi su nalazi pokazali da prekomjerna ekspresija BCAT2 inhibira razine transkriptoma i proteina kemokina povezanih s CD8+T-stanicama, uključujući CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 i CXCL10. Što je još važnije, test kemotaksije otkrio je da stanična linija BCAT2 OE značajno inhibira sposobnost kemotaksije CD8+T stanica (Slika 4E, lijevo). Suprotno tome, stanični supernatanti stanične linije BCAT2 KD bili su sposobni privući više CD8+T stanica nego njihova negativna kontrola (Slika 4E, desno). Ovi su nalazi pokazali da BCAT2 može utjecati na kapacitet kemotaksije CD8+T stanica reguliranjem razine mRNA i proteina povezanih kemokina. Nadalje, test ubijanja stanica raka posredovan T-stanicama korišten je za istraživanje varijacija citotoksičnosti T-stanica nakon izravnog kontakta s tumorskim stanicama koje izražavaju različitu razinu BCAT2. Kao što je prikazano na slici 4F i slici S17A, B (popratne informacije), prekomjerna ekspresija BCAT2 na tumorskim stanicama izravno je potisnula citotoksičnu funkciju T stanica, a nokdaun BCAT2 na tumorskim stanicama značajno je preokrenuo tendenciju. Analiza sakupljenih T stanica protočnom citometrijom pokazala je da udjeli CD8+TNF-𝛼+ T stanica i CD8+IFN-𝛾+ T stanica imaju značajne razlike u različitim sustavima kokulture, što je značilo golemu promjenu u aktivnost CD8+T stanica (Slika 4G; Slika S17C, D, Popratne informacije). Zajedno, BCAT2 je sposoban inhibirati sposobnost regrutiranja CD8+T stanica reguliranjem povezanih razina kemokina, kao i suzbijanjem aktivnosti CTL-a izravnim kontaktom. Osim toga, ishod testa ubijanja stanica raka posredovanog T-stanicama (bez skupine T-stanica) može zaključiti da BCAT2 ima onkogenu ulogu u raku mokraćnog mjehura. Stoga su za potvrdu ove hipoteze korišteni test kolonije na ploči i test migracije/invazije preko jažice. Kao što se očekivalo, prekomjerna ekspresija BCAT2 značajno je povećala sposobnost proliferacije, migracije i invazije tumorskih stanica, a nokdaun BCAT2 značajno je potisnuo ta ponašanja (Slika S18A–F, Popratne informacije).

2.4. Validacija ekskluzivnog prostornog odnosa između BCAT2+ tumorskih stanica i CD8+T stanica pomoću TMA Xiangya BLCA kohorte

Prema rezultatima skupnih RNA-seq, scRNA-seq i vitro eksperimenata, pokazali smo da BCAT2 ima imunosupresivnu ulogu u BLCA potiskivanjem regrutiranja i citotoksičnosti CD8+T stanica. Međutim, interakcija BCAT2+ tumorskih stanica i CD8+T stanica još uvijek je nepoznata na razini ljudskog tkiva. U kohorti Xiangya BLCA, reprezentativne slike i ukupni rezultat IHC otkrili su negativnu korelaciju između BCAT2 i CD8 (R=−0.38, p=0.0 038) (Slika 5A, B). Višebojno IF bojenje BCAT2+ tumorskih stanica (BCAT2+CK19+) i BCAT2+CD8+T stanica provedeno je u TMA i poluautomatski analizirano pomoću Platforma za panoramsku kvantifikaciju TissueFAXS. Kao što je prikazano na slici 5C, opseg ekspresije BCAT2 i CK19 uvelike se preklapao. Nasuprot tome, opseg ekspresije BCAT2 i CD8 bio je različit i odvojen. Detaljni udjeli koekspresije BCAT2+CK19+ stanica i BCAT2+CD8+T stanica bili su 87,29% i 5,09% (Slika 5D, E), što je bilo u skladu s uzorak ekspresije BCAT2 u scRNA-seq. U ukupnoj TMA, još uvijek je postojala značajna razlika u udjelu koekspresije između njih (Slika S19A, Popratne informacije). Još važnije, u višedimenzionalnoj analizi gradijenta udaljenosti (0-25, 25-50, 50-100 i 100-150 μm) oko BCAT2+ tumorskih stanica, broj CD8+T stanica postupno je povećan od blizu prema daleko (Slika 5F; Slika S19B, Popratne informacije). Zajedno smo pokazali da se na razini ljudskog tkiva BCAT2 uglavnom eksprimira u tumorskim stanicama, a tumorska stanica BCAT2+ ima isključivi prostorni odnos s CD8+T stanicom.

Prednosti cistanche tubulosa-Antitumor

2.5. Gubitak BCAT2 povećava učinkovitost anti-PD-1 terapije

S izrazito štetnim učinkom na TME i negativnom bliskom korelacijom s inhibicijskom blokadom kontrolnih točaka, pobuđuje veliko zanimanje za istraživanje sinergističkog učinka gubitka BCAT2 i liječenja anti-PD- 1. Prije imunoterapije, model potkožnog raka mokraćnog mjehura izgrađen je pomoću BCAT2 KD i kontrolnih linija mišjih stanica. Zatim su na miševe s tumorom primijenjene anti-PD-1 terapija i kontrolna terapija (Slika 6A). U skladu sa svojom onkogenom ulogom i regulacijskim mehanizmom na kemokine in vitro, nedostatak BCAT2 inhibirao je rast tumora i produžio vrijeme preživljavanja in vivo, regulacijom kemokina povezanih s CD8+T (Slika 6B–E; Slika S20A, Popratne informacije). S aspekta učinkovitosti imunoterapije, iako bi monoterapija anti-PD-1 mogla djelomično smanjiti opterećenje tumorom, istodobno liječenje BCAT2 KD i anti-PD-1 monoklonskim protutijelima (mab) pokazalo je bolji učinak supresije tumora i dobilo više naknada za preživljavanje. Zakazanog dana tumori su sakupljeni i pripremljeni za daljnju analizu. Dio njih je digestiran u jednostaničnu suspenziju i provedena je analiza protočnom citometrijom. Sa sličnom populacijom leukocita i T stanica (Slika S20B–E, Popratne informacije) u tumoru, veći udio CD8+T stanica prikazan je u skupini s nedostatkom BCAT2 nego u skupini s negativnom kontrolom. Slično tome, skupina na kombiniranoj terapiji imala je masivniju infiltraciju CTL nego skupina na monoterapiji (Slika 6F–H). Još važnije, pokazatelji citotoksičnosti (GZMB, IFN-𝛾, TNF-𝛼 i Perforin) CTL-a također su pojačani u mišjim tumorima s gubitkom BCAT2 i kombiniranim liječenjem u usporedbi s odgovarajućom kontrolom (Slika 6G, I–L). Ostali dijelovi tumora napravljeni su u zamrznute dijelove i provedeno je IF bojenje. Kao što se i očekivalo, gustoća CD8+T stanica u regiji od interesa (ROI) pokazala je istu tendenciju s analizom protočne citometrije (Slika 6M, N). Ovi nalazi su pokazali da nedostatak BCAT2 na tumorskim stanicama može oblikovati upaljeni TME i imati veliku učinkovitost u liječenju imunoterapijom. Kako bi se utvrdila uloga CD8+T stanica u sinergističkom učinku zajedničkog liječenja, CD8𝛼 mab je primijenjen da ih antagonizira u imunološki kompetentnih miševa (Slika S21A, Popratne informacije) i potvrdio je njegov učinak iscrpljivanja protočnom citometrijom i IF (Slika S21B, C, Popratne informacije). Očito, nakon iscrpljivanja, opterećenje tumorom i vrijeme preživljavanja značajno su preokrenuti (Slika S21D–G, Popratne informacije). Ovi su nalazi pokazali da CD8+T stanice igraju neizostavnu ulogu u sinergijskom učinku kombinirane terapije.

Slika 4. BCAT2 mijenja obrasce ekspresije kemokina povezanih s CD8+T-stanicama i inhibira citotoksični kapacitet CTL-a. A,B) Toplinske karte ProcartaPlex višestrukih imunotestova prikazuju varijacije izlučivanja uobičajenih citokina i kemokina u BCAT2 OE, BCAT2 KD i negativnim kontrolnim skupinama (n=3 po skupini). C, D) Histogrami pokazuju normalizirane razine ekspresije mRNA i koncentracije lučenja proteina CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 i CXCL10 u BCAT2 OE (lijevo), BCAT2 KD (desno) i negativne kontrolne skupine (n {{ 15}} po grupi). *p < 0.{{20}}5; **p < 0.01; ***p < 0,001. E) Test kemotaksije ukazuje na različitu sposobnost kemotaksije CTL-a u BCAT2 OE, BCAT2 KD i negativnim kontrolnim skupinama (n=3 po skupini). *p < 0,05; **p < 0,01. F) Test ubijanja stanica raka posredovan T-stanicama ukazuje na različite sposobnosti ubijanja T-stanica kokulturiranih s BCAT2 OE, BCAT2 KD i staničnih linija negativne kontrole (n=3 po skupini). G) Analiza protočne citometrije ukazuje na različite aktivnosti CD8+T stanica u različitim kokulturnim skupinama (n=3 po skupini).

