Kemijska i genetička diskriminacija Cistanches Herba na temelju UPLC-QTOF/MS i DNA barkodiranja

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Sihao Zheng, Xue Jiang, Labin Wu, Zenghui Wang i Linfang Huang *

Sažetak

CistanchesHerba (Rou Cong Rong), poznata kao "pustinjski ginseng", ima upečatljiv ljekoviti učinak na snagu i prehranu, posebno kod jačanja bubrega za jačanje yanga. Međutim, dva biljna porijekla Cistanches Herba,Cistanche deserticolaiCistanche tubulosa, razlikuju se u pogledu farmakološkog djelovanja ikemijskikomponente. Za razlikovanje biljnog porijeklaCistanchesHerba, sustav kombinirane metodekemijskiigenetski– Tehnologija UPLC-QTOF/MS i DNA barkodiranje – prvi su put korišteni u ovoj studiji. Rezultati su pokazali da su tri potencijalna markerska spoja (izomer kampneozida II, cistanozida C i cistanozida A) dobivena za razlikovanje dvaju izvora PCA i OPLS-DA analizama. DNK barkodiranje omogućilo je točno razlikovanje dva podrijetla. NJ stablo pokazalo je da su dva izvora grupirana u dvije klade. Naša otkrića pokazuju da su dva porijeklaCistanchesHerba posjeduje različitekemijskikompozicije igenetskivarijacije. Ovo je prva prijavljena procjena dvaju izvoraCistanches Herba, a nalaz će olakšati kontrolu kvalitete i njegovu kliničku primjenu.

Kliknite ovdje za više informacija o Cistancheu

Uvod

CistanchesHerba (Rou Cong Rong), poznata kao "pustinjski ginseng", potječe od osušenih sočnih stabljikaCistanchedeserticola YC Ma i Cistanche tubulosa (Schrenk) perika prema Kineskoj farmakopeji (izdanje iz 2010.) i popularna je zbog toniziranja bubrega-yina, blagotvornog djelovanja na životnu esenciju i opuštanja crijeva. Trenutno je Cistanches Herba uglavnom rasprostranjena u sušnim i toplim pustinjama u sjeverozapadnoj Kini, posebno u provincijama Xinjiang i Unutarnja Mongolija. Međutim, dva porijekla Cistanches Herba razlikuju se u smislu njihove farmakološke aktivnosti ikemijskikomponente. Tu et al. istraživao uvarak od triCistanchevrste (C. deserticola, C. tubulosa, Cistanche salsa) i otkrili da je C. tubulosa pokazala najmanji učinak u modelu miša s nedostatkom Yang [1]. Zhang i sur. uspoređivali su farmakološku aktivnost između C. deserticola, C. tubulosa i C. salsa i otkrili da te vrste imaju ljekovite funkcije kao što su otpornost na umor i hipoksiju, ali ne u istoj mjeri [2]. Prethodna istraživanja su izvijestila okemijskikomponentu i ukazao na razliku odkemijskikomponenta i sadržaj za biljno podrijetloCistanchesHerba [3]. Što se tiče kliničke primjene i tržišne cirkulacije, kao tonik, C. tubulosa tradicionalno se koristi kao sredstvo za poticanje cirkulacije krvi i u liječenju impotencije, steriliteta, lumbaga, tjelesne slabosti u Japanu [4]-[8].

Stoga je od velike važnosti razlikovati dva podrijetlaCistanchesHerba za kontrolu kvalitete i kliničku primjenu. Međutim, nema fokusa istraživanja na razlikovanju dvaju podrijetla Cistanches Herba. Mnoge istražene metode, uključujući mikroskopiju, ultraljubičastu i infracrvenu detekciju, metodu ponavljanja jednostavnih sekvenci korištene su za identifikaciju roda Cistanches, ali ne samo za dva podrijetla, posebno [9]–[20]. Ovdje smo konjunktivno koristilikemijskii molekularne tehnike za razlikovanje dvaju izvoraCistanchesHerba, UPLC-QTOF/MS (tekućinska kromatografija ultraučinkovitosti u kombinaciji s kvadrupolnom time-of-flight masenom spektrometrijom) i DNA barkodiranje. UPLC-QTOF/MS pruža informacije brže i učinkovitije u usporedbi s drugim tehnikama. Visoka selektivnost i osjetljivost UPLC-QTOF/MS rezultirala je njegovom primjenom i za kvantitativne i za kvalitativne analize, kao i za analizu metabolita i identifikaciju složenih spojeva u tradicionalnoj kineskoj medicini [21]–[22]. Analiza glavnih komponenti (PCA) i ortogonalna projekcija na diskriminantnu analizu latentne strukture (OPLSDA) također su razvijene za identifikaciju potencijalnih spojeva markera. DNK barkodiranje, lakša i univerzalnija tehnologija molekularnih markera, koristi fragment DNK za identifikaciju vrsta ili rodova. Objektivan je, precizniji i lakši za izvođenje od tradicionalnih metoda identifikacije i drugih tehnologija molekularnih markera. Štoviše, DNK barkodiranje uspješno je primijenjeno za identifikaciju životinja i biljaka, uključujući ljekovito bilje [23]–[26].

