Aristolohna kiselina izaziva bubrežnu fibrozu i starenje kod miševa
Mar 23, 2022
Sažetak:Bubrezi su jedan od najosjetljivijih organa na oštećenja povezana sa starenjem. Općenito, bubrežno starenje je popraćeno bubrežnom fifibrozom, što je posljednji uobičajeni put kroničnogbolesti bubrega. Aristolohinska kiselina (AA), nefrotoksični agens, uzrokuje AA nefropatiju (AAN), koju karakterizira progresivna bubrežna fibroza i funkcionalni pad. Iako je bubrežna fibroza povezana sa starenjem bubrega, ostaje nejasno potiče li AA starenje bubrega. Cilj ove studije je istražiti potencijalnu upotrebu AAN kao modela starenja bubrega. Ovdje smo ispitali čimbenike povezane sa starenjem u AAN modelima kroničnim davanjem AA C57BL/6 miševima. U usporedbi s kontrolom, skupina AA pokazala je starenjebubregfenotipove, kao što je atrofija bubrega, opadanje funkcije bubrega i tubulointersticijska fifibroza. Osim toga, AA potiče staničnu starenje posebno ububregai povećana bubrežna ekspresija p16 mRNA i aktivnost -galaktozidaze povezana sa starenjem. Nadalje, miševi tretirani AA pokazali su proksimalne tubularne mitohondrijske abnormalnosti, kao i nakupljanje reaktivnih vrsta kisika. Klotho, gen protiv starenja, također je značajno smanjen ububregamiševa tretiranih AA. Zajedno, rezultati ove studije pokazuju da AA mijenja faktore povezane sa starenjem i da je bubrežna fibroza usko povezana sa starenjem bubrega.
Ključne riječi:kronična bolest bubrega; fifibroza bubrega; aristolohična kiselina; starenje; stanično starenje
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BUBREŽNE/BUBREŽNE BOLESTI
UvodSa stalnim povećanjem životnog vijeka ljudi, sve više pojedinaca pati od oštećenja povezanih sa starenjem.Bubrezitipično su pogođeni oštećenjem tkiva povezanom sa starenjem i učestalošću kroničnihbolest bubregapovećava se s godinama [1]. Bubrežno starenje ubrzava ukupno starenje, što rezultira kraćim životnim vijekom. Stoga su istraživanja o starenju bubrega nužna, iako odgovarajući životinjski modeli nisu u potpunosti razvijeni. Starenje bubrega popraćeno je različitim patološkim promjenama, uključujući atrofiju bubrega, glomerulosklerozu i tubulointersticijsku fifibrozu [2]. Bubrežna tubulointersticijska fifibroza posljednji je uobičajeni put u većini oblika progresivne bubrežne bolesti, što sugerira da je bubrežna fifibroza usko povezana sa starošćububreg. U istraživanju starenja, miševi su pouzdan alat zbog svoje genetske blizine ljudima, sposobnosti genetske manipulacije njihovim genomom i činjenice da prezentiraju fenotipove povezane sa starenjem slične ljudima tijekom svog životnog vijeka [3]. Longitudinalna promatranja pomoću inbred miševa idealna su kao model starenja, iako je dugotrajno pratiti miševe tijekom njihovog cijelog životnog vijeka. Osim toga, postoji nekoliko genetski modificiranih mišjih modela starenja. Miš s nedostatkom Klotha je model preranog starenja koji se koristi u istraživanju starenja. Međutim, u ovom modelu, bubrežna funkcija je nepromijenjena, a nekoliko organa osim bubrega je oštećeno [4]. Stoga bi ovaj mišji model mogao biti neprikladan za istraživanje starenja bubrega.Primjena aristolohinske kiseline (AA) uzrokuje specifičnu vrstu oštećenja bubrega poznatog kao AA nefropatija (AAN), koju karakterizira opsežna intersticijska fibroza [5,6]. AA je toksičan za epitel bubrežnih tubula jer potiče stvaranje adukata DNA u bubrežnom tkivu [7]. Malo je vjerojatno da će AA utjecati na druge organe osim mokraćnog sustava i može biti koristan za procjenububreg-specifične izmjene. Stoga se AA obično koristi za uspostavljanje modela bubrežne fifibroze kod miševa [8,9]. Međutim, ostaje nejasno jesu li promjene izazvane AA povezane sa starenjem ububrega. U ovoj smo studiji ispitali fenotipove vezane uz dob i molekularne čimbenike u AAN-u kod miševa
