Učinci ekstrakta Piper Cambodianum Cistanche protiv starenja na normalne ljudske dermalne stanice fibroblasta i model zacjeljivanja rana kod miševa Ⅱ

Cistancheekstrahiraju zaštićene NHDF stanice od utjecaja UV zračenja

Stanice kože brzo reagiraju kada su izložene UV zračenju ili citokinima kao što su interleukin (IL)-4 i IL-13.19Nakon izlaganja UV zračenju, stimuliraju se različiti čimbenici, uključujući EGFR,20,21 TNFR,22mitogen-aktivirane proteinske (MAP) kinaze, ERK i c-Jun amino-terminalna kinaza (JNK).23I JNK i p38 fosforiliraju i aktiviraju faktor transkripcije c-Jun, što zauzvrat podiže c-Fos i povećava razine proteina aktivatora faktora transkripcije-1,24koji je potreban za transkripciju MMP. Ovi se receptori aktiviraju fosforilacijom MAP kinaze i drugih nizvodno proteina.25MAP kinaze se aktiviraju fosforilacijom specifičnih ostataka treonina i tirozina.24,26Izlaganje UV zračenju dovodi do visoke ekspresije c-Jun i c-Fos heterodimera, brojnih citokina i faktora rasta, koji su fosforilirani pomoću JNK i p38.27,28Slično tome, razine proteina p53 bile su povišene, počevši od 2,5 sata do 24 sata nakon izlaganja UV zračenju.29Pokazali smo da stanice izložene UV zračenju tijekom 24 sata izražavaju razine proteina TNFR1 i EGFR, koje se smanjuju ovisno o dozi kada su stanice tretirane sCistanche. Ispitali smo učinak UV zračenja na fosforilaciju i aktivnost p38 (Thr180/Tyr182). Razine proteina c-Jun i p53 bile su dramatično smanjene uCistanche-tretirane stanice (slike 4A i B).

Kliknite ovdje za više informacija o Cistanche za tretman protiv starenja

Ekstrakt Cistanche štitio je NHDF stanice ozračene UV-zracima od ROS-a

UVB svjetlost stimulira proizvodnju ROS-a,30,31a izlaganje UV zračenju na koži proizvodi ROS kao što je O2 ⋅−, H2 O2, i1 O2. 32Neliječeno iCistanche-tretirane stanice podvrgnute su UV zračenju 24 sata, a stvaranje ROS-a mjereno je sortiranjem stanica aktiviranim fluorescencijom (FACS).

Slika 3Regulacija ECM proteina uCistanche-tretirane stanice.Bilješke: (A) NHDF stanice su tretirane saCistancheza 24 sata. Stanični lizati analizirani su imunoblotingom pomoću protutijela protiv kolagena, anti-elastina, anti-MMP-3 i anti-ERK-2. Rezultati su reprezentativni za tri neovisna eksperimenta. (B) Aktin, kolagen, elastin, MMP-3 i ERK-2 u imunoprecipitatima kvantificirani su Western blotingom. Visine šipki su odgovarajuće srednje vrijednosti± SD tri neovisna eksperimenta. *P,0.05; **P,0.01. Kratice:Konc, koncentracija; ECM, izvanstanični matriks; ERK, kinaza regulirana izvanstaničnim signalom; MMP, matrična metaloproteinaza; NHDF, normalni ljudski dermalni fibroblast;Cistanche, Piper cambodianumP. Fourn.; SDs, standardne devijacije.

Slika 4Cistanche ekstrakt inhibicija proizvodnje ROS u stanicama ozračenim UV zračenjem.Bilješke: (A) NHDF stanice su bile izložene UV zračenju na 40 J tijekom 180 sekundi i tretirane sCistancheza 24 sata. Stanični lizati analizirani su imunoblotingom pomoću anti-TNFR6, anti-c-Jun, anti-c-Fos, anti-pp38 ili anti-p-JNK protutijela. Rezultati su reprezentativni za tri neovisna eksperimenta. (B) Ukupni i tirozin-fosforilirani p38, JUK, aktin i TNFR6 u imunoprecipitatima kvantificirani su Western analizama. Visine šipki su srednje vrijednosti± SD tri neovisna eksperimenta. *P,0.05; **P,0.01. Kratice:Konc, koncentracija; EGFR, receptor epidermalnog faktora rasta; JNK, c-Jun amino-terminalna kinaza; JNK, c-Jun N-terminalna kinaza; NHDF, normalni ljudski dermalni fibroblast;Cistanche, Piper cambodianumP. Fourn.; ROS, reaktivne vrste kisika; SD, standardna devijacija; TNFR, receptor faktora nekroze tumora; UV, ultraljubičasto.