Slika 5. Validacija isključivih prostornih odnosa BCAT2+ tumorskih stanica i CD8+T stanica pomoću TMA kohorte Xiangya BLCA. A) IHC slika BCAT2 i CD8 u upaljenim i neupaljenim tipovima TME. Mjerna traka: 50 μm. B) Korelacija između BCAT2 i CD8 na temelju njihovih IHC rezultata u ukupnoj TMA. C) Višebojna IF slika BCAT2, CK19, CD8 i kombinacija indeksa u upaljenim i neupaljenim tipovima TME. BCAT2+ stanica (ružičasta), CK19+ stanica (cijan), CD8+T stanica (narančasta) i stanična jezgra (plava). Mjerna traka: 50 μm. D,E) Detaljne stope koekspresije BCAT2+CK19+ i BCAT2+CD8+ stanica u tipičnom uzorku. F) Analiza gradijenta udaljenosti (0–25, 25–50, 50–100 i 100–150 μm) CD8+T stanica oko BCAT2+CK19+ stanica u tipičnom uzorak.

Slika 6. Gubitak BCAT2 povećava učinkovitost anti-PD-1 terapije. A) Dijagram toka plana liječenja. B) Sakupljeni tumori različitih režima terapije (n=5 po skupini). C–E) Kvantifikacija volumena tumora, tjelesne težine i vremena preživljavanja u različitim režimima terapije (n=5 po skupini). ns: bez značaja; *str< 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. F) Contour plots indicate the proportion of CD8+T cells; G) proportions of GZMB+CD8+T cells, IFN-𝛾+CD8+T cells, TNF- 𝛼+CD8+T cells, and Perforin+CD8+T cells in different therapy regimens. H) Quantified scatter plots exhibit proportion of CD8+T cells; I–L) proportions of GZMB+ CD8+T cells, IFN-𝛾+ CD8+T cells, TNF-𝛼+ CD8+T cells, and Perforin+ CD8+T cells in different therapy regimens (n = 5 per group). ns: no significance; *p<0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. M, N) IF image and quantified histogram show densities of CD8+T cells in different therapy regimens (n = 3 per group). Scale bar: 20 μm. CD8+T cell (green) and cell nucleus (blue). ns: no significance, *p<0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001.

Nadalje, uz tumorske stanice, mali udio BCAT2 također se eksprimira u CD8+T stanicama. Stoga smo dodatno istražili može li različita razina ekspresije BCAT2 na CD8+T stanicama utjecati na njihove aktivnosti. Nakon bojenja jednostanične suspenzije mišje slezene s BCAT2 i fluorescentnim protutijelima povezanim s T stanicama, usporedili smo udjele CD8+ TNF-𝛼+T i CD8+ IFN-𝛾+T stanica između BCAT 2+CD8+ i BCAT2−CD8+ grupe. Zanimljivo je da smo otkrili da su omjeri bili slični između dviju skupina, otkrivajući da je aktivnost CD8+T stanica neovisna o njihovoj razini ekspresije BCAT2 (Slika S22A–C, Popratne informacije).

2.6. BCAT2 predviđa odgovor na imunoterapiju u nekoliko kohorti imunoterapije u stvarnom svijetu

Gore navedeni nalazi pokazali su imunosupresivnu ulogu BCAT2 u TME i sinergijski učinak kombinacije gubitka BCAT2 s anti-PD-1 terapijom. Međutim, njegov prediktivni potencijal za učinkovitost imunoterapije nije jasan. Stoga su u kohorti TCGA-BLCA uspoređeni rezultati obogaćivanja putova povezanih s imunoterapijom između skupina s visokim i niskim BCAT2. Kao što je prikazano na slici S23A (popratne informacije), skupina s niskim BCAT2 imala je aktivnije gene u putevima povezanim s imunoterapijom, što može zaključiti da niska ekspresija BCAT2 predstavlja osjetljivije stanje na imunoterapiju. Za daljnju validaciju, 58 pacijenata s mišićno-invazivnim rakom mokraćnog mjehura (MIBC) koji su prihvatili neoadjuvantnu anti-PD-1 terapiju u našoj bolnici uključeno je u kohortu Xiangya BLCA imunoterapije. Reprezentativne IHC, IF i CT slike osoba koje su odgovorile i onih koje nisu odgovorile ukazale su na to da je razina ekspresije BCAT2 u bliskoj vezi s učinkovitošću imunoterapije - veća je vjerojatnost da će osoba s niskom razinom ekspresije BCAT2 odgovoriti na imunoterapiju nego osoba s visoka razina ekspresije BCAT2 (Slika 7A–C). Štoviše, rezultat IHC kohorte Xiangya BLCA imunoterapije i matrica ekspresije mRNA kohorte IMvigor210 ukazali su na snažnu negativnu korelaciju između BCAT2 i PD-L1 (R=−{{3{{32} }}}.4, p=0.002; R=−0.41, p < 0.001) (Slika S23B, C, Popratne informacije). Stoga smo izravno usporedili učinkovitost imunoterapije između skupina s visokim i niskim BCAT2 u imunoterapijskoj kohorti Xiangya BLCA i otkrili da je skupina s niskim BCAT2 imala značajno veći udio onih koji su odgovorili nego skupina s visokim BCAT2 (p=0.001) (Slika 7D). Štoviše, procijenili smo prediktivne vrijednosti BCAT2, PD-L1 i kombiniranog indeksa (BCAT2+PD-L1) na patološki odgovor na imunoterapiju i otkrili izvrsnu učinkovitost kombiniranog indeksa (BCAT2+PD- L1) na točnost predviđanja (Slika 7E). Inspirativno, u aspektu ishoda preživljenja, skupina s niskim BCAT2 imala je dulje preživljenje bez bolesti (DFS) od skupine s visokim BCAT2 (p=0.032) (Slika 7F), pokazujući vrijednost prognoze BCAT2 u BLCA imunoterapija. U klinici, veća je vjerojatnost da će osobe s pustinjskim TME imati ograničenu učinkovitost imunoterapije nego osobe s upaljenim TME, što dodatno naglašava važnost pokazatelja predviđanja. Posljedično, odabrali smo sve pojedince s pustinjskim TME-om u kohorti IMvigor210 i proveli sveobuhvatnu procjenu. U izravnoj usporedbi razine ekspresije BCAT2 među skupinama s različitim odgovorom, CR skupina (koja je odgovorila) imala je značajno nižu razinu ekspresije BCAT2 od SD i PD skupina (koja nije odgovorila) (Slika 7G). Što je još važnije, kombinirani indeks (BCAT2+PD-L1) također je imao izvrsne rezultate u pogledu točnosti predviđanja (Slika 7H). Iako nije bilo značajne razlike u ukupnom preživljenju (OS) između skupina s visokim i niskim BCAT2 u kohorti pustinjskog tipa IMvigor210, tendencija prognoze još uvijek je bila slična ishodu kohorte Xiangya BLCA imunoterapije (Slika 7I). Osim PD-L1, mikrosatelitska nestabilnost (MSI) je drugi bitan prediktor učinkovitosti imunoterapije. Status popravka neusklađenosti (MMR)—dobar MMR (pMMR) i manjkav MMR (dMMR) održavaju visoku usklađenost s niskofrekventnim MSI (MSI-L) i visokofrekventnim MSI (MSI-H).[13] Stoga smo proveli sveobuhvatnu procjenu svih pojedinaca u kohorti imunoterapije Xiangya BLCA na temelju rezultata bojenja četiri gena markera MMR (MLH1, MSH2, MSH6 i PMS2). Ishod je otkrio značajno veći udio dMMR (MSI-H) u skupini s niskim BCAT2 u usporedbi s grupom s visokim BCAT2 (p=0.02) (Slika S23D, E, Popratne informacije). Osim toga, procijenili smo prediktivne vrijednosti MMR-a, BCAT2 i indeksa kombinacije (MMR+BCAT2) na učinkovitost imunoterapije i otkrili da je indeks kombinacije (MMR+BCAT2) imao prihvatljivu izvedbu u točnosti predviđanja (Slika S23F, Popratne informacije). Zajedno, ovi su nalazi pokazali da je BCAT2 kvalificiran da djeluje kao komplementarni prediktor učinkovitosti BLCA imunoterapije. Konačno, prediktivna vrijednost BCAT2 kao odgovor na imunoterapiju je istražena u različitim vrstama raka. Otkrili smo da su osobe s visokom ekspresijom BCAT2 pokazale znatno nižu stopu odgovora (p=0.04) u kohorti GSE35640 (melanom) (Slika 7J). Iako nije bilo značajnih razlika u stopi odgovora između skupina s visokim i niskim BCAT2 u kohorti GSE173839 (rak dojke), GSE135222 (NSCLC) i Gide 2019 (melanom), pacijenti s niskom ekspresijom BCAT2 ipak su vjerojatnije imali pozitivan odgovor na imunoterapiju (Slika 7K–M).

