Učinci ekstrakta butanola cvijeta kasije fistule protiv starenja i inhibicije tirozinaze 1. dio

Sažetak

Pozadina: Prirodni proizvodi napravljeni od biljnih izvora korišteni su u raznim kozmetičkim primjenama kao izvor prehrane i kao sredstvo za izbjeljivanje. Cvjetovi Cassia fistula L, obitelji Fabaceae, korišteni su kao tradicionalni lijek za kožne bolesti i zacjeljivanje rana, a objavljeno je da posjeduju antioksidativna svojstva. Istraživan je učinak ekstrakta cvijeta C. fistule protiv starenja na fibroblast ljudske kože.

Glikozid cistanhe također može povećati aktivnost SOD-a u tkivima srca i jetre, te značajno smanjiti sadržaj lipofuscina i MDA u svakom tkivu, učinkovito čisteći različite reaktivne kisikove radikale (OH-, H₂O₂, itd.) i štiteći od oštećenja DNA uzrokovanog pomoću OH-radikala. Cistanche feniletanoidni glikozidi imaju jaku sposobnost hvatanja slobodnih radikala, veću reducirajuću sposobnost od vitamina C, poboljšavaju aktivnost SOD u suspenziji spermija, smanjuju sadržaj MDA i imaju određeni zaštitni učinak na funkciju membrane spermija. Cistanche polisaharidi mogu pojačati aktivnost SOD i GSH-Px u eritrocitima i tkivu pluća eksperimentalno starih miševa uzrokovanih D-galaktozom, kao i smanjiti sadržaj MDA i kolagena u plućima i plazmi, te povećati sadržaj elastina, imaju dobar učinak čišćenja na DPPH, produžiti vrijeme hipoksije u starim miševima, poboljšati aktivnost SOD u serumu i odgoditi fiziološku degeneraciju pluća u eksperimentalno starim miševima Uz stančnu morfološke degeneraciju, pokusi su pokazali da Cistanche ima dobru antioksidacijsku sposobnost i ima potencijal da bude lijek za prevenciju i liječenje bolesti starenja kože. U isto vrijeme, ehinakozid u Cistancheu ima značajnu sposobnost hvatanja slobodnih radikala DPPH i može hvatati reaktivne vrste kisika, spriječiti degradaciju kolagena izazvanu slobodnim radikalima, a također ima dobar učinak popravka na oštećenje aniona slobodnih radikala timina.

Kliknite na prednosti Desert Cistanche

【Za više informacija:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Metode: Ekstrakcija butanolom cvjetova C. fistula je dovršena i aktivni spojevi su klasificirani. Citotoksičnost fibroblasta procijenjena je SRB testom kako bi se odabrale netoksične doze za daljnje pokuse. Zatim je izmjerena sinteza kolagena i hijaluronske kiseline (HA) pomoću kompleta za kolagen i ELISA. Štoviše, procijenjena je i aktivnost enzima, uključujući kolagenazu, matriksmeloproteinazu-2 (MMP-2) i tirozinazu.

Rezultati: Utvrđeno je da ekstrakt cvijeta nije utjecao na rast stanica fibroblasta kože (IC50 > 200 ug/mL). Rezultati su pokazali da je ekstrakt cvijeta značajno povećao sintezu kolagena i HA na način ovisan o dozi. Ekstrakt cvijeta (50-200 ug/mL) također je značajno inhibirao aktivnost kolagenaze i MMP-2. Nadalje, ovaj ekstrakt cvijeta mogao bi inhibirati aktivnost tirozinaze koja uzrokuje hiperpigmentaciju, što uzrokuje starenje kože.

Zaključci: Ekstrakt cvjetova C. fistule pokazao je preventivni učinak kada se koristi u svrhu sprječavanja starenja u fibroblastima ljudske kože i može biti prikladan izbor za kozmetičke proizvode koji imaju za cilj pružiti učinak izbjeljivanja, a koji su označeni kao proizvodi za njegu kože lica protiv starenja .