Rezultati 2.1. Primjena AA izazvala je značajan gubitak težine, atrofiju bubrega i smanjenje bubrežne funkcijeOsnovna tjelesna težina (BW) i sistolički krvni tlak (BP) bili su identični između kontrolne skupine i skupine AA. tjelesna težina u kontrolnoj skupini s nosačem dosljedno se povećavala tijekom 8 tjedana. Međutim, debljanje je bilo inhibirano primjenom AA, a skupina koja je primala AA imala je značajno nižu tjelesnu masu 4 i 8 tjedana nakon početka primjene AK (Slika 1A). Nije bilo značajne razlike u sistoličkom krvnom tlaku ili brzini otkucaja srca između kontrolne skupine i skupine AA (Slika 1B,C). Omjer težine srca/TM nije pokazao razliku između skupina 8 tjedana nakon početka primjene AA (Slika 1D), dok jebubregomjer težine/TM bio je značajno niži u skupini AA 8 tjedana nakon početka primjene AA (Slika 1E). Zatim smo ispitali bubrežnu funkciju u skupinama koje su primale kontrolu nosača i AA. Koncentracije kreatinina u plazmi i dušika iz uree (UN) bile su značajno više u skupini AA nego u kontrolnoj skupini s nosačem 8 tjedana nakon početka primjene AA. Osim toga, liječenje AA značajno je smanjilo klirens kreatinina u usporedbi s kontrolnom grupom nosača 8 tjedana nakon početka primjene AA (Slika 1F-H).
2.2. Primjena AA izazvala je očitu tubulointersticijalnu fibrozu i značajno povećanje ekspresije gena u bubrezima povezanog s fibrozomHistološki pregled koristeći periodičnu kiselinu-Schiff (PAS) bojanje otkrio je da je područje glomerula značajno smanjeno u skupini AA u usporedbi s kontrolnom skupinom nosača (Slika 2A). Ekstenzivna tubulointersticijska fifibroza, procijenjena bojanjem Massonovim trikromom (MT), primijećena je u skupini AA (slika 2B), kao i s povišenom regulacijom razina mRNA gena povezanih s fifibrozom bubrega, kolagena I i III i transformirajućeg faktora rasta ( TGF)-(Slika 2C–E).
2.3.Primjena AA ubrzava starenje stanica, disfunkciju mitohondrija i akumulaciju reakcijskih vrsta kisika/gena (ROS) u bubrezimaKako bismo procijenili stanično starenje, ispitali smo bubrežnu ekspresiju mRNA p53, p21, p16 i glutaminaze (GLS). Grupa AA pokazala je značajno više razine mRNA ovih gena povezanih sa starenjem ububrega(Slika 3A-D). Nadalje, intenzitet bojenja -galaktozidazom(SA- -gal) povezan sa starenjem ububregabio povećan u AA skupini i gotovo odsutan u kontrolnoj skupini nosača (Slika 3E). U AA skupini, elektronska mikroskopija otkrila je nestanak mitohondrijskih krista, mitohondrijske fragmentacije, citoplazmatske vakuolizacije i autolizosoma u proksimalnim tubularnim stanicama, istodobno s niža regulacija BCL2/adenovirusa E1B 19-kDa proteina 3 (Bnip3), gena povezanog s mitohondrijima (Slika 3FG). Bubrežna mRNA ekspresija Nox2. komponenta nikotinamid adenin dinukleotid fosfat (NADPH) oksidaze, bila je značajno povećana u AA skupini u usporedbi s kontrolnom skupinom nosača (Slika 3H). Nadalje, Western blot analiza otkrila je da je bubrežna 4-hidroksi-2-nominalna (4-HNE) razina značajno povećana u AA skupini (Slika 3I). Ovi rezultati pokazuju da je primjena AA izazvala staničnu starenje, disfunkciju mitohondrija i nakupljanje ROS-a ububrega.
2.4. AA Smanjena bubrežna ekspresija Klotho proteinaIspitali smo bubrežnu ekspresiju proteina koji usporavaju starenje u skupinama s vehikulumom i AA. Klotho ekspresija bila je značajno smanjena u skupini AA u usporedbi s kontrolnom skupinom nosača (Slika 4A), dok su bubrežne ekspresije nikotinamid fosforiboziltransferaze (NAMPT) i sirtuina1 (SIRT1) bile slične između skupina (Slika 4B,C).