cistanche tubulosa-poboljšava imunološki sustav

Kliknite ovdje za pregled Cistanche proizvoda za jačanje imuniteta

【Tražite više】 E-pošta:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.7. Vrijednost BCAT2 u predviđanju molekularnog podtipa i vođenju precizne terapije

Uz veliku heterogenost koja postoji u tradicionalnoj histološkoj klasifikaciji, sve je više dokaza pokazalo da je molekularni podtip sposoban pružiti točniju klasifikaciju na temelju profila transkriptoma u BLCA.[14] Nadalje, sa sličnim imunološkim karakteristikama u istom podtipu, molekularna klasifikacija ima veliki potencijal za predviđanje TME i usmjeravanje precizne terapije u klinici.[15] Kroz sveobuhvatnu analizu različitih sustava molekularnih podtipova u kohorti TCGA-BLCA, otkrili smo da su pojedinci s niskom ekspresijom BCAT2 vjerojatnije klasificirani u bazalni podtip, praćen aktiviranim putevima bazalne diferencijacije, EMT diferencijacije, imunološke diferencijacije, interferonskog odgovora, i tako dalje. Pojedinci s visokom ekspresijom BCAT2 uglavnom se klasificiraju u luminalne podtipove, praćene aktivnim putevima luminalne diferencijacije, urotelne diferencijacije i Ta (Slika S24A, Popratne informacije). Prema konsenzusu o molekularnom podtipu, bazalni podtip ima veću razinu infiltracije efektorskih limfocita i aktivniji signalni put IFN-𝛾 nego luminalni podtip, [16] što implicira bolju učinkovitost imunoterapije. Zatim je korišten AUC za procjenu točnosti predviđanja. Nevjerojatno, osim sustava podtipa Baylor (AUC=0.76), većina AUC-a bila je iznad 0.90 u drugim sustavima (Slika S24B, Popratne informacije), što znači robusnu točnost predviđanja BCAT2 u molekularni podtip. Kako bismo dodatno istražili njegovu ulogu u predviđanju učinkovitosti drugih terapija, usporedili smo aktivnost ciljne terapije receptora epidermalnog faktora rasta (EGFR) i putove povezane s radioterapijom između skupina s visokim i niskim BCAT2. S očito pojačano reguliranim aktivnostima, veća je vjerojatnost da će pacijenti u skupini s niskim BCAT2 imati pozitivan odgovor na ciljanu terapiju EGFR-om i radioterapiju (Slika S24C, Popratne informacije). Za povećanje pouzdanosti predviđanja molekularnog podtipa i osjetljivosti liječenja, osam BLCA kohorti (Xiangya BLCA kohorta, GSE31684, GSE69795, GSE48075, GSE128702, GSE83586, GSE52329 i E-MTAB-1803) i jedna BLCA imunoterapijska kohorta (IMvigor210) prijavljen za vanjsku validaciju. Uz izvrsnu točnost predviđanja, slični su nalazi pronađeni u ovim kohortama (slike S25–S27, popratne informacije). Hiperprogresivna bolest (HPD) je izrazito neosjetljivo stanje na imunoterapiju. Za istraživanje utjecaja BCAT2 na HPD, biomarkeri povezani s HPD-om prikupljeni su iz prethodnih studija[17], a CNV biomarkera uspoređen je između skupina s niskim i visokim BCAT2. Osim za EGFR, stope pojačanja CNV drugih HPD-pozitivnih povezanih biomarkera (crveni simbol) bile su veće u skupini s visokim BCAT2, posebno MDM2 (p=0.0116). Stope CNV brisanja HPD-negativnih povezanih biomarkera (zeleni simbol) bile su niže u skupini s visokim BCAT2 (Slika S24D, Popratne informacije). Ishod je pokazao da pacijenti s visokom ekspresijom BCAT2 imaju potencijalni rizik od HPD-a tijekom imunoterapije. Neoadjuvantna kemoterapija (NAC) je ključna terapija u BLCA. Markeri koji predviđaju odgovor na NAC u BLCA prikupljeni su iz pregleda Buttigliera i sur. [18]. a njihove stope mutacije uspoređivane su između dviju skupina. Na temelju viših ukupnih stopa mutacije biomarkera i češće mutacije RB1 u skupini s niskim BCAT2, nagađali smo da osoba s niskom ekspresijom BCAT2 ima bolju kliničku učinkovitost NAC-a (Slika S24E, Popratne informacije). Stoga je baza podataka Drugbank korištena za usporedbu učinkovitosti nekoliko uobičajenih režima kemoterapije između dviju skupina i otkriveno je da je vjerojatnije da će pojedinci s niskom ekspresijom BCAT2 odgovoriti na kemoterapiju. Osim toga, skupina s niskim BCAT2 također je pokazala bolju učinkovitost u uobičajenim režimima imunoterapije i ERBB terapije. Neočekivano, pacijenti s visokom ekspresijom BCAT2 vjerojatno postižu bolje kurativne učinke u antiangiogenoj terapiji (Slika S24F, Popratne informacije). Zajedno, pojedinci s niskom ekspresijom BCAT2 pripadaju upaljenom molekularnom podtipu, bazalnom podtipu, što znači pozitivniji odgovor na imunoterapiju, kemoterapiju, radioterapiju, EGFR-ciljnu terapiju i ERBB terapiju. Nažalost, pacijenti s visokom ekspresijom BCAT2 imaju loš odgovor na ove tretmane. Međutim, antiangiogena terapija za njih može biti tračak svjetla.

Slika 7. BCAT2 predviđa odgovor na imunoterapiju u nekoliko kohorti imunoterapije u stvarnom svijetu. A) IHC slika BCAT2 i PD-L1 između onih koji su odgovorili i onih koji nisu odgovorili u kohorti imunoterapije Xiangya BLCA. Mjerna traka: 50 μm. B) Višebojna IF slika BCAT2 i PD-L1 između onih koji su odgovorili i onih koji nisu odgovorili u kohorti Xiangya BLCA imunoterapije. Mjerna traka: 50 μm. BCAT2+stanica (zelena), PD-L1+stanica (žuta) i stanična jezgra (plava). C) CT slika razlike u učinkovitosti imunoterapije između pojedinaca s visokom i niskom razinom ekspresije BCAT2. Crvena strelica pokazuje područje tumora. D) Ukupna razlika u stopi odgovora između skupina s visokim i niskim BCAT2 u kohorti imunoterapije Xiangya BLCA. E) Točnost predviđanja BCAT2, PD-L1 i kombiniranog indeksa (BCAT2+PD-L1) na odgovor na imunoterapiju u kohorti imunoterapije Xiangya BLCA. F) Razlika u preživljenju bez bolesti (DFS) između skupina s visokim i niskim BCAT2 u kohorti imunoterapije Xiangya BLCA. G) Razlike u razini ekspresije BCAT2 među skupinama CR, PR, SD i PD u kohorti pustinjskog tipa IMvigor210. *p < 0,05; ns: nema značaja. H) Točnost predviđanja BCAT2, PD-L1 i kombiniranog indeksa (BCAT2+PD-L1) na odgovor na imunoterapiju u pustinjskom tipu IMvigor210 kohorte. I) Razlika u ukupnom preživljenju (OS) između skupina s visokim i niskim BCAT2 u kohorti pustinjskog tipa IMvigor210. J–M) Razlike u odgovoru na imunoterapiju između skupina s visokim i niskim BCAT2 u skupinama GSE35640, GSE173839, GSE135222 i Gide2019.