Ključne riječi: kolagenaza, sinteza kolagena, glikozaminoglikan, hijaluronska kiselina, matrična metaloproteinaza

Pozadina

Starenje kože je komplicirana biokemijska progresija koja je rezultat mnogih individualnih intrinzičnih i ekstrinzičnih čimbenika kao što su dob, hormoni i izloženost UV svjetlu [1]. Progresija se događa u epidermalnim i dermalnim slojevima i uglavnom je povezana s degradacijom izvanstaničnog matriksa (ECM) [2]. Enzimi uključeni u razgradnju ECM-a su matrične metaloproteinaze (MMP) kao što su želatinaze (MMP-2) i kolagenaze [3]. Koža gubi svoju vlačnu čvrstoću zbog učinka degradacije ECM-a MMP-ima. U tom procesu dolazi do boranja kože, a također se izrazito pojavljuju hrapavost i suhoća uz određene pigmentne abnormalnosti poput hipo- ili hiperpigmentacije [2, 4]. Za liječenje hiperpigmentacije, ispitivani su inhibitori tirozinaze. Tirozinaza je enzim koji ograničava brzinu i pretvara tirozin u melanin [5]. Inhibitori tirozina stoga igraju važnu ulogu kao agensi za posvjetljivanje kože [6], dok sinteza hijaluronske kiseline (HA) regulira hidrataciju kože i pojavu bora. HA, nesulfatirani glikozaminoglikan (GAG), sastoji se od ponavljajućih jedinica disaharida uključujući D-glukuronsku kiselinu i N-acetil-Dglukozamin [7]. HA također regulira popravak tkiva, uključujući poboljšanje odgovora imunološkog sustava aktivacijom upalnih stanica i kao odgovor na ozljedu fibroblasta [8-10].

Prirodni proizvodi napravljeni od biljnih izvora kao što su Glycyrrhiza glabra [11] ili zeleni čaj [12] korišteni su u kozmetičkoj primjeni kao izvor prehrane i kao sredstvo za izbjeljivanje. Značajan broj dokaza ukazao je na blagotvorne učinke oralno ili lokalno primijenjenih fitokemikalija iz biljnih ekstrakata, posebno u poboljšanju stanja kože. Neki primjeri blagotvornih učinaka su smanjenje starenja kože i upale kože. C. fistula (zlatni tuš), obitelj Fabaceae, nalazi se u brojnim azijskim zemljama kao što su Tajland, Kina, Mianmar i Indija. U prijašnjim studijama je utvrđeno da ekstrakt cvijeta C. fistule posjeduje antioksidativna, antikancerogena, antibakterijska, antifungalna i antidijabetička svojstva [13, 14]. Poznato je da je učinak C. fistule u ayurvedskoj medicini uključen u liječenje raznih poremećaja uključujući kožne bolesti, gubu, hematemezu, pruritus i dijabetes [15, 16]. Razni dijelovi C. fistule pokazali su farmakološka svojstva [17]. Cvjetovi, sjemenke, voće i pulpa korišteni su za liječenje kožnih bolesti uključujući gubu [18]. Pulpa je poznata po svojim antidijabetičkim svojstvima [15] i korištena je u toniku koji se primjenjivao u liječenju gihta i reumatizma [19]. Lišće i zrele mahune tradicionalno se koriste kao laksativ [20, 21]. Za fenolne i flavonoidne fitokemikalije C. fistula također se navodi da su korisni u liječenju kožnih bolesti [14]. Stoga nas u ovoj studiji zanima uloga ekstrakta cvijeta C. fistule u kozmeceutskim primjenama. Ispitivani su preventivni učinci degradacije ECM-a zajedno s enzimima starenja kože koji uključuju aktivnosti kolagenaze i MMP-2, kao i tirozinaze. Štoviše, utvrđena je sinteza kolagena i HA.

Metode

Kemikalije i reagensi

Dulbeccov modificirani Eagle Medium (DMEM), DQ želatina i penicilin-streptomicin dobavljeni su od Gibca (Grand Island, NY, SAD). Fetalni goveđi serum (FBS) nabavljen je od Thermo Scientific (SAD). Komplet za bojenje kolagena Sirius Red/Fast Green kupljen je od Chondrex, Inc. (Redmond, WA, SAD). Sulforhodamin B reagens, hijaluronska kiselina i tirozinaza gljiva dobiveni su od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SAD).