3. RaspravaKoliko znamo, ova je studija prva koja se usredotočila na procjenu promjena u AAN-u povezanih sa starenjem bubrega pomoću markera starenja, kao što su aktivnost p16 i SA- -gal. Liječenje AA pospješilo je bubrežnu atrofiju, tubulointersticijsku fibrozu i smanjenje bubrežne funkcije, što je bilo popraćeno pojačanom regulacijom bubrežne p16 mRNA i SA- -gal-pozitivnim bojenjem. Nadalje, skupina AA pokazala je značajke mehanizama povezanih sa starenjem bubrega kao što su mitohondrijske abnormalnosti, povećani oksidativni stres i smanjena regulacija gena protiv starenja, Klotho. Uzevši zajedno, naša opažanja sugeriraju da kronična primjena AA djelomično oponaša starenje bubrega.
Stanično starenje je trajno zaustavljanje stanične proliferacije kao odgovor na različite stresore, kao što je oštećenje DNK, i doprinosi starenju i bolestima povezanim sa starenjem. Ekspresija p16, inhibitora kinaze ovisnog o ciklinu, povezana je sa starenjem u različitim organima, uključujući bubrege. Ograničenje kalorija povećava životni vijek inhibiranjem ekspresije pl6 [10]. Dodatno, eliminacija p16-ekspresije senescentnih stanica u INK-ATTAC miševa putem injekcije AP20187, dimerizatora proteina koji veže FK506- [11], uzrokuje slabljenje fenotipova bubrežnog starenja, kao što su glomerularna skleroza i bubrežna funkcionalni pad. Stoga je p16 jedan od najvažnijih čimbenika povezanih sa starenjem. Stare stanice mogu se detektirati pomoću SA- -gal bojenja, koje pokazuje povećanu aktivnost -galaktozidaze pri pH 6,0 [12] i naširoko je korišten biomarker starih i ostarjelih stanica. Bubrežna mRNA ekspresija pl16 povećava se u starih štakorabubregate je praćeno povećanom SA{0}}gal aktivnošću u bubrežnom epitelu [13I. U ovoj smo studiji pokazali povećanu bubrežnu ekspresiju p16 mRNA i SA- -gal-bojenje, što ukazuje da AA inducira bubrežno starenje. Nedavno je objavljeno da je GLS neophodan za preživljavanje starih stanica putem pojačane glutaminolize i intracelularne pH neutralizacije [14]. Pokazalo se da inhibicija glutaminolize ovisne o GLS-u kod starih miševa eliminira stare stanice i ublažava disfunkciju organa povezanu sa starenjem. U ovoj studiji, regulacija bubrežne GLS mRNA ukazuje na bubrežno nakupljanje senescentnih stanica u skupini. Stoga je kronična primjena AA uzrokovala starenje stanica u bubrezima.
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI FUNKCIJU BUBREGA/BUBREGA
Osim staničnog starenja, mitohondrijska disfunkcija bitan je mehanizam u podlozi oštećenja tkiva povezanog sa starenjem i praćena je nakupljanjem ROS [15,16]. Mitohondrijska disfunkcija pokreće i održava stanično starenje [17], dok stanično starenje izravno pridonosi mitohondrijskoj disfunkciji [18]. Bnip3, smješten prvenstveno u vanjskoj mitohondrijskoj membrani, može igrati ulogu u regulaciji mitofagije u kultiviranim bubrežnim proksimalnim tubularnim stanicama kao odgovor na oksidativni stres i hipoksiju. U starijih miševa, restrikcija kalorija povećava autofagiju u tubularnim stanicama, preko regulacije Bnip3, i poboljšava degeneraciju bubrežne funkcije izazvanu starenjem [19]. U ovoj studiji elektronska mikroskopija otkrila je značajke mitohondrijskih abnormalnosti na koje može utjecati smanjena bubrežna ekspresija Bnip3 ili stanično starenje. Mitohondriji su glavni unutarstanični izvor ROS. Kako bismo procijenili učinke mitohondrijskih abnormalnosti na bubrežni ROS, ispitali smo bubrežnu akumulaciju 4-HINE i pokazali akumulaciju ROS-a izazvanu AA ububrega.NADPH oksidaze su glavni izvor ROS. Tijekom akutne faze AAN-a u miševa, bubrežna mRNA ekspresija Nox2 bila je povišena, a dostupnost dušikovog oksida smanjena, što je dovelo do dugotrajne hipoksije i ishemije [20. Kod starih štakorabubrega, akumulacija ROS je popraćena povećanom ekspresijom Nox2 [21]. Ovi nalazi sugeriraju da AA može inducirati fenotipove povezane sa starenjem putem akumulacije ROS uzrokovane mitohondrijskom disfunkcijom i regulacijom NADPH oksidaza.