Svrha ovog istraživanja je uspostaviti sustav znanstvene metode, kombinirani UPLC-QTOF/MS i DNA barkodiranje, za razlikovanje dvaju biljnih izvoraCistanchesHerba.

Materijali i metode

Etička izjava

Potvrđujemo da terenska istraživanja nisu uključivala ugrožene ili zaštićene vrste. GPS koordinate uključene su u informacije o uzorku, pogledajte tablicu 1."

Tablica 1 Uzorci odCistanchedeserticola i Cistanche tubulosa.

WLMQ je značio grad Wu Lu Mu Qi; GJH je značio Gan Jia Hu; HBKSEMG je značilo autonomnu županiju Hoboksar Mongol; KLMY je značilo grad Ke La Ma Yi; BDJLSM je značilo pustinju Badain Jaran; ALSZQ je značio Alxin lijevi banner; DSX je značio okrug Dong San; CL je značilo okrug Ce Le; MF je značio okrug Min Feng; HT je značilo okrug He Tian.

Biljni materijali i reagensi

Sukulentne stabljikeCistanchesBiljke su prikupljene iz divljih pustinjskih područja u Unutarnjoj Mongoliji, provinciji Qinghai, autonomnoj regiji Xinjiang Uygur, Narodnoj Republici Kini (Tablica 1) u svibnju 2012. Svi uzorci istraživanja prikupljeni su u divljim pustinjskim regijama, a ne na privatnom zemljištu, gdje nisu bile potrebne posebne dozvole. Botanički identitet stabljika potvrdio je dr. Linfang Huang. Uzorci vaučera pohranjeni su u Zavodu za razvoj ljekovitog bilja. Za UPLC analizu korišteni su acetonitril za tekućinsku kromatografiju visoke učinkovitosti (HPLC) (Merck KGaA, Darmstadt, Njemačka) i mravlja kiselina (Tedia, SAD). Deionizirana voda je pročišćena pomoću Milli-Q sustava (Millipore, Bedford, MA, SAD). Sve ostalokemikalijebili su analitičkog stupnja.

Priprema uzorka

CistanchesHerba uzorci (1.0 g, 65-mesh) prebačeni su u 50-mL stožastu tikvicu i dodano je 50 mL 70% metanola. Nakon namakanja od 30 minuta, ultrazvuk (35 kHz) je izveden na sobnoj temperaturi 30 minuta. Nakon centrifugiranja na 10,000 okr/min tijekom 10 minuta, supernatant je pohranjen na 4 stupnja i filtriran kroz membranu od 0.22-μm prije ubrizgavanja u UPLC-QTOF/MS sustav za analizu.

UPLC-QTOF/MS

Za UPLC analizu korišteni su sljedeći sustavi/parametri: Waters Acquity sustav (Waters) opremljen binarnom pumpom za isporuku otapala, automatskim uzorkovačem i PDA detektorom spojenim na Waters Empower 2 podatkovnu stanicu; ultrazvučna obrada (250 W, 50 kHz, Kunshan Ultrasonic Instrument Co., Zhejiang, Kina); i model elektroničke analitičke vage AB135-2 (Mettler-Toledo., Greifensee, Zurich, Švicarska). Korištene su Waters Acquity UPLC BEH C18 kolona (1,7 µm, 2,1×100 mm, Waters) i Waters C18 zaštitna kolona (isti materijal, vode) i održavane na 30 stupnjeva. Mobilna faza bila je 0,1 postotna vodena otopina mravlje kiseline (A) i acetonitril (B) sa sljedećim programom gradijenta: 0-3 min, 10-22 posto B; 3–4 min, 22–23 posto B; 4–6 min, 23–35 posto B; 6-8 min, 35-37 posto B; 8-11 min, 37-42 posto B; 11-12 min, 42-48 posto B; 12–15 min, 48 posto – 50 posto B pri brzini protoka od 0,3 mL/min. Volumen injekcije bio je 5 uL.

