Antiproliferacijski učinci Cistanches Salse na napredovanje benigne hiperplazije prostate Ⅰ
Oct 18, 2022
Sažetak:Cistanche Tubulosakoristi se u tradicionalnoj medicini za liječenjenedostatak bubrega, neurastenija, bolesti seksualne disfunkcije, ibenigna hiperplazija prostate(BPH). Cilj ove studije bio je istražiti mehanizam kojim ekstrakt C. tubulosa (CSE) izazivaantiproliferativni učinak na tkivo prostateštakora izazvanih BPH. Učinci CSE na BHP procijenjeni su u smislu težine prostate, proizvodnje serumskog dihidrotestosterona (DHT) i ekspresije mRNA 5o-reduktaze tipa 1 i tipa 2 u tkivu prostate štakora izazvanih BHP. Osim toga, izvršeno je bojenje hematoksilinom i eozinom (H&E) za histološki pregled morfologije prostate, a razine ekspresije proteina u tkivu prostate ispitane su Western blot analizom. Liječenje CSE-om smanjilo je težinu prostate, koncentraciju DHT-a u serumu i ekspresiju mRNA 5o-reduktaze tipa 1 i tipa 2 u tkivu prostate štakora izazvanih BHP-om. Uz to, liječenje CSE-om suzbilo je staničnu proliferaciju reguliranjem razina ekspresije proteina povezanih s upalom (inducibilna sintaza dušikovog oksida i ciklooksigenaza 2) i proteina povezanih s apoptozom (familija proteina kaspaze-3 i Bcl-2). CSE može biti potencijalni terapijski kandidat za BHP zahvaljujući svojoj sposobnosti da regulira ekspresiju upalnih i proteina povezanih s apoptozom.
Ključne riječi:benigna hiperplazija prostate, Cistanche Tubulosa, dihidrotestosteron, upala, apoptoza, Bcl-2.
Uvod
Cistanche Tubulosaje parazitska biljka porijeklom iz sjeverozapadne Kine. Njegova je stabljika važan tradicionalni istočnjački lijek koji se koristi za liječenjenedostatak bubregaineurastenija(Deng et al. 2004). C.tubulosa je također prijavljena kao učinkovita u liječenjubolesti seksualne disfunkcije, kao što jeimpotencijaibenigna hiperplazija prostate(BPH) u korejskoj medicinskoj knjizi pod nazivom DonguiBogam. Feniletanoidni glikozidi (PhG) glavni su aktivni sastojci ove biljke (Jimenez i Riguera 1994). Za mnoge PhG se pokazalo da imaju širok raspon bioloških svojstava, uključujući antioksidativne i antitumorske učinke. Akteozid, PhG iz C. tubulosa, inhibira apoptozu induciranu 1-metil-4-fenilpiridinijevim ionom (MMP*) u neuronima cerebelarnih zrnaca (Pu et al. 2003). Iako su provedene studije o fiziološkim funkcijama C. tubulosa, molekularni mehanizmi koji leže u osnovi učinaka C. tubulosa na BPH nisu istraženi.
BPH je karakteriziran povećanjem prostate, zbog nekanceroznog rasta unutar žlijezde (Andriole et al. 2004). Povećanje prevalencije i učestalosti BPH događa se u kontekstu starenja stanovništva. Do 2030. godine 20 posto stanovništva SAD-a imat će 65 ili više godina, brojka koja će uključivati više od 20 milijuna muškaraca (Parsons 2010). Iako je BHP čest poremećaj kod starijih muškaraca, etiologija i patologija BHP nije u potpunosti definiran i trenutno ne postoji savršeno liječenje za BHP (Djavan i sur. 2010).
Mogućnosti liječenja BPH uključuju farmakološke i kirurške strategije.