Biljni materijali

Cvjetovi C. fistule dobiveni su iz Lampang Herb Conservation, Lampang Province, Tajland. Broj uzorka vaučera (023197) ovjerila je Wannaree Charoensup, botaničarka u herbariju flore Tajlanda, Farmaceutski fakultet, Sveučilište Chiang Mai, Tajland.

Priprema ekstrakta cvijeta kasije fistule

Cvjetovi C. fistule su se sušili u zračnoj prostoriji, a zatim je 500 g suhih cvjetova sitno samljeveno u prah. Nakon toga, prah je natopljen u 50 postotnom etanolu i zatim mućkan na 70 okretaja u minuti 24 sata. Nakon 24 sata uzorci su zatim filtrirani kroz filtar papir kako bi se odvojio ostatak. Ostatak je namočen u 50 postotnom etanolu i mućkan na 70 okretaja u minuti tijekom 24 sata i ovaj korak je ponovljen 2 puta. Filtrirani uzorci skupljeni su i ispareni pomoću rotacijskog vakuumskog isparivača (BUCHI, Švicarska) kako bi se dobile vodene frakcije. Heksan je dodan vodenoj frakciji u omjeru heksana 2:1. Uzorci su protreseni i ostavljeni da se razdvoje tijekom 30 minuta. Uzorci su razdvojeni u dvije frakcije, a to su heksanska i vodena frakcija. Zatim je vodena frakcija sakupljena i dodan je 10 posto ugljena tijekom 30 minuta uz lagano miješanje na sobnoj temperaturi. Uzorci su filtrirani kroz filter papir i celit kako bi se odvojio ugljen. Uzorci su pomiješani sa zasićenim butanolom u omjeru zasićenog butanola 2:1 i uzorci su ostavljeni da se razdvoje tijekom 12 sati i ovaj korak je ponovljen 3 puta. Uzorci su razdvojeni u dvije frakcije, koje su uključivale frakciju vode i butanola. Voda je dalje dodana frakcijama butanola do jednakog volumena i te frakcije su ostavljene da ispare korištenjem rotacijskog vakuumskog isparivača. Ispareni uzorci osušeni su smrzavanjem kako bi se dobio prah ekstrakta cvijeta C. fistule.

Kvantifikacija ukupnog sadržaja fenola u ekstraktu cvjetova C. fistule pomoću UV-vidljivog spektrofotometra

Ukupni sadržaj fenola u ekstraktu cvijeta C. fistule određen je Folin-Ciocalteu testom. Ukratko, 0.4 mL ekstrakta cvijeta C. fistule pomiješano je s 0.3 mL 10 postotnog Folin-Ciocalteau reagensa i inkubirano u mraku na sobnoj temperaturi 3 minute . Zatim je dodano 0.3 mL otopine natrijevog karbonata i otopina je dalje inkubirana u mraku na sobnoj temperaturi 30 minuta. Apsorpcija je procijenjena na 765 nm korištenjem UV-vidljivog spektrofotometra. Izračunata je koncentracija ukupnog sadržaja fenola i uspoređena sa standardnom krivuljom za galnu kiselinu (GA) na 0-20 ug/mL. Ukupni sadržaj fenola prijavljen je kao miligrami GA ekvivalenata po gramu C. fistula. ekstrakt cvijeta (mg GAE/g ekstrakta).

Kvantifikacija fenolnih spojeva u ekstraktu cvijeta C. fistule pomoću HPLC analize

Različite vrste fenolnih spojeva u ekstraktima cvijeta C. fistule analizirane su HPLC analizom, a zatim su uspoređene sa standardnom galnom kiselinom, katehinima, protokatehuinskom kiselinom, vanilin kiselinom, klorogenskom kiselinom, ferulinskom kiselinom i kumarinskom kiselinom. Cvjetni ekstrakti su otopljeni u 50 postotnom etanolu i dalje su procijenjeni HPLC-om (Agilent Technologies, CA, SAD) korištenjem C18 kolone reverzne faze (WATER, MA, SAD). Mobilna faza sastojala se od metanola (A) i 0.1 posto trifluorooctene kiseline (TFA) u vodi (B) uz uvjete gradijenta. Brzina protoka je postavljena na 1,0 mL/min, a valna duljina detekcije je zabilježena na 280 s UV detektorom. Razine koncentracije fenolnih spojeva izračunate su i uspoređene sa standardnom krivuljom uzimajući u obzir standardne koncentracije i područja vrhova (mg/g ekstrakta).