UPLC/MS analiza provedena je na QTOF Synapt G2 HDMS sustavu (Waters, Manchester, UK) opremljenom izvorom elektrosprejne ionizacije (ESI) koji radi u načinu rada negativnih iona. Kao plin za desolvataciju korišten je N2. Temperatura desolvatacije postavljena je na 45{{10}} stupnjeva pri protoku od 800 L/h, a temperatura izvora je postavljena na 120 stupnjeva. Kapilarni i konusni napon postavljeni su na 2500 odnosno 40 V. Podaci su prikupljeni između 50–1200 Da s vremenom skeniranja od 0.1- s i kašnjenjem između skeniranja od 0.01- s tijekom vremena analize od 15- min. Argon je korišten kao kolizijski plin pri tlaku od 7,06661023 Pa. Svi MS podaci prikupljeni su pomoću sustava LockSpray kako bi se osigurala točnost mase i ponovljivost. [MH]- ion leucin-enkefalina na m/z 554,2615 korišten je kao lock masa u negativnom ESI modu.

UPLC-QTOF/MS podaci zaCistanchesUzorci Herbe analizirani su kako bi se identificirale potencijalne diskriminirajuće varijable. Pronalaženje vrhova, usklađivanje i filtriranje neobrađenih ES podataka provedeno je pomoću upravitelja aplikacija Marker Lynx, verzija 4.1 (Waters, Manchester, UK). Upotrijebljeni parametri bili su sljedeći: vrijeme zadržavanja (tR) od 0–15 min, masa 50–1200 Da, tolerancija vremena zadržavanja od 0,02 min i masa tolerancija od 0,02 Da. Upotrijebljena su tri ponovljena uzorka prikupljena sa svake geografske lokacije (n = 3). Za izradu modela korišteno je ukupno 6339 varijabli.

DNK barkodiranje: ekstrakcija DNK, PCR amplifikacija i sekvenciranje

Uzorci uzeti iz osušenih mesnatih stabljika C. deserticola i C. tubulosa (30 mg) trljani su 2 minute frekvencijom od 30 r/s. DNA je ekstrahirana prema uputama proizvođača (Tiangen). Konkretno, protokol je modificiran tako da je kloroform zamijenjen mješavinom kloroforma: izoamil alkohola (24∶1 u istom volumenu) i puferske otopine GP2 s izopropanolom (isti volumen). Utrljani prah stavljen je u eppendorfove epruvete od 1,5 ml, dodano je 700 µL GP1 prethodno zagrijanog na 65 stupnjeva i 1 µL -merkaptoetanola za miješanje korištenjem vorteksa 10-20 s, te inkubirano 60 minuta na 65 stupnjeva; Dodavanje 700 µL mješavine kloroforma: izoamil alkohola (24∶1), centrifugiranje 5 minuta na 12000 okretaja u minuti (~13400×g); Otpipetirajte supernatant u novu epruvetu, dodajući 700 µL izopropanola, miješajući 15-20 minuta; Ubaciti svu smjesu u centrifugiranu kolonu CB3 i centrifugirati 40 s pri 12000 okretaja u minuti; Bacanje filtrata i dodavanje 500 µL GD (dodavanje kvantitativnog bezvodnog etanola prije upotrebe), centrifugiranje na 12000 okretaja u minuti tijekom 40 s; odbacivanje filtrata i dodavanje 700 µL PW (dodavanje kvantitativnog bezvodnog etanola prije upotrebe) za ispiranje membrane, centrifugiranje 40 s na 12000 okretaja u minuti; Odbaciti filtrat i dodati 500 µL PW, centrifugirati 40 s pri 12000 okretaja u minuti; Odbaciti filtrat i centrifugirati 2 minute na 12000 okretaja u minuti kako bi se uklonio zaostali pufer za ispiranje PW; Prebacivanje centrifugalne kolone CB3 u čistu Eppendorfovu epruvetu od 1,5 ml i sušenje na sobnoj temperaturi 3-5 minuta; Centrifugirajte 2 minute na 12000 okretaja u minuti kako biste dobili ukupnu DNK. Početnice za lančanu reakciju polimerazom (PCR) temeljene su na prethodno objavljenim sekvencama [4], [5]. Reakcijske smjese za PCR sadržavale su 2-μL šablona DNA, 8.5-μL ddH2O, 12.5-μL 2× Taq PCR Master Mix (Beijing TransGen Biotech Co., Kina), 1/{ {57}}μL naprijed/natrag (F/R) početnica (2,5 µM), u konačnom volumenu od 25 µL. PCR amplifikacija je provedena kako su opisali Kress et al. [4]. Primeri PCR reakcije bili su fwd PA: GTTATGCATGAACGTAATGCTC (5′-3′) i rev TH: CGCGCATGGTGGATTCACAATCC (5′-3′). PCR produkti su odvojeni i detektirani elektroforezom na 1 postotnom agaroznom gelu. PCR proizvodi su pročišćeni prema protokolu proizvođača i izravno podvrgnuti sekvencioniranju.