3. Rasprava

Kao ključnog enzima u procesu katabolizma BCAA, prethodna istraživanja uglavnom su bila usmjerena na ulogu BCAT2 povezanu s metabolizmom u bolestima, kao što su pretilost, dijabetes i aritmije. Ma et al. pokazalo je da izbacivanje BCAT2 u masnom tkivu može ubrzati tamnjenje masnog tkiva i termogenezu, što dovodi do smanjene stope pretilosti kod miševa.[19] Detektiranjem uzoraka krvi više od 2000 osoba, Gerszten et al. prikazao je profil metabolita povezan s dijabetesom i otkrio da BCAT2-transformirane BCAA igraju ključnu ulogu u razvoju bolesti.[20] Portero i sur. otkrili su da besmislene mutacije BCAT2p.Q300*/p.Q300* rezultiraju povišenim razinama BCAA i izazivaju aritmije kod miševa.[21] Nedavno je nekoliko studija otkrilo da je BCAT2 usko povezan s rakom. Lei i sur. otkrili su da razgradnja BCAT2 posredovana acetilacijom može usporiti razvoj duktalnog adenokarcinoma gušterače (PDAC) regulacijom razine metabolizma BCAA.[22] Wang i sur. smatraju da ograničena razina transkripcije BCAT2 dovodi do smanjene unutarstanične razine glutamata, što stimulira feroptozu stanica hepatoma.[23] Međutim, sva postojeća istraživanja naglašavaju utjecaj BCAT2-posredovanog katabolizma BCAA na biološki proces raka, a ne istražuju potpuno novi mehanizam. U ovoj smo studiji po prvi put otkrili imunosupresivnu ulogu BCAT2 u TME. Primjena imunoterapije redefinira liječenje raka, uz izvrsnu kvalitetu života i produljeno vrijeme preživljavanja. Ipak, zbog heterogenosti imunološkog ekološkog sustava tumora, samo dio pojedinaca postiže zadovoljavajuću učinkovitost. TME je kompliciran sustav, sastavljen od tumorskih stanica, imunoloških stanica, stromalnih stanica i kapilara.[24] Prema razini infiltracije CTL-a, TME se općenito može klasificirati u upaljene i neupaljene tipove.[25] Sve više dokaza pokazuje da upaljeni TME igra pozitivnu ulogu u izazivanju učinkovitih antitumorskih imunoloških odgovora tijekom terapije.[26] Stoga smo sveobuhvatno analizirali višestruke pokazatelje povezane s TME-om i otkrili da visoka ekspresija BCAT2 oblikuje neupaljeni TME, s otežanim imunološkim ciklusom raka, represivnim obrascem ekspresije profila kemokina, MHC molekula i nedovoljnom razinom infiltracije TIIC-ova. Osim toga, BCAT2 je negativno povezan s TIS i efektorskim genima ICB, što implicira da je vjerojatnije da osobe s visokom ekspresijom BCAT2 neće odgovoriti na imunoterapiju. Kako bismo potvrdili našu hipotezu, usporedili smo stopu odgovora između skupina s visokim i niskim BCAT2 u kohorti imunoterapije Xiangya BLCA i drugim kohortama imunoterapije. Iznenađujuće, postojale su značajne razlike u više kohorti, što je pokazalo da BCAT2 također može igrati ulogu prediktora učinkovitosti imunoterapije, posebno u BLCA. Nadalje, scRNA-seq korišten je za istraživanje regulacijskog mehanizma BCAT2 u TME i pokazao je da aktivnost signalnih putova povezanih s citokinima/kemokinima, signalnog puta kemotaksije T stanica i signalnog puta migracije T stanica imaju značajne negativne korelacije s BCAT2. Kao kritična regulacijska mreža, citokini i kemokini su neophodni za promet različitih imunoloških stanica u TME. Sustav kemokina ima četiri superfamilije: C, CC, CXC i CX3C, sa značajnom redundancijom u uparivanju liganada i receptora.[27] Citokini se mogu podijeliti u potporodice Th1, Th2 i Th17 na temelju njihove biološke funkcije.[28] Kroz izlučivanje različitih razina istih, borba između stanica tumora i imunoloških stanica dovoljna je za reprogramiranje karakteristika TME.[29] Usprkos tome, među većinom citokina i kemokina, potrebno je izdvojiti najvrjedniji klaster. Koristeći 34-ploču imunoanalize citokina i kemokina, otkrili smo da su kemokini, uključujući CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 i CXCL10, u snažnoj negativnoj korelaciji s ekspresijom BCAT2 u stanici raka mokraćnog mjehura ljudi i miševa. Dobro je poznato da su CXCL9 i CXCL10 odgovorni za regrutiranje CD8+T stanica u TME.[30] Kako bismo utvrdili funkciju CCL3, CCL4 i CCL5, pogledali smo prethodna istraživanja. Harlin i sur. upotrijebili su nizove proteina i qPCR kako bi otkrili da je pojačana regulacija CCL3, CCL4 i CCL5 sposobna potaknuti migraciju CD8+T stanica u melanom.[31] Noman i sur. otkrili su da povećana populacija izlučivanja CCL5 pomaže u uspostavljanju proupalnog TME-a prenošenjem CTL-a u tkivo kolorektalnog raka.[32] Putem IHC i RNA-seq profila kemokina u više kohorti, Romero et al. pokazali su da CCL4 i CCL5 imaju jaku povezanost s razinom infiltracije CD8+T stanica kod raka gušterače.[33] Stoga smo smatrali da su kemokini povezani s CD8+T-stanicama glavni kemokini koje regulira BCAT2 kod raka mokraćnog mjehura. Iako smo pokazali snažne negativne korelacije između BCAT2 i kemokina povezanih s CD8+T stanicama, temeljni regulatorni mehanizam između njih tek treba dodatno istražiti. Studija Petersona i sur. pokazalo je da aktivacija signalnog puta MAP kinaze (MAPK) može inducirati proizvodnju CX3CL1.[34] Xu i sur. otkrili su da JAK-STAT signalni put regulira izlučivanje kemokina povezanih s Th1-, uzrokujući smanjenu razinu infiltracije TIL-a.[35] Nedavno su Peng i sur. otkrili da demetilaza JMJD3 može inhibirati ekspresiju kemokina povezanih s CD4+T stanicama i smanjiti razinu infiltracije citotoksičnih T stanica u TME, što predstavlja ključnu ulogu epigenetske modifikacije u regulaciji ekspresije kemokina.[36] Mayo i sur. također je otkrio da epigenetski inhibitor, histon deacetilaza 1, ima veliku sposobnost suzbijanja ekspresije CXCL8 putem aktivacije signalnog puta nuklearnog faktora-B (NF-B).[37] Štoviše, kao simboli metabolizma tumorskih stanica, aerobne glikolize i reaktivnih kisikovih vrsta (ROS), što ukazuje na izvrsne performanse u induciranju ekspresije CXCL8 i CXCL14 podizanjem aktivnosti signalnih putova NF-𝜅B i proteina aktivatora faktora transkripcije 1 (AP{{93) }}).[38] Zanimljivo je da su u našoj studiji signalni putovi NF-𝜅B, STAT i MAPK značajno obogaćeni između staničnih linija s visokim i niskim BCAT2 (Slika 3K; Slika S16A, B, Popratne informacije). Stoga ćemo, u kombinaciji s gornjim studijama, dodatno istražiti ključnu molekulu u mehanizmu regulacije kemokina povezanih s BCAT2 i CD300T. Ograničena objektivna stopa odgovora monoterapije s ICB-om potiče pojavu strategije kombinirane terapije. Za pretvaranje neimunološkog TME u imunološki TME, Wolchok et al. primijenjeno istodobno liječenje nivolumabom (anti-PD{103}} terapija) i ipilimumabom (anti-CTLA-4 terapija) u bolesnika s melanomom i pronašlo je ohrabrujući ljekoviti učinak, pripisujući sinkronom poboljšanom početnom liječenju, aktivaciji i ubijanju CTL-ova [39] Više od kombinacije s drugom vrstom ICB-a, kemoterapija i imunoterapija su alternativna opcija terapije. Kao režim prve linije liječenja uznapredovalog urotelnog karcinoma, nekoliko je studija otkrilo da kemoterapija temeljena na cisplatinu može oblikovati proupalni TME povećavajući razinu ekspresije MHC I klase na dendritskim stanicama i oštećujući MDSC i Tregs.[40] Igrom slučaja, Homma et al. otkrili su da još jedan uobičajeni lijek za kemoterapiju raka mokraćnog mjehura — gemcitabin — može poboljšati količinu infiltracije CD8+T stanica i oslabiti imunosupresivne imunološke stanice u TME.[41] U našem pretkliničkom eksperimentu na životinjama, istodobno liječenje gubitka BCAT2 i anti-PD{114}} mab pokazalo je izrazitiju antitumorsku učinkovitost u usporedbi s monoterapijom anti-PD-1 mab u imunokompetentnih miševa, što pruža inovativan tretman strategija za pacijente s otpornošću na ICB. U međuvremenu, analizom protočne citometrije i IF-om, pokazali smo da obaranje BCAT2 ne samo da regrutira više populacije CTL-ova u TME, već također pojačava aktivnost ubijanja CTL-ova. Slično, Peng et al. otkrili su da prekomjerna ekspresija LGALS2 smanjuje količinu infiltriranih CTL-ova, kao i citotoksičnih biomarkera u miševa koji nose rak dojke.[42] Yang i sur. ilustrirao je da je CXCL13 sposoban pojačati odgovor na imunoterapiju u mišjim modelima raka jajnika povećanjem razine infiltracije CD8+T stanica i razine lučenja GZMB, IFN-𝛾 i IL-2.[43] Prateći jači odgovor protiv raka, kombinirana terapija dodatno remeti postojeću povratnu spregu imunološkog sustava, što vjerojatno dovodi do ozbiljnih nuspojava. Prema obrascu ekspresije BCAT2 na razini siRNA, specifično izraženog u tumorskim stanicama, a ne u imunološkim stanicama i endotelnim stanicama, možemo preliminarno zaključiti da je manje vjerojatno da će gubitak BCAT2 ili inhibitor BCAT2 rezultirati strašnim štetnim učincima. Međutim, potrebno je još istražiti optimalno doziranje i vremenski interval inhibitora BCAT2 i anti-PD-1 mab u kombiniranoj terapiji.