UV zračenje povećalo je proizvodnju ROS-a, dok jeCistanche ekstrakt je smanjio proizvodnju ROS-a u NHDF stanicama. ROS razine H2 O2 mjereni su pomoću staničnih permeanata 2′,7′-diklorodihidrofluorescein diacetat (CM-H2 DCFDA) (Slika 5A). UV zračenje povećalo je razine ROS H2 O2 , dok su razine ROS-a smanjene zaCistanche ekstrakt na način ovisan o dozi (Slika 5B). Ovi su rezultati ukazali na toCistancheekstrakt štiti dermalne fibroblaste od UV zračenja smanjujući stvaranje ROS-a.

Makroskopsko promatranje zacjeljivanja rana kod miševa

Rane su napravljene na leđima miševa i zatim tretirane sCistancheizvadak (0, 1, 10 i 50µg/ml); površine rana su mjerene svaki dan tijekom 4 dana. Četvrtog dana, područja oko rana uCistanche-tretirani miševi pokazali su smanjeno crvenilo ovisno o dozi u usporedbi s netretiranim područjima rana (Slika 5). Površine rane tretirane ekstraktom bile su manje od netretirane površine rane, pokazujući uzorak ovisan o dozi. Četvrtog dana, područja rane tretirana sa 50µg/mL odCistanchebili potpuno prekriveni novim epitelom. Nijedno područje rane nije bilo zaraženo (Slika 6A i B). Izračunati su omjeri površina rana na dane 0 i 4 (Slika 6C).

Rasprava

Upotreba biljnih materijala i različitih biljnih dijelova raste s popratnim napretkom u fitoterapiji. Biljni materijali korišteni su u različitim oblicima kao što su mono- ili polibiljni lijekovi, dodaci prehrani i sastojci prehrane, a mnogi su postali poznati i sigurni komercijalni proizvodi.33Razne biljke, uključujućiCistanche, istražena su njihova potencijalna farmakološka svojstva, ali prethodno nije provedena komparativna studija sCistanche ekstrakt. Ovo je istraživanje provedeno kako bi se utvrdiloučinci odCistanche ekstrakt o aktivnostima zacjeljivanja rana korištenjem modela incizijskih rana kod miševa. Zacjeljivanje rana uključuje ponovnu uspostavu cjelovitosti tkiva kroz procese povezane s upalom, proliferacijom i fazama remodeliranja.34 Stadij remodeliranja kože karakterizira preformulacija i reformacija komponenti kolagenih vlakana koja poboljšavaju vlačnu čvrstoću.35Proces zacjeljivanja uglavnom je reguliran biosintezom i taloženjem novog kolagena te kasnijim sazrijevanjem.36U našem istraživanju rana,Cistanche ekstrakt je pokazao povećane učinke zacjeljivanja rana u usporedbi s kontrolom (slike 1C i 6). Takvo zacjeljivanje može biti posljedica povećane koncentracije kolagena i stabilizacije vlakana. U procesu popravka tkiva, upalne stanice pojačavaju migraciju i proliferaciju endotelnih stanica, što dovodi do neovaskularizacije stanica vezivnog tkiva koje sintetiziraju izvanstanične matrice, uključujući kolagen i keratinocite, što rezultira reepitelizacijom ozlijeđenog tkiva.37Brža stopa kontrakcije rane može povećati međustaničnu komunikaciju između stanica u fibroblastima i pospješiti brže sazrijevanje granulacijskog tkiva.38U modelu incizijske rane, miševi tretirani sCistancheekstrakt pokazao je brže zacjeljivanje rana u usporedbi s kontrolama (Slika 6). Brojne su studije otkrile da regulacija p38 kinaznog puta štiti razne stanične linije divljeg tipa s ekspresijom p53- od genotoksičnog stresa.39,40Naši podaci pokazali su da je ekspresija p38 u stanicama ozračenim UV-om smanjena zaCistanche liječenje. Stoga,Cistanche Ekstrakt dobiven iz listova i stabljika pokazao je učinkovit tretman u zacjeljivanju rana.Cistancheekstrahirati smanjenu proizvodnju ROS-a od UV zračenja uklanjanjem ROS-a u NHDF stanicama (slike 5A i B). Štoviše,Cistancheekstrakt ubrzao zacjeljivanje rana nakon zračenja kože ((Slika 6A–C). Ovi rezultati sugeriraju daCistanche Ekstrakt štiti kožu od oštećenja UV zračenjem i mogao bi biti koristan kao nova sirovina u kozmetičkoj primjeni.