Posljednjih godina smanjio se broj kirurških intervencija u bolesnika s BHP u korist farmakoloških tretmana (Emberton i sur. 2011.). Zbog prirode BPH, farmakološko liječenje zahtijeva dugotrajnu i kontinuiranu primjenu lijekova. Stoga je dugotrajna i kontinuirana podnošljivost lijeka vrlo važno pitanje. U liječenju BPH koriste se različite vrste farmakoloških sredstava kao što su inhibitori 5a-reduktaze (finasterid i du-tasterid) i antagonisti a-adrenoreceptora (alfuzosin, terazosin, doksazosin, tamsulosin) (Lepor 2011;
Untergasser et al. 2005). Glavni farmakološki agensi za liječenje BPH su inhibitori 5a-reduktaze, za koje je poznato da reguliraju razine 5o-dihidrotestosterona, i o-adrenergički blokatori (Tiwari et al. 2005). Iako se smatra da ovi farmakološki agensi značajno inhibiraju napredovanje BHP-a, brojne su studije izvijestile o njihovim neželjenim nuspojavama (Patel i Chapple 2006). Na primjer, zabilježeno je da finasterid uzrokuje različite nuspojave, uključujući vrtoglavicu, oslabljen rast mišića i tešku miopatiju, zbog svoje strukturne sličnosti sa steroidnim hormonima (McConnell et al. 2003; Uygur et al. 1998). Budući da ovi farmakološki agensi pokazuju neželjene nuspojave, pronalaženje biljnih lijekova koji učinkovito liječe BPH ima značajnu medicinsku vrijednost.
Kako bismo procijenili učinak C. tubulosa na BHP, pokazali smo da ekstrakt C. tubulosa (CSE) može modulirati neravnotežu između rasta stanica prostate i apoptoze u modelima štakora BHP izazvanih testosteronom.
Materijali i metode Materijali i reagensi
C.tubulosa je kupljena od Omniherb Co.Ltd. (Daegu, Republika Koreja), a finasterid je nabavljen od Merck and Co.Inc. (New Jersey, SAD). Testosteron, fenilmetilsulfonilfluorid (PMSF), Triton X-100, propidij jodid (PI), Nonidet P-40(NP-40) i koktel proteinskih inhibitora (PIC) kupljeni su od Sigma-Aldricha Chemical Co. (St. Louis, Missouri, SAD). GAPDH oligonukleotidne početnice i 5o-reduktaza tip 1 i tip 2 kupljeni su od Bioneera (Deajeon, Koreja), a SYBR Primix Ex Taq kupljen je od Takara (Shuzo, Shiga, Japan). Antitijela za anti-iNOS(M{{9} }), COX-2(C-20),poli(ADP-riboza)polimeraza-1(PARP-1,(D-1),kaspaza{{ 16}} (H-277),Bcl-2(C-2),Bcl-xL(H-5),Bax(B-9), i anti- -aktin (ACTBD11B7) kupljena su od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Kalifornija, SAD). Antitijela za anti-PCNA kupljena su od BD Biosciences, Pharmingen (San Diego, Kalifornija, SAD). Priprema C ekstrakt tubuloze (CSE)
Bilje C. tubulosa kupljene su od Omniherb Co.Ltd. (Yeongcheon, Kyungpook, Republika Koreja). Imali su sadržaj vlage od<13% by="" weight="" and="" were="" air-dried.="" afterward,="" herbs="" underwent="" extraction="" with="" 50%(v/v)="" ethanol-water="" at="" 60="" ℃for="" 8="" h.="" the="" extract="" obtained="" was="" filtered="" through="" 20="" μm="" cartridge="" paper,="" and="" ethanol="" was="" removed="" by="" vacuum="" rotary="" evaporation="" (eyela,="" japan).