Za vođenje precizne terapije kod pojedinaca, povezali smo BCAT2 s molekularnim podtipom BLCA i kritičnim biomarkerima različitih terapija. Na temelju vjerodostojnih predviđanja u više kohorti, otkrili smo da su imunoterapija, kemoterapija, radioterapija i EFGR-ciljana terapija prikladne za pacijente s niskom ekspresijom BCAT2. Antiangiogena terapija preporučuje se pacijentima s visokom ekspresijom BCAT2. Za razliku od kompliciranog procesa otkrivanja molekularnih podtipova, BCAT2 je prijenosni prediktor za preciznu terapiju. Neizbježno je da postoje neka ograničenja u našim studijama. Prvo, veličine uzorka i vrijeme praćenja kohorte Xiangya BLCA i kohorte Xiangya BLCA imunoterapije bili su ograničeni. Moramo dodatno povećati veličinu uzorka i nastaviti standardizirano praćenje. Drugo, kao kohorta iz stvarnog svijeta, kohorta za imunoterapiju Xiangya BLCA sadržavala je različite mogućnosti operacije što je vjerojatno uzrokovalo potencijalnu pristranost. Dodatno ćemo proširiti našu kohortu i provesti analizu podskupina na temelju iste opcije operacije. Treće, kooperativni učinak kombinirane terapije in vivo treba dodatno potvrditi sustavnom primjenom inhibitora BCAT2. Ukratko, kao imunosupresivna uloga u TME BLCA, BCAT2 je novi cilj u kombiniranoj terapiji ICB i točan biomarker precizne terapije.