Kvantifikacija ukupnog sadržaja flavonoida u ekstraktu cvijeta C. fistule pomoću kolorimetrijskog testa

Ukupni sadržaj flavonoida određen je kolorimetrijskim testom modificiranog aluminijevog klorida (AlCl3) kako je prethodno opisano [22]. Ukratko, 0.25 mL ekstrakta cvijeta pomiješano je s 0.125 mL 5 postotnog natrijeva nitrita (NaNO2) i otopina je inkubirana 5 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim je u smjesu umiješano 0.125 mL 10 posto AlCl3 i ostavljeno je u mraku 5 minuta. Nakon toga je dodano 1 mL natrijevog hidroksida (NaOH) i otopina je inkubirana 15 minuta na sobnoj temperaturi u mraku. Apsorbancija je izmjerena na 510 nm korištenjem UV-vidljivog spektrofotometra. Ukupni sadržaj flavonoida je izračunat i uspoređen sa standardnim vrijednostima katehina i izražen kao mg katehinski ekvivalent po gramu ekstrakta (mg CE/g ekstrakta).

Stanične kulture

Primarni fibroblasti ljudske kože aseptički su izolirani iz trbušnog ožiljka nakon kirurškog zahvata koji uključuje porođaj carskim rezom na kirurškom odjelu bolnice CM Maharaj, Sveučilište Chiang Mai (Chiang Mai, Tajland) (Šifra studije: BIO-2558-03549 odobrena od strane Medical Odbor za etiku istraživanja, Sveučilište Chiang Mai). Masnoća je uklonjena s početnog materijala i on je namočen u DMEM koji sadrži anti-penicilin i streptomicin. Nakon toga, koža je uronjena u DMEM koji je sadržavao 1 posto proteaze (Dispase, Gibco, Grand Island, NY, SAD) na 48 sati na 4 stupnja. Epidermalni slojevi su uklonjeni i normalni fibroblasti su izolirani iz dermisa. Fibroblasti su uzgajani u DMEM s dodatkom 10 posto FBS-a, 2 mM L-glutamina, 50 U/mL penicilina i 50 ug/mL streptomicina. Stanice su držane u 5 postotnom CO2 ovlaženom inkubatoru na 37 stupnjeva.

Test viabilnosti stanica

Ispitivanje stanične održivosti ekstrakta cvijeta C. fistule protiv stanica kožnih fibroblasta mjereno je ispitivanjem sulfohodaminom B (SRB) kao što je prethodno opisano [23]. Ukratko, stanice (8x103 stanica/jažici) su nasađene u 96-ploču s jažicama i inkubirane na 37 stupnjeva, 5 posto CO2 tijekom 24 sata. Nakon toga, stanice su tretirane s ili bez različitih koncentracija (0–200 ug/mL) ekstrakta cvijeta C. fistule tijekom 48 sati. Nakon 48 sati, stanicama je dodano 10 posto (w/v) trikloroctene kiseline (TCA), a stanice su zatim inkubirane na 4 stupnja tijekom 1 sata. Medij je uklonjen i stanice su isprane sporo tekućom vodom iz slavine. 0,057 posto (w/v) otopina SRB (100 μL) dodana je u svaku jažicu i stanice su inkubirane 30 minuta na sobnoj temperaturi. Otopina SRB je uklonjena, a zatim su stanice isprane 4 puta s 1 posto (v/v) octene kiseline i ostavljene su da se osuše na sobnoj temperaturi. Boja je otopljena s 10 mM otopinom Tris baze (pH 10,5) i apsorbancija je izmjerena na 510 nm pomoću čitača mikropločica.