="" the="" concentrate="" was="" subsequently="" freeze-dried,="" and="" the="" yield="" was="" found="" to="" be="" 12%="" w/w.="" the="" experiment="" was="" performed="" by="" dissolving="" the="" dry="" extract="" in="" distilled="" water,="" and="" the="" rest="" of="" extract="" was="" stored="" at="" -20="" ℃.="" the="" identities="" of="" the="" active="" components="" of="" the="" extract,as="" determined="" by="" hplc,="" were="" reported="" previously(jiang="" and="" tu="">
Životinje
Deset tjedana stari mužjaci Sprague-Dawley štakora (200±20 g) kupljeni su od Daehan Biolink (Daejeon, Republika Koreja). Životinje su bile smještene u uvjetima koji su bili u skladu sa smjernicama za brigu i korištenje laboratorijskih životinja koje je usvojio i proglasio Institucionalni odbor za skrb o životinjama Sveučilišta Sangji (reg. br.2014-09). Štakori su se aklimatizirali na laboratorijske uvjete 2 tjedna prije početka eksperimenta. Omogućen im je slobodan pristup hrani i vodi tijekom 4 tjedna i održavani su pod ciklusom 12 sati svjetla/12 sati mraka pri konstantnoj temperaturi od 22±2 stupnja i relativnoj vlažnosti od 55±9 posto tijekom cijelog eksperimenta. Štakori su nasumično raspoređeni u jednu od 4 skupine (n=6): kontrolna skupina (Con, normalna prostata s otopinom nosača: fiziološka otopina s fosfatnim puferom (PBS) 200 μL, po）; skupina izazvana BHP (BPH), BPH-inducirana skupina tretirana finasteridom (5 mg/kg/dan, po,(Fina)); BPH-inducirana skupina liječena CSE-om (200 mg/kg/dan; po). Štakori u kontrolnoj skupini su rasječeni i zatim zašiveni bez uklanjanja testisa nakon anestezije zoletil@ 50 (20 mg/kg, ip); štakori u drugim skupinama su kastrirani. Nakon 3 dana oporavka, skupinama izazvanim BHP-om ubrizgan je testosteron propionat (10 mg/kg /dan, ip, otopljen u kukuruznom ulju) sam ili zajedno s CSE ili finasteridom dnevno tijekom 4 tjedna. Dvadeset četiri sata nakon posljednje primjene, svi štakori su žrtvovani nakon anestezije sa zoletil® 50 (20 mg/kg, ip). Uzorci krvi uzeti su iz kaudalne šuplje vene, a serum je odvojen centrifugiranjem i pohranjen na -80 stupnjeva. Cijela prostata je uklonjena i izvagana (Guo i sur.2004).
Omjer težine prostate i tjelesne težine
Tkiva prostate su izrezana, isprana i odmah izvagana. Omjer težine prostate i tjelesne težine (omjer PW/BW) izračunat je kako je opisano u nastavku.
Omjer PW/BW
= (svaka težina prostate životinje iz pokusne skupine/svaka tjelesna težina životinje iz pokusne skupine) x 100 Inhibicija rasta težine prostate
Po završetku studije, prostate su uklonjene i izvagane. Postotak inhibicije rasta izračunat je na sljedeći način:100-[(liječena skupina-kontrolna skupina)(BPH skupina-kontrolna skupina)×100]. Analiza koncentracije dihidrotestosterona (DHT) u serumu
Koncentracije DHT-a u serumu određene su komercijalnom ELISA (ALPCO Diagnostics, Salem, New Hampshire, SAD). Ispitivanja su provedena prema uputama proizvođača.