Dobrobiti cistanche tubulosa- ojačati imunološki sustav

4. Eksperimentalni dio

cohort: As illustrated in a previous study,[44] 56 eligible BLCA patients accepted surgical treatment (TURBT (transurethral resection of bladder tumor) or radical cystectomy) in Xiangya Hospital. All the samples were conducted through high throughput RNA sequencing (RNA-seq) to acquire transcriptome information. Then, data on RNA-seq, clinicopathologic features, and follow-up information of these patients were utilized to construct the Xiangya BLCA cohort (Table S1, Supporting Information). Xiangya BLCA immunotherapy cohort: 58 MIBC patients were included in the Xiangya BLCA immunotherapy cohort. All the samples were obtained by diagnostic TURBT before the implementation of neoadjuvant anti-PD-1 therapy. After at least two cycles standard neoadjuvant immunotherapy (NAI), TURBT, or radical cystectomy (RC) were conducted based on treatment response and patients' willingness. 17 individuals with complete response (CR) and 16 individuals with partial response (PR) were classified into responders, 17 individuals with stable disease (SD), and 8 individuals with progressive disease (PD) were classified into nonresponders. The detailed clinicopathological characteristics are listed in Table S2 (Supporting Information). Xiangya scRNA cohort: Three samples of muscle-invasive bladder cancer were implemented scRNA-seq, constituting the Xiangya scRNA cohort. Detailed preparation of single-cell suspension, data transformation, and cell quality control have been elaborated in previous articles.[45] In simple terms, three tumor samples were loaded on a Chromium Single Cell Controller instrument (10×Genomics, USA) to produce single-cell gel beads in suspension. Seurat R package was applied to transform the count matrix into Seurat format. Four standards were set up for excluding low-quality cells in the matrix: unique molecular identifier (UMI) amount < 1000, gene quantity < 200, log10GenesPerUMI < 0.70, and mitochondrial-originated UMI counts > 20%. After integrating the samples based on the top 3000 variable traits, principal component analysis (PCA) and the Findclusters algorithm were employed to identify main cell clusters. Based on the level of copy number variation (CNV) in epithelial cells, malignant bladder carcinoma cells were selected from clusters. The study plan was approved by the ethics committee of Xiangya Hospital, Central South University (Item number: 2021101175). All the specific men were collected complying with informed consent rights. The Cancer Genome Atlas (TCGA) Database: RNA expression matrix, survival outcome, and CNV of 33 types of carcinomas were acquired from the UCSC Xena database. Log2 transformation was employed to normalize RNA-seq data and the GISTIC algorithm was applied to process CNV data. Gene Expression Omnibus (GEO) Database: Transcriptome data of 1740 samples from nine BLCA cohorts: GSE31684 (93 samples), GSE48075 (142 samples), GSE69795(61 samples), GSE32894 (308 samples), GSE48276 (116 samples), GSE83586 (307 samples), GSE86411 (132 samples), GSE52329 (20 samples), GSE87304 (305 samples), and GSE128702 (256 samples) were obtained from GEO database. RNA-seq data of three immunotherapy cohorts: GSE35640 (14 samples, melanoma, and MAGE-A3 therapy), GSE173839 (105 samples, breast cancer, and anti-PD-L1 therapy), and GSE135222 (27 samples, nonsmall cell lung carcinoma (NSCLC), and anti-PD-1/PD-L1 therapy) were downloaded from GEO database. Single-cell transcriptomic characterization of two BLCA scRNA cohorts: GSE135337 (8 samples) and GSE145137 (3 samples) was obtained from the GEO database. Data processing was similar to the Xiangya siRNA cohort. Other Databases: RNA expression matrix and clinicopathologic characteristics of immunotherapy cohorts: IMvigor210 (348 samples, bladder cancer, and anti-PD-1 therapy) and Gide2019 (58 samples, melanoma, anti-PD-1, or anti-CTLA-4 therapy) were collected from http://researchpub.gene.com/IMvigor210CoreBiologies and TIDE database (http://tide. dfci.harvard.edu/). Data of RNA-seq and clinical characteristics of a BLCA cohort—E-MTAB-1803 (85 samples)—was downloaded from ArrayExpress (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/). BCAT2 expression levels in various types of cancer cell lines were downloaded from the Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) database. Specific clinicopathologic and follow-up information from public databases were listed in our previous studies.[44,46] Assessment of Immunological Identity of TME in BLCA: As depicted in our previous study,[44] a comprehensive evaluation of the immunological trait of TME in BLCA was summarized. The tracking tumor immunophenotype (TIP) website (http://biocc.hrbmu.edu.cn/TIP/) was used to assess the activities of cancer immunity cycles, which reflected the effectiveness of antitumor immunity. It is separated into seven concrete steps: release and presentation of tumor antigen (steps 1 and 2), startup and activation of effector T cells (step 3), trafficking and assisting diverse immune cells into TME (steps 4 and 5), recognition and killing cancer cells (steps 6 and 7).[47] Six independent algorithms (TIMER, CIBERSORT, CIBERSORT-ABS, MCP-COUNTER, TISIDB, and XCELL) were employed to calculate the infiltration levels of tumor-infiltrating immune cells (TIICs).[48] Furthermore, effector genes of immune cells, ligands and receptors of chemokines, major histocompatibility complex (MHC) molecules, and immunostimulators were collected for evaluating immunological characteristics of TME multi-dimensionally. T cell-inflamed score (TIS) and markers of ICB were utilized to assess the host sensitivity state to immunotherapy.[49] Enrichment Pathways Analysis: Limma R package with empirical Bayesian function was employed to screen differentially expressed genes (DEGs) between high and low expression of BCAT2 in the RNA expression matrix.[50] Screening thresholds were |log (fold change) (log FC) |>1,5 i prilagođena p-vrijednost < 0.05. Analize genske ontologije (GO) i Kyoto enciklopedije gena i genoma (KEGG) provedene su na identificiranim DEG pomoću ClusterProfiler R paketa.[51] Seurat R paket s Findmarker algoritmom primijenjen je za izračunavanje razine ekspresije BCAT2 na epitelnim stanicama u scRNA-seq. Na temelju različitog rangiranja ekspresije gena prema vrijednosti promjene nabora (FC), implementirana je analiza obogaćivanja skupa gena (GSEA) za procjenu pozitivnih i negativnih korelacija. Identifikacija imunološki povezanih DEG-ova: paket ESTIMATE R korišten je za izračunavanje imunoloških i stromalnih rezultata u kohorti TCGA-BLCA. Prema srednjoj vrijednosti dva rezultata i razini ekspresije BCAT2, paket Limma R primijenjen je za identifikaciju pozitivnih/negativnih imunoloških i stromalnih DEG-ova. R paket Vennovog dijagrama korišten je za uzimanje presjeka različitih grupa i utvrđivanje zajedničkih DEG-ova. Klasifikacija pojedinaca pomoću molekularnih podtipova BLCA: Sedam molekularnih podtipova BLCA (UNC, Baylor, TCGA, MDA, Lund, CIT i Consensus) široko se primjenjivalo u klinici za procjenu karakteristika TME i učinkovitosti različitih terapija.[52] S obzirom na složenu interakciju različitih podtipova, zajednički smo ih podijelili u dvije glavne kategorije—bazalne i luminalne podtipove.[16] R paketi Consensus MIBC i BLCAsubtyping korišteni su za klasifikaciju pojedinaca u određene podtipove. Nakon normalizacije, površina ispod krivulje ROC (AUC) korištena je za procjenu pouzdanosti BCAT2 u predviđanju klasifikacije. Procjena precizne terapije pacijenata: Kao što je ilustrirano u našoj prethodnoj studiji,[53] niz kritičnih genskih potpisa, koji mogu predvidjeti učinkovitost kemoterapije, radioterapije, ciljane terapije i imunoterapije, prikupljeni su iz različitih studija i baza podataka.[16, 54] Algoritam ssGSEA korišten je za izračunavanje rezultata obogaćivanja genskih potpisa.[55] Stanične linije: Ljudske stanice raka mjehura (T24) i stanice raka mišjeg mjehura (MB49) kupljene su od Procell Life Science & Technology (Wuhan, Kina) odnosno Meisen CTCC (Jinhua, Kina). Održavani su u mediju DMEM (BasalMedia, Kina) s 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) (BI, Izrael), 1% penicilina i streptomicina (NCM Biotech, Kina) i uzgajani u inkubatoru na 37 stupnjeva temperature koja sadrži 5% CO2. Konstrukcija i RNA-seq stabilnih transfekcijskih stanica: Lentivirusni vektor plenti-BCAT2-flag-puromicin (GV341) dizajnirao je i konstruirao GeneChem (Shanghai, Kina) za stabilnu prekomjernu ekspresiju BCAT2-(BCAT2 OE) stanična linija i njezina negativna kontrola (oe-vektor). Osim toga, BCAT2- kratka ukosnica RNA (shRNA) klonirana je u GV112-lentivirusni vektor od strane GeneChem (Šangaj, Kina) za stabilnu BCAT2-oborenu (BCAT2 KD) staničnu liniju . Ciljne sekvence shRNA navedene su u tablici S3 (popratne informacije). Zatim su rekombinantni BCAT2 lentivirusi transficirani u objektivne stanice prema uputama proizvođača. 2 ug mL-1 puromicina (Amersco, SAD) korišteno je za filtriranje stabilnih transfekcijskih stanica tijekom tri dana. Western blot i kvantitativna reverzna transkripcija PCR (qRT-PCR) primijenjeni su za potvrdu učinkovitosti transfekcije. Na kraju, stabilna transfekcijska stanica s najboljom učinkovitošću odabrana je za RNA-seq i daljnje eksperimente. Tri duplikata uzorka svake stanične linije poslana su na BGI RNA-seq platformu (Shenzhen, Kina). Kriteriji za odabir DEG-a i analizu putova obogaćivanja bili su isti kao što je prikazano u 2.3 (analize putova obogaćivanja). ProcartaPlex višestruki imunotestovi za otkrivanje razine lučenja kemokina i citokina staničnih linija raka: ProcartaPlex imunotest za ljude (Mačka: EPX340-12167-901) i ProcartaPlex imunotest za miševe (Kat: EPX{{50}}) kupljeni su od ThermoFisher Scientific (Massachusetts, SAD) za otkrivanje razina ekspresije proteina više od 30 ključna kemokina i citokina u stabilnim transfekcijskim stanicama raka. Ukratko, supernatanti stanične kulture sakupljeni su iz 24-pločice s jažicama i centrifugirani kako bi se uklonile stanice i stanični ostaci. Zatim su supernatanti za bistrenje inkubirani s kuglicama u ploči prema uputama proizvođača. Platforma za detekciju Luminex (ThermoFisher Scientific, SAD) korištena je za izvođenje kvantitativne analize na svakom uzorku. Neotkriveni pokazatelji isključeni su iz analize. qRT-PCR: Ukupna RNA izolirana je iz stanica pomoću Cell Total RNA Isolation Kit i Animal Total RNA Isolation Kit (Foregene, Kina) u skladu s protokolom proizvođača. cDNA je sintetizirana korištenjem UeIris II RTPCR sustava za sintezu prvog lanca cDNA (US Everbright, Kina). qRTPCR je izveden pomoću SYBR Green qPCR Master Mix (US Everbright, Kina) na CFX Connect System (Bio-Rad, SAD). GAPDH je korišten kao interna standardna kontrola. Početnice je dizajnirao i sintetizirao Sangon Biotech (Šangaj, Kina), a detaljne sekvence početnica navedene su u Tablici S4 (Popratne informacije). ELISA: Koncentracije CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 (MIG) i CXCL10 (IP10) u supernatantima kulture stanica raka mokraćnog mjehura ljudi određene su pomoću humanih ELISA kompleta prema protokolu proizvođača (Proteintech, SAD). Za mjerenje vrijednosti optičke gustoće (OD) korišten je biotehnološki čitač mikropločica (ThermoFisher Scientific, SAD). S obzirom na veliku raznolikost razina izlučivanja između različitih citokina i kemokina, proveli smo standardizaciju podataka (log 2 transformacija) prije analize. Western Blot: RIPA pufer (NCM biotech, Kina) dodan s 1% koktelom inhibitora proteaze (NCM biotech, Kina) korišten je za lizu stanica. BCA Protein Assay Kit (NCM biotech, Kina) korišten je za određivanje koncentracija proteina. Nakon prijenosa na PVDF membrane, stanični proteini su sukcesivno inkubirani s primarnim protutijelima i specifičnim HRP-konjugiranim sekundarnim protutijelima. Signali su uhvaćeni XRS slikovnim sustavom (Bio-Rad, SAD). Primarna antitijela uključuju anti-BCAT2 antitijela (Cat: ab95976, Abcam, SAD) i anti-GAPDH antitijela (Cat: ab8245, Abcam, SAD). Sekundarna protutijela uključuju HRP kozji anti-zečji IgG (Cat: 7074, Cell Signaling Technology, SAD) i HRP kozji anti-mišji IgG (Cat: 7076, Cell Signaling Technology, SAD). Test ubijanja stanica raka posredovan limfocitima T i test kokulture: Uzorci krvi prikupljeni su od 10 zdravih darivatelja u našoj bolnici. Prema uputama proizvođača, korišteno je gradijentno