Ispitivanje sinteze kolagena

Ukupni intracelularni kolagen u stanicama fibroblasta određen je pomoću kompleta za bojenje kolagena Sirius Red/Fast Green (Chondrex, Inc, Redmond, WA, SAD) prema uputama proizvođača. Ukratko, stanice fibroblasta kože nasađene su u ploče s 24 jažice tijekom 24 sata na 37 stupnjeva, 5 posto CO2. Nakon toga, stanice su prethodno tretirane DMEM medijem bez seruma tijekom 24 sata. Medij je uklonjen i stanice su zatim inkubirane sa ili bez ekstrakta cvijeta C. fistule (0-150 ug/mL) 48 h. Nakon 48 h, uzgojni medij je uklonjen. Zatim su stanice isprane s PBS-om i fiksirane Kahle fiksativom 10 minuta. Fiksativ je uklonjen i stanice su isprane s PBS. Otopina boje Sirius Red/Fast Green dodana je u svaku jažicu i uzorci su inkubirani 30 minuta na sobnoj temperaturi. Boja je uklonjena i stanice su isprane četiri puta s DI vodom ili dok tekućina nije postala bezbojna. Na kraju je dodan pufer za ekstrakciju i izmjerena je apsorbancija na 540 nm i 605 nm korištenjem UV-vidljivog spektrofotometra.

Određivanje aktivnosti kolagenaze

Aktivnost kolagenaze mjerena je pomoću modificiranog fluorogenog DQ™-želatinskog testa kao što je prethodno opisano [24]. Ukratko, različite koncentracije ekstrakta cvijeta C. fistule (0–200 ug/mL) dodane su u ploče s 96 jažica. Jedna U/ml kolagenaze dodana je u svaku jažicu (100 μL/jažici). Nakon toga je dodano 15 ug/mL želatine (DQ želatina) i smjese su inkubirane 10 minuta. Brzina proteolize određena je mjerenjem apsorbancije u intervalima od 2 minute tijekom 20 minuta korištenjem čitača mikropločica pri valnoj duljini ekscitacije od 485 nm i valnoj duljini emisije od 528 nm. Aktivnost enzima procijenjena je ispitivanjem nagiba linearne regresije između vremena i apsorbancije tijekom 2-6 min razdoblja.

Analiza aktivnosti MMP-2

Aktivnost MMP{{0}} određena je želatinskom zimografijom kao što je prethodno opisano [25]. Stanice fibroblasta uzgajane su u DMEM mediju bez seruma 24 sata. Nakon toga je sakupljen supernatant kulture. Supernatant kulture podvrgnut je 10 postotnom poliakrilamidnom gelu koji sadrži 0.1 posto w/v želatine u nereducirajućim uvjetima. Gelovi su isprani dva puta s 2,5 posto v/v Tritona X-100 tijekom 30 minuta na sobnoj temperaturi kako bi se uklonio SDS. Ploča gela je izrezana na kriške koje su odgovarale stazama, a zatim su rezovi stavljeni u različite spremnike i inkubirani s aktivacijskim puferom (50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4) koji sadrži različite koncentracije C Ekstrakt cvijeta fistule (0-200 ug/mL) na 37 stupnjeva tijekom 18 sati. Nakon toga, traka gelova je isprana i obojena Coomassie Brillant Blue R (0,1 posto w/v), a zatim je odbojana u 30 posto metanola i 10 posto octene kiseline. Aktivnost MMP-2 pojavila se kao jasna traka na plavoj pozadini. Trake probave kvantificirane su programom Image J.

Analiza sinteze hijaluronske kiseline (HA) pomoću ELISA

Učinak ekstrakta cvijeta C. fistule na sintezu HA određen je korištenjem ELISA kompleta kao što je prethodno opisano [26]. Stanice fibroblasta (5.0 × 104 stanice/jažici) su nasađene u 24-ploče s jažicama tijekom 24 sata na 37 stupnjeva, 5 posto CO2. Stanice su prethodno tretirane u mediju bez seruma tijekom 6 sati, a zatim su tretirane sa ili bez različitih koncentracija ekstrakta cvijeta C. fistule (0-200 ug/mL) tijekom 48 sati. Uzgojni medij je sakupljen i sinteza HA je mjerena pomoću ELISA. Apsorbancija je izmjerena na 450 i 570 nm pomoću čitača mikropločica. Izračunata je koncentracija HA u kultiviranom supernatantu dobivenom iz tretiranih stanica fibroblasta i uspoređena sa standardnom krivuljom HA.