Slika 5Cistanche-posredovana inhibicija proizvodnje ROS u stanicama ozračenim UV zračenjem.Bilješke: (A) Stanice su tretirane UVB zračenjem (40 J) navedeno vrijeme i zatim inkubirane s 2′,7′-diklorodihidrofluorescein diacetat 30 minuta. Stvaranje ROS-a mjereno je FACS-om. (B) Stanice su bile izložene UVB (40 J) 180 sekundi i tretirane naznačenom koncentracijomCistancheza 24 sata. Proizvodnja ROS-a procijenjena je bojanjem 2′,7′-diklorodihidrofluorescein diacetat i analiziran pomoću FACS.Kratice:FACS, sortiranje stanica aktivirano fluorescencijom; FITC, fluorescein izotiocijanat; NHDF, normalni ljudski dermalni fibroblast;Cistanche, Piper cambodianumP. Fourn.; ROS, reaktivne vrste kisika; UV, ultraljubičasto; UVB, ultraljubičasto B.

Slika 6Učinci zacjeljivanja rana na oštećenoj koži miša.Bilješke: (A) Rane promjera 5- mm stvorene su na dorzalnoj koži 7- tjedan dana starih muških C57Bl/6 miševa (n=3). Oporavak rana ocjenjivan je sCistanchetretman u različitim koncentracijama (negativna kontrola i tretman nakon rane sCistanchena 1, 10 i 50µg/ml). (B) Površina rane određena je mjerenjem promjera otvorenih rana. (C) Površina rane izračunata je korištenjem dimenzija otvorenih rana; *P,0.05; **P,0.01. Kratice:Cistanche, Piper cambodianumP. Fourn; Konc, koncentracija.

Zaključak

Ova studija istraživala jepotencijalni učinci ekstrakta stabljike i lista Cistanche protiv starenja i zacjeljivanja ranau NHDF stanicamai mišji model zacjeljivanja rana. Thetretman NHDF stanica s Cistancheom ekstraktipotiče oporavak ogrebenog područjana način ovisan o dozi kao i pojačanje ekspresije gena ECM. Osim toga, Cistancheekstraktibili u mogućnostištite stanicu od izlaganja UV zračenju smanjenjem proizvodnje ROS. Konačno, ova opažanja su dalje procijenjena i potvrđena na modelu miševa za in vivo zacjeljivanje rana. Stoga,Ekstrakt Cistanche predstavlja obećavajuće novo terapeutsko sredstvo za liječenje starenja i zacjeljivanje rana.

Zahvale:Ovu studiju je podržao Program temeljnih znanstvenih istraživanja kroz Nacionalnu istraživačku zakladu Koreje (NRF), koju financira Ministarstvo obrazovanja (NRF-2014R1A1A3050752). Autori bi željeli zahvaliti Korejskom istraživačkom institutu za bioznanost i biotehnologiju (KRIBB) na pružanjuCistancheekstrakti.

Razotkrivanje Autori navode da u ovom radu nema sukoba interesa.

Reference

1. Slominski AT, Zmijewski MA, Semak I, et al. Citokromi p450 i rak kože: uloga lokalnih endokrinih putova.Sredstva protiv raka Med Chem. 2014;14(1):77–96. 

2. Gilchrest BA. Starenje kože i fotostarenje.Dermatol njegovatelji. 1990; 2(2):79–82. 

3. Ha TY. Razvoj funkcionalnih prehrambenih materijala za zdrav život.Korejski J Crop Sci. 2006;51:26–39.

4. Makrantonaki E, Zouboulis CC. Molekularni mehanizmi starenja kože: stanje tehnike.Ann NY Acad Sci. 2007;1119:40–50. 

5. Seo MY, Chung SY, Choi WK, et al. Učinak rižinog vina protiv starenja u uzgojenim ljudskim fibroblastima i keratinocitima.J Biosci Bioeng. 2009; 107(3):266–271. 

6. Kligman AM. Rani destruktivni učinak sunčeve svjetlosti na ljudsku kožu.JAMA. 1969;210(13):2377–2380. 

7. Oikarinen A, Karvonen J, Uitto J, Hannuksela M. Promjene vezivnog tkiva u koži izloženoj prirodnom i terapeutskom UV-zračenju.Fotodermatol. 1985;2(1):15–26. 

8. Bech-Thomsen N, Wulf HC. Kancerogeni i melanogeni učinci filtriranog metalnog halida UVA izvora i cjevastog fluorescentnog UVA izvora tamnjenja sa ili bez dodatnog solarno simuliranog UV zračenja kod miševa bez dlake.Fotokemija fotobiol. 1995;62(4):773–779.

9. De MS, Lahiri SC. Studije na lišću cvjetnjaka.Bull Calcutta Sch Trop Med. 1971;19(3):69–72.

10. Ferreres F, Oliveira AP, Gil-Izquierdo A, Valentão P, Andrade PB. Listovi cvijeća: profiliranje fenolnih spojeva pomoću HPLC/DAD-ESI/MS(n) i antikolinesterazne aktivnosti.Fitokemija analni. 2014;25(5): 453–460.