centrifugiranje za ekstrakciju mononuklearnih stanica periferne krvi (PBMC) pomoću Lymphoprepa (Cat: 07851, StemCell Technologies, SAD). Uz to, pufer za lizu crvenih krvnih stanica (Solarbio, Kina) korišten je za uklanjanje crvenih krvnih stanica pomiješanih s PBMC. Kako bi se aktivirale T stanice, PBMC su uzgajane u mediju DMEM (Gibco, SAD), uz dodatak rekombinantnog ljudskog IL- 2 (10 ng mL−1, Cat: 202-1L-050, R&D , SAD) i ImmunoCult ljudski CD3/CD28/CD2 T-stanični aktivator (25 μL mL−1, Kat.: 10970; STEMCELL Technologies, SAD) tijekom 1 tjedna. U omjeru 1:5, ljudske stanice raka mokraćnog mjehura (BCAT2-OE, BCAT2-KD i njihove negativne kontrole) su uzgojene zajedno s aktiviranim T stanicama u DMEM mediju s anti-CD3 antitijelima (100 ng mL−1, Thermo Scientific, SAD) i IL-2 (10 ng mL−1) od jednog donatora u 12- ploči s jažicom tijekom 72 h. Zatim su T stanice sakupljene za analizu protočnom citometrijom. Detaljna strategija ulaza analize protoka prikazana je na slici S28 (Popratne informacije). Preostale stanice raka obojene su kristalno ljubičastom i izmjerena je OD vrijednost pri 570 nm čitačem mikropločica. Protutijela za analizu protočnom citometrijom uključuju Zombie Aqua Fixable Viability Kit (Cat: 423101, Biolegend, SAD), APC/Cy7 anti-humani CD45 (Cat: 368516, Biolegend, SAD), Pacific Blue anti-humana CD3 antitijela (Cat: 300329, Biolegend, SAD), PerCP/Cy5.5 anti-humana CD4 antitijela (Cat: 317427, Biolegend, SAD), FITC anti-humana CD8a antitijela (Cat: 301006, Biolegend, SAD), PE/Dazzle 594 anti-humani TNF- 𝛼 Antitijela (Cat: 502946, Biolegend, SAD) i Brilliant Violet 711 anti-humani IFN- 𝛾 Antitijela (Cat: 502540, Biolegend, SAD). Ispitivanje kemotaksije: Ispitivanje kemotaksije provedeno je u 24-jažičnoj ploči s promjerom jezgre od 3 μm (Corning, SAD). Ljudski komplet za izolaciju CD8+T stanica (Cat: 480012, Biolegend, SAD) korišten je za izdvajanje CD8+T stanica iz PBMC. 1 × 105 izoliranih stanica u volumenu od 200 μL dodano je u gornju komoru, a 600 μL supernatanta različitih stabilnih transfekcijskih staničnih linija dodano je u donju komoru. Nakon inkubacije od 6 sati na 37 stupnjeva, stanice su migrirale u donju komoru te su sakupljene i izbrojane protočnom citometrijom. Testovi stanične proliferacije, migracije i invazije: Test formiranja kolonije na ploči korišten je za procjenu sposobnosti stanične proliferacije. BCAT2-OE, BCAT2-KD i negativna kontrola stanica raka mokraćnog mjehura čovjeka uzgajane su u 6-pločama s jažicom po jažici. Nakon inkubacije u vlažnoj atmosferi od 37 stupnjeva tijekom 2 tjedna, kolonije su fiksirane i obojene paraformaldehidom, odnosno kristalno ljubičastom. Transwell komore s umetcima od polikarbonatne membrane od 8,0 μm (Corning, SAD) korištene su za procjenu kapaciteta stanične migracije i invazije in vitro. 1 × 105 stabilnih transficiranih stanica suspendirano je u mediju bez seruma i nasađeno u gornju komoru sa ili bez Matrigela (Corning, SAD), za odvojeno ispitivanje invazije i migracije. Nakon inkubacije od 24 h (test migracije) i 48 h (test invazije), stanice koje su prianjale na donju površinu membrane su fiksirane i obojene. Stanice koje su ostale u gornjoj komori uklonjene su brisevima. Pet nasumičnih polja odabrano je pod mikroskopom za izračunavanje broja stanica. Imunofluorescencija (IF) i imunohistokemija (IHC): Višebojni IF na TMA Xiangya BLCA kohorte i Xiangya BLCA imunoterapijske kohorte primijenjen je kompletom za višestruko fluorescentno imunohistokemijsko bojenje (Absin, Kina). Ukratko, nakon deparafinacije, rehidracije i obnavljanja antigena, TMA je inkubiran s primarnim antitijelima i sekundarnim antitijelima koja potiču vezanje različitih luciferina pojačavanjem signala tiramida (TSA). Nakon brisanja nevezanih protutijela citratnim puferom, postupak inkubacije ponovljen je dva puta. DAPI je korišten za kontrastiranje staničnih jezgri, a slike su skenirane platformom Pannoramic MIDI (3DHISTECH, Mađarska). Primarna protutijela na TMA kohorte Xiangya BLCA uključuju anti-BCAT2 (Cat: ab95976, Abcam, SAD), anti-citokeratin 19 (CK19) (Cat: ab52625, Abcam, SAD), anti-CD8 (Cat: ab237709, Abcam, SAD ) i DAPI (Invitrogen, SAD). Sekundarna antitijela i fluorokrom na TMA kohorte Xiangya BLCA uključuju HRP kozji anti-zečji/mišji IgG, Absin 520 TSA Plus, Absin 570 TSA Plus, Absin 650 TSA Plus (abs50012, Absin). Primarna protutijela na TMA kohorte imunoterapije Xiangya BLCA uključuju anti-BCAT2 (Cat: ab95976, Abcam, SAD), anti-PD-L1 (Cat: ab213524, Abcam, SAD) i DAPI (Invitrogen, SAD). Sekundarna antitijela i fluorokrom na TMA imunoterapijske kohorte Xiangya BLCA uključuju HRP kozji anti-zečji/mišji IgG, Absin 520 TSA Plus i Absin 650 TSA Plus (abs50012, Absin). IF na tkivima mišjih tumora je inkubiran s primarnim protutijelima—anti-CD8 (Cat: 372902, BioLegend, SAD)—i sekundarnim protutijelima—anti-mišji konjugat boje Alexa Fluor 488 (Invitrogen, SAD) uzastopno. DAPI je primijenjen na vizualiziranu staničnu jezgru. Pet nasumičnih polja odabrano je pod mikroskopom kako bi se izračunao broj pozitivnih obojenih stanica. IHC na TMA kohorti Xiangya BLCA i kohorti za imunoterapiju Xiangya BLCA proveo je SP-9000 Kit (ZSGB-BIO, Kina). Nakon preuzimanja i blokiranja antigena, primarna antitijela i sekundarna antitijela su redom inkubirana s tumorskim tkivima. Zatim je primijenjen diaminobenzidin (DAB) za bojenje ciljnih antigena. Smeđi signal se smatra pozitivnim bojanjem. Rezultat intenziteta bojenja (odsutan=0, slab=1, umjeren=2 i jak=3) rezultat množenja pozitivnog postotka (bez bojenja=0, bojenje stanica manje od 25%=1, 25%–50% obojenih stanica=2, 50%–75% obojenih stanica=3 i obojenih stanica više od 75%=4) konačni IHC rezultat uzoraka. Rezultati BCAT2/CD8/PD-L1 manji od šest bodova klasificirani su kao niska ekspresija, rezultati veći od ili jednaki šest bodova klasificirani su kao visoka ekspresija. Za procjenu statusa pojedinca na MMR, svi uzorci iz kohorte imunoterapije Xiangya BLCA procijenjeni su na temelju rezultata bojenja četiri gena markera MMR (MLH1, MSH2, MSH6 i PMS2). Kao što je prikazano u prethodnim studijama, [56] kada su sva četiri markerska gena bila pozitivno obojena, pojedinac je označen kao MMR. Kad je bilo koji od četiri markerska gena imao negativno bojenje, pojedinac je označen kao dMMR. Dva neovisna patologa pozvana su da provedu procjenu. Antitijela uključuju: anti-BCAT2 (Cat: ab95976, Abcam, SAD), anti-CD8 (Cat: ab4055, Abcam, SAD), anti-PD-L1 (Cat: ab213524, Abcam, SAD), anti-MLH1 (Cat: A4858, Abcolonal, Kina), anti-MSH2 (Cat: A22177, Abcolonal, Kina), anti-MSH6 (Cat: A16381, Abcolonal, Kina), anti-PMS2 (Cat: A4577, Abcolonal, Kina) i HRP Goat Anti -Zečji/mišji IgG (ZSGB-BIO, Kina). TissueFAXS panoramske analize prostorne interakcije u TME: Za procjenu prostorne interakcije BCAT2+ malignih stanica i efektorskih T stanica, TissueFAXS panoramska platforma (Tissue Gnostics, Austrija) korištena je za skeniranje i poluautomatsku analizu objektivnih stanica obojenih višebojnim IF na TMA kohorte Xiangya BLCA. TMA se sastojao od 1,5 mm jezgre biopsija iz uzoraka tumorskih tkiva uklopljenih u parafin. Detaljno, BCAT2+ stanice, maligne stanice i CD8+T stanice obojene su specifičnim primarnim protutijelima i sekundarnim protutijelima. Za bojenje stanične jezgre korišten je DAPI (Invitrogen, SAD). Detaljni koraci opisani su u studiji Makarevića i sur..[57] Ukratko, prema intenzitetu fluorescencije različitih pokazatelja i fizičkim svojstvima stanica označene su i kvantificirane pozitivne stanice. Još važnije, prostorne distribucije CD8+T stanica oko BCAT2+CK19+ stanica prikazane su dijagramima raspršenosti na temelju prostorne udaljenosti (0–25, 25–50, 50– 100 i 100–150 μm). Dva iskusna patologa pozvana su da provjere ishod odluke panoramske platforme TissueFAXS. Pokusi na životinjama: Ženke C57BL/6 miševa (6-7 tjedana) dobivene su iz Odjela za laboratorijske životinje Sveučilišta Central South. Sve operacije na miševima provjerio je i odobrio Odbor za brigu i korištenje životinja bolnice Xiangya, Sveučilište Central South (broj stavke: 2021101175). Iznad svega, da bi se istražila uloga BCAT2 na rast tumora in vivo, BCAT2 KD MB49 stanice (5 × 105) i njegove kontrolne stanice u srednjem volumenu od 100 μL subkutano su ubrizgane u desni bok miševa. Štoviše, nakon uspješne konstrukcije modela potkožnog tumora (volumen tumora do 100 mm3), 100 ug InVivomAb anti-mouse PD-1 (Cat: BE0146, Bioxcell, SAD) i kontrola izotipa IgG2a (Cat: BE0089, Bioxcell, SAD) intraperitonealno su ubrizgane u po mišu, za procjenu sinergističkog učinka gubitka BCAT2 i anti-PD{275}} terapije. Anti-PD-1 terapija primjenjivana je na miševima svaka 3 dana i trajala je do pet ciklusa. Nadalje, za procjenu je li kooperativni učinak zajedničkog liječenja ovisan o CD8+T stanicama. Popratna kombinirana terapija, 100 ug InVivoPlus anti-mišjih CD8𝛼 (Cat: BP0117, Bioxcell, SAD) i kontrola izotipa IgG2b (Cat: BP0090, Bioxcell, SAD) korišteni su za smanjenje CD8+T stanica u miševa. Tjelesne težine miševa bilježene su svaka tri dana. Na zakazani datum, tumori su sakupljeni, izmjereni i pripremljeni za analizu protočnom citometrijom, IF bojenje i qRT-PCR. Za istraživanje interakcije između razine ekspresije BCAT2 na CD8+T stanicama i aktivnosti CD8+T stanica, ispitane su slezene ženki C57BL/6 miševa (6-7 tjedana) bez tumora disocirane i pripremljene za jednostaničnu suspenziju za daljnju analizu. Analiza protočnom citometrijom: mišji tumori su samljeveni i digestirani u jednostaničnu suspenziju pomoću kolagenaze IV (Cat: C5138, Sigma, SAD), hijaluronidaze (Cat: H3506, Sigma, SAD) i DNaze I (Cat: DN25, Sigma, SAD). ). Cjedila za stanice od 70 μm (BIOFIL, Kina) korištena su za filtriranje nečistoća, a brojač stanica (Countstar, Kina) korišten je za dobivanje (3–5) × 106 stanica u svakom uzorku. Nakon identificiranja živih stanica korištenjem Zombie Aqua Fixable Viability Kit (Cat: 423101, Biolegend, SAD) i blokiranja Fc receptora anti-mišjim CD16/32 protutijelom (Cat: 156603, Biolegend, SAD), antigeni stanične membrane obojeni su pomoću APC-Cy7 anti-mišji CD45 (Cat: 103116, Biolegend, SAD), BV421 anti-mišji CD3 (Cat: 100341, Biolegend, SAD), BV605 anti-mišji CD8a (Cat: 100744, Biolegend, SAD) i PerCPCy5.5 anti-miš CD4 (Cat: 100540, Biolegend, SAD). Zatim je bioscience Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (Cat: 2400632, Invitrogen, SAD) korišten za fiksiranje i permeabilizaciju membrane stanice i jezgre. Antigeni povezani s citotoksičnim učinkom obojeni su PE anti-ljudskim/mišjim Granzymeom B (Cat: 372208, Biolegend, SAD), PE-Cy7 anti-mišjim TNF-𝛼 (Cat: 506324, Biolegend, SAD), PE-Dazzle 594 anti- mišji IFN-𝛾 (Cat: 505846, Biolegend, SAD), APC anti-mouse Perforin (Cat: 154304, Biolegend, SAD). Strategija usmjeravanja analize protočnom citometrijom prikazana je na slici S29 (Popratne informacije). Anti-ljudski/mišji BCAT2 (Cat: A7426, Abclonal, Kina) inkubiran je s priborom za obilježavanje fleksibilnih 488 antitijela (Cat: KFA001, Proteintech, SAD) za sintetiziranje personaliziranih BCAT2 fluorescentnih antitijela za analizu protočnom citometrijom. Zatim su protutijela BCAT2 i protutijela povezana s T-stanicama pomiješana i dodana u jednostaničnu suspenziju mišje slezene za istraživanje interakcije između razine ekspresije BCAT2 na CD8+T stanicama i aktivnosti CD{{357} }T stanica. Strategija usmjeravanja analize protočnom citometrijom prikazana je na slici S30 (Popratne informacije). Obojani uzorci detektirani su protočnom citometrijom Cytek DxpAthena (Cytek Biosciences, SAD), a podaci su analizirani softverom verzije Flowjo (BD Biosciences, SAD). Statistička analiza: Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD. t-test sa ili bez Welchove korekcije korišten je za usporedbu kontinuiranih varijabli između dviju skupina. Jednosmjerna ANOVA analiza sa ili bez Brown-Forsythe i Welch testova korištena je za usporedbu kontinuiranih varijabli između više skupina. Za usporedbu dihotomnih varijabli primijenjen je hi-kvadrat test ili Fisherov egzaktni test. Za procjenu intenziteta korelacije između različitih varijabli korišten je Pearsonov ili Spearmanov test korelacijskih koeficijenata. Kaplan-Meierova krivulja preživljavanja korištena je za prikaz prognostičke analize dihotomnih varijabli, a logaritamski test korišten je za procjenu statističkih razlika. Obostrani p < 0,05 definiran je kao prag značajnosti. R softver (verzija 4.0) i GraphPad Prism8 primijenjeni su za obradu podataka u studiji.