Histološka analiza
Tkivo prostate u svakoj skupini fiksirano je u 4 postotnoj otopini formalina, utopljeno u parafin, a zatim izrezano na dijelove od 4 pm. Sekcije su obojene hematoksilinom i eozinom (H&E) za histološki pregled. Slike su dobivene mikroskopom SZX10 (Olympus, Tokyo, Japan). Histološku analizu i debljinu epitelnog tkiva prostate (TETP) izmjerio je profesionalni histolog s Medicinskog znanstvenog instituta u Seulu (Seoul, Koreja) koristeći Leica Application Suite (LAS, ver. 3.3.0) softver za objektivnu procjenu u histološkoj analizi. Kvantitativna analiza lančane reakcije polimeraze (PCR) u stvarnom vremenu
Tkivo prostate svake životinje je homogenizirano, a ukupna RNA je izolirana pomoću Easy-Blue@ reagensa (Intron Biotech-nology Inc., Gyeongi-do, Republika Koreja) prema uputama proizvođača. Ukupna RNA je kvantificirana korištenjem Epoch@micro-volume spektrofotometarskog sustava (BioTek Instruments, Inc. Winooski, Vermont, SAD). Ukupna RNA iz jetre i visceralnog masnog tkiva pretvorena je u cDNA pomoću kompleta za reverznu transkripciju cDNA velikog kapaciteta (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornija, SAD). PCR amplifikacija je izvedena korištenjem inkorporacije SYBR green (Applied Biosystems ). Oligonukleotidni primeri za 5o-reduktazu tipa 1, dizajnirani iz štakora, bili su GGAAGG TTT CAT GGCCTT CG (naprijed) i TCG AGG GCA GCT GTA TG (obrnuto), 5o-reduktaza tipa 2, početnici, dizajnirani iz štakora, bili su ATG GGG ACC CTG ATC CTG TG (naprijed) i CGA CAC CACAAA GGA AGG CA (naličje), a GAPDH početnice, korištene kao gen za održavanje kuće i dizajnirane iz štakora, bile su TGA TTC TAC CCA CGG CAA GT (naprijed) i AGC ATC ACC CCA TTT GAT GT (obrnuto). Reverzna transkripcija je provedena korištenjem termociklera (Gene Amp⑧ PCR sustav 9700, Applied Biosystems), a rezultati su izraženi kao omjer optimalne gustoće prema GAPDH. Western blot analiza
Tkivo prostateiz svake životinje je homogeniziran u komercijalnom puferu za lizu PRO-PREP⑧ (Intron Biotechnology Inc.) i inkubiran 25 minuta na ledu da se izazove liza stanica. Ekstrakti tkiva su centrifugirani na 16 000g (4 stupnja) 20 minuta, a supernatant je prebačen u čistu epruvetu. Koncentracija proteina je pokazala tipične histološke promjene, uključujući zadebljani žljezdani epitel, vakuoliziranu citoplazmu usmjerenu prema lumenu žlijezde i smanjeno područje lumina žlijezde (Slika 3A). Primjena CSE-a tijekom 4 tjedna potisnula je ove tipične hiperplastične obrasce, koji predstavljaju histološku promjenu iz normalnog tkiva prostate u hiperplaziju prostate. Ukratko, histološki pregled skupina liječenih finasteridom i CSE pokazao je jasan trend poboljšanja hiperplazije prostate. Osim toga, kao što je prikazano na slici 3B, TETP analiza je pokazala da je najzadebljanije epitelno tkivo uočeno kod štakora izazvanih BHP u usporedbi s onim u bilo kojoj drugoj studijskoj skupini, a skupine liječene finasteridom i CSE-om pokazale su značajno smanjenje debljine prostate .
Kako bismo procijenili proliferaciju epitelnih stanica prostate, ispitali smo ekspresiju proteina PCNA u tkivu prostate štakora izazvanih BPH. Kao što je prikazano na slici 3C, Western blot analiza ukazuje na povećanje ekspresije proteina PCNA u skupini izazvanoj BPH u usporedbi s razinama PCNA u kontrolnoj skupini. Međutim, u usporedbi sa skupinom induciranom BPH, skupine liječene finasteridom i CSE-om pokazale su smanjenu ekspresiju PCNA proteina, što ukazuje na njihove antiproliferacijske učinke u BPH.
Slika 2. Učinak primjene ekstrakta Cistanche Tubulosa (CSE) na proizvodnju dilhidrotestosterona (DHT) u serumu i razine mRNA 5a-reduktaze tipa 1 i tipa 2 u tkivima prostate modela štakora izazvanih benignom hiperplazijom prostate (BPH). (A) Serumske koncentracije DHT određene su pomoću ELISA testa. (B) Ekspresija mRNA 5a-reduktaze tipa 1 i tipa 2 u tkivu prostate analizirana je kvantitativnom PCR-om u stvarnom vremenu. Prikazani podaci predstavljaju srednju vrijednost ± SEM od 6 štakora po skupini." str<><0.001 vs.con=""><0.001 vs.bph="">