Bubrežna ekspresija Klotho gena bila je smanjena u AA skupini, dok je ekspresija NAMPT i SIRTl bila slična između skupina. Klotho je gen protiv starenja koji kodira jednoprolazni transmembranski protein koji djeluje kao supresor starenja. Proces starenja kod miševa s nedostatkom Klotho sličan je onom kod ljudi, uključujući kraći životni vijek, neplodnost, arteriosklerozu, atrofiju kože, osteoporozu i emfizem [22]. Hipomorfni mutirani Klotho miševi također su pokazali fenotip ubrzanog starenja, koji je obnovljen ablacijom p16 [23]. Budući da je Klotho važan čimbenik starenja, miševi s modificiranim genom Klotho naširoko su korišteni u istraživanjima starenja. Međutim, miševi s modificiranim Klotho genom mogu biti neprikladni za istraživanje bubrežnog starenja zbog sistemskih oštećenja povezanih sa starenjem tih miševa i činjenice da bubrežna funkcija nije potvrđena (tj. razina kreatinina). Nasuprot tome, mišji model AAN može se koristiti kao lijekom izazvan model bubrežnog starenja u istraživačke svrhe, budući da ima nekoliko prednosti, kao što je relativna jednostavnost implementacije i mogućnost procjene učinaka intervencija na smanjenje bubrežne funkcije. .
Ova studija imala je neka ograničenja. Procijenili smo starenje bubrega, fokusirajući se uglavnom na staničnu starenje, morfologiju mitohondrija i ekspresiju gena povezanu sa starenjem. Međutim, mehanizmi starenja su složeni i nedovoljno shvaćeni. Osim toga, iako je ekspresija Klotho gena bila smanjena kao odgovor na AA, nismo mogli pokazati uzročnu vezu s patološkim promjenama u AAN. Potrebna su daljnja istraživanja kako bi se odredile uloge različitih molekula uključenih u razvoj AAN-a. Unatoč tome, ova studija pruža nove uvide u korištenje Avana kao modela starenja bubrega. Važno je napomenuti da fenotipske promjene ububregsnažno su povezani sa životnim vijekom. iakobubregje lako podložan promjenama povezanim sa starenjem, inhibicija starenja bubrega može produljiti ukupni životni vijek. Stoga bi daljnja istraživanja bubrežnog starenja korištenjem modela AAN-a mogla dovesti do povećanja dugovječnosti u budućnosti.
4. Materijali i metode4.1. ŽivotinjeOva studija je provedena u skladu sa smjernicama Nacionalnog instituta za zdravlje za korištenje pokusnih životinja. Sve pokuse na životinjama odobrio je Odbor za proučavanje životinja Sveučilišta Yokohama City (broj odobrenja: FA20-027) i provedeni su u skladu sa smjernicama ARRIVE. Uloženi su napori da se smanji broj korištenih životinja i njihova patnja. Miševi su bili smješteni u kontroliranom okruženju u ciklusu 12-h svjetla/12-h tame na temperaturi od 25 stupnjeva C. Miševi su imali slobodan pristup hrani i vodi.