Referenca

[1] RL Siegel, KD Miller, HE Fuchs, A. Jemal, CA: Cancer J. Clin. 2021, 71, 7.

[2] VG Patel, WK Oh, MD Galsky, Ca-Cancer J. Clin. 2020, 70, 404.

[3] R. Nadal, J. Bellmunt, Liječenje raka. Rev. 2019, 76, 10.

[4] a) MD Galsky, A. Arija JÁ, A. Bamias, ID Davis, M. De Santis, E. Kikuchi, X. Garcia-Del-Muro, U. De Giorgi, M. Mencinger, K. Izumi, S. Panni, M. Gumus, M. Özgüro˘glu, AR Kalebasty, SH Park, B. Alekseev, FA Schutz, JR Li, D. Ye, NJ Vogelzang, S. Bernhard, D. Tayama, S. Mariathasan, A Mecke, A. Thåström, E. Grande, Lancet 2020, 395, 1547; b) MD Galsky, A. Mortazavi, MI Milowsky, S. George, S. Gupta, MT Fleming, LH Dang, DM Geynisman, R. Walling, RS Alter, M. Kassar, J. Wang, S. Gupta, N. Davis, J. Picus, G. Philips, DI Quinn, GK Haines 3rd, NM Hahn, Q. Zhao, M. Yu, SK Pal, J. Clin. Oncol. 2020, 38, 1797; c) T. Powles, SH Park, E. Voog, C. Caserta, BP Valderrama, H. Gurney, H. Kalofonos, S. Radulović, W. Demey, A. Ullén, Y. Loriot, SS Sridhar, N Tsuchiya, E. Kopyltsov, CN Sternberg, J. Bellmunt, JB Aragon-Ching, DP Petrylak, R. Laliberte, J. Wang, B. Huang, C. Davis, C. Fowst, N. Costa, JA Blake-Haskins , A. di Pietro, P. Grivas, N. engl. J. Med. 2020, 383, 1218.

[5] a) RW Jenkins, DA Barbie, KT Flaherty, Br. J. Rak 2018, 118, 9; b) AJ Schoenfeld, MD Hellmann, Cancer Cell 2020, 37, 443.

[6] a) DS Chen, I. Mellman, Nature 2017, 541, 321; b) TF Gajewski, L. Corrales, J. Williams, B. Horton, A. Sivan, S. Spranger, Adv. Exp. Med. Biol. 2017, 1036, 19; c) DC Hinshaw, LA Shevde, Cancer Res. 2019, 79, 4557.

[7] a) SM Vareki, J. Immunother. Rak 2018, 6, 157; b) B. Zhang, Q. Wu, B. Li, D. Wang, L. Wang, YL Zhou, Mol. Rak 2020, 19, 53.

[8] JR Mayers, ME Torrence, LV Danai, T. Papagiannakopoulos, SM Davidson, MR Bauer, AN Lau, BW Ji, PD Dixit, AM Hosios, A. Muir, CR Chin, E. Freinkman, T. Jacks, BM Wolpin, D. Vitkup, MG Vander Heiden, Science 2016, 353, 1161.

[9] JT Li, M. Yin, D. Wang, J. Wang, MZ Lei, Y. Zhang, Y. Liu, L. Zhang, SW Zou, LP Hu, ZG Zhang, YP Wang, WY Wen, HJ Lu , ZJ Chen, D. Su, QY Lei, Nat. Cell Biol. 2020, 22, 167.

[10] JH Lee, YR Cho, JH Kim, J. Kim, HY Nam, SW Kim, J. Son, Exp. Mol. Med. 2019, 51, 146.

[11] a) H. Lai, X. Cheng, Q. Liu, W. Luo, M. Liu, M. Zhang, J. Miao, Z. Ji, GN Lin, W. Song, L. Zhang, J. Bo, G. Yang, J. Wang, WQ Gao, Int. J. Rak 2021, 149, 2099; b) D. Lambrechts, E. Wauters, B. Boeckx, S. Aibar, D. Nittner, O. Burton, A. Bassez, H. Decaluwé, A. Pircher, K. Van den Eynde, B. Weynand, E. Verbeken, P. De Leyn, A. Liston, J. Vansteenkiste, P. Carmeliet, S. Aerts, B. Thienpont, Nat. Med. 2018, 24, 1277.

[12] N. Nagarsheth, MS Wicha, W. Zou, Nat. Rev. Immunol. 2017, 17, 559.

[13] a) E. Stelloo, AML Jansen, EM Osse, RA Nout, CL Creutzberg, D. Ruano, DN Church, H. Morreau, V. Smit, T. van Wezel, T. Bosse, Ann. Oncol. 2017, 28, 96; b) AS Tjalsma, A. Wagner, WNM Din jens, PC Ewing-Graham, LSM Alcalá, MER de Groot, KE Hamoen, AC van Hof, W. Hofhuis, LN Hofman, KJ Hoogduin, J. Kaijser, ACF Makkus, SJJ Mol, GM Plaisier, K. Schelfhout, HPM Smedts, RA Smit, PJ Timmers, P. Vencken, B. Visschers, AAM van der Wurff, HC van Doorn, Gynecol. Oncol. 2021, 160, 771.