Test inhibicije tirozinaze

Test inhibicije tirozinaze određen je kao što je prethodno opisano [27]. Različite koncentracije ekstrakta cvijeta C. fistule dodane su u 96-ploču s jažicama. Reakcija je provedena u natrijevom puferu (pH 6,4) koji sadrži 100 U/mL tirozinaze gljive. L-DOPA supstrat (1 mM) je dodan u reakcijsku smjesu i zatim je inkubirana 10 minuta na sobnoj temperaturi. Promjena apsorbancije na 490 nm mjerena je svakih 1,5 min tijekom 15 min pomoću čitača mikropločica. Postotak inhibicije tirozinaze izračunat je prema sljedećoj formuli:

Određivanje antioksidativne aktivnosti

Antioksidativna aktivnost ekstrakta cvijeta C. fistule određena je korištenjem aktivnosti slobodnih radikala 1, 1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH), kao što je prethodno opisano [28]. Različite koncentracije ekstrakta cvijeta (0–100 ug/mL) pripremljene su u metanolu. 1 mL 0,002 posto DPPH dodan je u 1 mL otopine ekstrakta cvijeta i smjesa je držana u mraku 30 minuta. Apsorbancija je mjerena na 517 nm pomoću spektrofotometra. Postotak inhibicije izračunat je i uspoređen sa standardnim vitaminom E (1-100 ug/mL) pomoću sljedeće formule:

Antioksidativna aktivnost ekstrakata cvijeta C. fistula potvrđena je pomoću ABTS testa, kao što je prethodno opisano [29]. ABTS [2, 2′- azino-bis (etilbenztiazolin-6-sulfonska kiselina)] kationski radikal pripremljen je miješanjem 7 mM osnovne otopine ABTS s 2,45 mM kalijevog persulfata (K2S2O8) (1/1, v/v). Smjesa je inkubirana u mraku 12-16 sati do završetka reakcije. Ispitivanje je provedeno na 990 µL otopine ABTS i 10 µL ekstrakta cvijeta (0-4 ug/mL). Nakon 6 minuta, apsorbancija je odmah zabilježena na 734 nm pomoću spektrofotometra. Postotak inhibicije ABTS aktivnosti ekstrakta cvijeta izračunat je pomoću sljedeće jednadžbe:

Statistička analiza

Svi podaci prikazani su kao srednje vrijednosti ± standardna devijacija (SD). Statistička analiza analizirana je softverom Prism verzija 6.0 koristeći jednosmjernu ANOVA s Dunnettovim testom. Statistička značajnost određena je na * p < 0.05, ** p < 0.01, ***p < 0,001 ili **** p < 0,0001.

Rezultati

Fitokemijska karakterizacija ekstrakta cvijeta C. fistule

Nakon koraka koji uključuje sušenje smrzavanjem uzoraka, ekstrakt cvijeta C. fistule je izvagan i dalje podvrgnut fitokemijskim i biološkim studijama. 18.08 g ekstrakta cvijeta C. fistula dobiveno je iz 500 g sirovog materijala, a postotak prinosa ekstrakta cvijeta bio je 3,62. HPLC otisak ekstrakata cvijeta C. fistula određen je HPLC analizom (slika 1). HPLC profil koji je pokazao vršnu vrijednost fenolnih spojeva obilježen je u smislu pojedinačnih komponenti u svakom vremenu zadržavanja. Karakterizacija fenolnih spojeva ekstrakta cvijeta C. fistula prikazana je u tablici 1. Ukupni sadržaj fenola u ekstraktu cvijeta bio je 275,32 ± 14,21 mg GAE/g ekstrakta. Utvrđeno je da su derivati ​​hidroksibenzojeve kiseline, uključujući vanilin kiselinu i protokatehinsku kiselinu, {{2{0}}.95 ± 0.09 i 2.56 ± 0. 42 mg/g ekstrakta, dok je galna kiselina zabilježena na {{30}}.60 ± 0.02 mg/g ekstrakta. Derivati ​​hidroksicimetne kiseline, uključujući kumaričnu kiselinu, ferulinsku kiselinu i klorogensku kiselinu, otkriveni su u koncentracijama od 0,39 ± 0,08, 0,80 ± 0,09 odnosno 0,83 ± 0,03 mg/g ekstrakta. Sadržaj flavonoida bio je 27,62 ± 3,56 mg CE/g ekstrakta. Katehin, kao derivat flavonola, izmjeren je na 1,10 ± 0.00 mg/g ekstrakta.

【Za više informacija:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】