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BUBREŽNE/BUBREŽNE INFEKCIJE
Osam tjedana stari mužjaci C57BL/6 miševa kupljeni su od Charles River Laboratories (Wilmington, MA, SAD) i dodijeljeni skupinama s nosačem ili AA nakon 1 tjedna aklimatizacije, miševima je intraperitonealno primijenjen nosač ili AA (Sigma -Aldrich, St. Louis, MO, SAD), koji je otopljen u maloj količini dimetil sulfoksida. Prije ove studije proveli smo preliminarnu studiju koristeći nekoliko protokola. Prvi protokol uključivao je davanje AA (3 mg/kg) C57BL/6 miševima intraperitonealno dva puta tjedno tijekom 4 tjedna bez vremena remodeliranja; u ovom protokolu, AA je uzrokovala očite akutne bubrežne lezije, kao što su prošireni proksimalni tubuli s gubitkom četkastog ruba (dodatna slika S1). U drugom protokolu, miševima C57BL/6 primijenjena je AA (2,5 mg/kg) intraperitonealno jednom tjedno tijekom 4 tjedna nakon čega je uslijedilo vrijeme remodeliranja tijekom 4 tjedna; kreatinin u plazmi u ovih miševa bio je 0.19 ± {{20}}.080 mg/dL u odnosu na 0,18 ± 0,010 mg/dL (kontrola nosača u odnosu na AA; srednja vrijednost ± standardna pogreška srednje vrijednosti (SEM), p=0.86, neupareni Studentov t-test, n=4 po skupini) i plazma UN bila je 31,3 ± 5,95 mg/dL u odnosu na 30,4 ± 3,87 mg/dL (kontrola nosača u odnosu na AA; srednja vrijednost ± SEM, p=0.90, nespareni Studentov t-test, n=4 po skupini). Stoga smo utvrdili da ovaj protokol nije prikladan za model bubrežne ozljede jer AA nije inducirao značajan pad bubrežne funkcije. U trećem protokolu, miševima C57BL/6 davana je AA (3 mg/kg) intraperitonealno dva puta tjedno tijekom 10 tjedana bez vremena remodeliranja; kod ovih miševa, stopa smrtnosti u skupini AA bila je 83 posto (n=6), dok nijedan od miševa u kontrolnoj skupini s nosačem nije umro (n=4). U ovom protokolu nismo mogli statistički procijeniti bubrežni fenotip izazvan AA zbog visoke smrtnosti. U četvrtom protokolu, miševima C57BL/6 davana je AA (3 mg/kg) intraperitonealno dva puta tjedno tijekom 4 tjedna nakon čega je uslijedilo vrijeme remodeliranja tijekom 4 tjedna; kronične bubrežne lezije, kao što je tubulointersticijska fifibroza, i smanjenje bubrežne funkcije primijećene su u ovih miševa [9]. Stoga smo, na temelju rezultata ovih preliminarnih istraživanja, usvojili četvrti protokol za provođenje eksperimenata u ovoj studiji.
4.2. Mjerenje krvnog tlakaSistolički tlak i broj otkucaja srca mjereni su prethodno opisanom metodom repne manšete (BP-Monitor MK-2000; Muromachi Kikai Co., Tokyo, Japan)[24,25]. Sva su mjerenja obavljena između 9:00 i 14:00. Provedeno je najmanje 10 mjerenja kod svakog miša, a za analizu je korištena srednja vrijednost.
4.3. Kvantitativna PCR analiza obrnute transkripcije u stvarnom vremenu Ukupna RNA ekstrahirana je iz bubrežnog tkiva korištenjem ISOGEN-a (Nippon Gene, Tokio, Japan), a komplementarna DNA (cDNA) sintetizirana je korištenjem SuperScript IⅢFirst-Strand System (Invitrogen, Waltham, MA, SAD). Kvantitativna PCR analiza reverzne transkripcije u stvarnom vremenu provedena je pomoću CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, SAD), a proizvodi reverzne transkripcije inkubirani su s TaqMan PCR Master Mix i prilagođenim TaqManom sonda (Applied Biosystems, Waltham, MA, SAD), kao što je prethodno opisano [26]. Korištene su TaqMan sonde protiv sljedećih gena: kolagen I(Mm00801666_g1), kolagen II (Mm01254476_m1), TGF- (Mm01178819 m1),p53(Mm00441964 g1),p21( Mm04205640 g1).p16(Mm00494449 m1)GLS (Mm01257297_m1), Bnip3 (Mm01275600_g1) i Nox2 (Mm00627011_m1).mRNA razine normalizirane su na one 18S ribosomska RNA.
4.4. Western Blot analiza Ekspresija proteina analizirana je Western blot analizom homogenata tkiva koristeći prethodno opisanu metodu [27,28]. Ukupni proteinski ekstrakti pripremljeni su iz tkiva korištenjem pufera za uzorke koji sadrži natrijev dodecil sulfat. Koncentracija proteina svakog uzorka mjerena je pomoću kompleta za analizu proteina kompatibilnog s deterdžentom (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, SAD) i NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD), s goveđim serumskim albuminom kao albuminom standard. Jednake količine proteinskih ekstrakata iz uzoraka tkiva frakcionirane su na 5-20 postotnim poliakrilamidnim gelovima (ATTO Corp., Tokyo, Japan). Odvojeni proteini su zatim prebačeni na poliviniliden difluoridne membrane korištenjem Semi-Dry Transfer System (ATTO Corp., Tokyo, Japan). Membrane su blokirane 1 sat na sobnoj temperaturi fiziološkom otopinom puferiranom fosfatom koja sadrži 5 posto obranog mlijeka u prahu. Membrane su inkubirane s primarnim antitijelima protiv Klotho (ab181373 1:1000; Abcam, Cambridge, UK), NAMPT(sc-67020 1:5000; Abcam), SIRT1(07-131 1:1000, MilliporeSigma , Burlington, MA, SAD), 4-HINE(MHN-100P 1:1000; JaICA, Fukuroi, Japan) i gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza (GAPDH) (2118, 1:2000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, SAD). Membrane su isprane i inkubirane sa sekundarnim antitijelima 60 minuta na sobnoj temperaturi. Mjesta za reakcije antitijelo-antigen vizualizirana su korištenjem poboljšanog kemiluminiscencijskog supstrata (Merck, Kenilworth, NJ, SAD). GAPDH je korišten kao kontrola punjenja. Slike su kvantitativno analizirane pomoću ChemiDoc Touch (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, SAD).
4.5. Histološka analiza izvedeno je kako je prethodno opisano [29]. Bubrežna tkiva miševa fiksirana su s 4 posto paraformaldehida i potom umetnuta u parafin. Sekcije (debljine 4 um) obojene su PAS i MT bojama. Da bi se procijenilo područje glomerula, izmjereno je 50 glomerula po mišu i izračunat je prosjek. Sve su slike dobivene mikroskopom BZ-9000 (Keyence Corp., Osaka, Japan).
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BUBREŽNU/BUBREŽNU DIJALIZU
4.6. SA- -al bojenje Bubrežna tkiva miševa brzo su zamrznuta i postavljena u spoj za optimalnu temperaturu rezanja （Sakura FinetekJapan, Co., Ltd., Tokio, Japan）. Sekcije（4 μm debljine） pripremljene su pomoću kriostata (HM550-VPD; Thermo Fisher Scientific) i montiran na stakalce. SA- -gal aktivnost mjerena je pomoću pribora za otkrivanje starenja (Bio Vision Inc., Milpitas, CA, SAD) prema protokolima proizvođača. Uzorci su promatrani pod svijetlim poljem pri povećanju od ×100 pomoću BZ-9000mikroskopa (Keyence Corp.). 4.7.Electron MicroscopyAnaliza elektronskom mikroskopijom provedena je kao što je prethodno opisano [30]. Miševi su anestezirani izofluranom i perfundirani kroz desni luk aorte hepariniziranom (5 U/mL) fiziološkom otopinom i 2,5 posto glutaraldehida u 0,1 mol/L fosfatnog pufera pri pH 7,4. Uzorci za transmisijsku elektronsku mikroskopiju uronjeni su u 1 posto osmijev tetroksid na 2 sata, serijski dehidrirani u etanolu i umetnuti u smjesu Epon. Ultratanke sekcije obojene su uranil acetatom i olovnim citratom i ispitane pomoću prijenosnog elektronskog mikroskopa Hitachi H-7500 koji radi na 80 kV (Hitachi, Ltd., Tokio, Japan). Presjeci su promatrani pri povećanju ×5000 i fotografirani pomoću kamere s nabojno spregnutim uređajem.
4.8.Biokemijska analizaUzorci krvi prikupljeni su kardiopunkcijom u nahranjenom stanju. Uzorci pune krvi centrifugirani su na 3000 okretaja u minuti (MR-150; Tomy Seiko Co., Ltd., Tokio, Japan) 10 minuta na 4 stupnja kako bi se odvojila plazma. Dobiveni uzorci plazme pohranjeni su na -80 stupnjeva. Razine kreatinina u plazmi, UN i kreatinina u urinu mjerene su korištenjem autoanalizatora Hitachi 7180 (Hitachi, Ltd., Tokyo, Japan).
4.9. Statistička analiza Statističke analize provedene su pomoću softvera GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, SAD). Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SEM. Nespareni Studentov f-test korišten je za usporedbu razlika između kontrolne skupine i skupine AA.p<0.05 was="" considered="" statistically="">
5. ZaključciDavanje AA uzrokujebubregstarenje, zajedno s tubulointersticijalnom fibrozom i atrofijom bubrega. Rezultati sugeriraju da je fibroza bubrega usko povezana sa starenjem bubrega i da AAN može biti koristan kaobubreg-specifični model starenja.