Usklađivanje sekvenci i analiza

ITS i ITS2 sekvence prikupljene su iz GenBank baze podataka. Nizovi iz sekvenciranja uzoraka predani su u bazu podataka GenBank (pristupni brojevi navedeni su u tablici 1), sastavljeni s CodonCode Aligner 3.7.1 (CodonCode Co., SAD) i usklađeni pomoću ClustalW. Kimura 2-Udaljenosti parametara (K2P), GC sadržaj baze i stabla spajanja susjeda (NJ) izračunati su i konstruirani korištenjem MEGA 5.05 s metodom Bootstrap (1000 ponovno uzorkovanje) i K2P modelom [27]. Praznina kodiranja (prostorna regija koja je nastala između intra- i inter-specifičnihgenetskivarijacije) i učinkovitost identifikacije (sposobnost identifikacije za usporedbu različitih crtičnih kodova) nacrtani su i izračunati na temelju metode koju su objavili Meyer i Paulay [28].

Rezultati

Probno dodjeljivanje vrha pomoću UPLC-QTOF/MS

Reprezentativni kromatogrami C. deserticola i C. tubulosa iz različitih proizvodnih područja prikazani su na slici 1. Kromatogram otiska prsta ukazuje na sličnosti izmeđuCistanchesUzorci herba. Ukupno su detektirana 23 kvalificirana maksimuma mase, a identificirano je 16 maksimuma uspoređivanjem retencijskih vremena i spektra mase s onima koji su prethodno objavljeni (Tablica 2) [29]–[35]. Pikovi 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 17, 20, 21, 22 i 23 su provizorno identificirani kao cistanozid F, musaenozidna kiselina, cistanbulozid C1/C2, kampneozid II , izomer kampneozida II, ehinakozida, cistanozida A, akteozida, izoakteozida, siringalida A-3′- -L-ramnopiranozida, cistanozida C, 2'-acetilakteozida, osmantusida B, cistanozida D, tubulozida B i cistancinenzid A, odnosno.Kemijskiutvrđeno je da su sastojci primarno feniletanoidni glikozidi (PhG), dok je jedan spoj, musaenozidna kiselina, bio iridoidni polisaharid. PhG su glavni aktivni spojevi u liječenju bubrežne deficijencije, te antioksidativnih i neuroprotektivnih učinaka [36].

Slika 1 Reprezentativni kromatogrami C. deserticola i C. tubulosa.

Na lijevoj strani su bili kromatogrami C. deserticola prikupljeni s različitih lokacija; desna strana bili su kromatogrami C. tubulosa prikupljeni s različitih lokacija. Ova slika pokazuje razlike između ova dva porijekla ukemijskiprofili.

Tablica 2. Privremeno identificirani spojevi iz C. deserticola i C. tubulosa.

PCA C. deserticola i C. tubulosa

PCA je korišten za razlikovanje uzoraka različitih biljnih vrsta. PCA je nenadzirana metoda multivarijantne analize podataka koja ima za cilj vizualizirati sličnosti i/ili razlike unutar multivarijatnih podataka o sastavu sekundarnog metabolita [37]. Dvokomponentni PCA model kumulativno je odgovoran za 46,04 posto varijacije (PC1, 36,43 posto; PC2, 9,61 posto). Slika 2 pokazuje da su 24 uzorka grupirana u dvije skupine u PCA rezultatima ucrtanim prema podrijetlu vrste, što ukazuje da se kemijski sastav C. deserticola i C. tubulosa značajno razlikuje.

Slika 2 PCA C. deserticola i C. tubulosa.

Ti su uzorci grupirani u dvije skupine prema podrijetlu vrste, što je pokazalo da se kemijski sastav između C. deserticola i C. tubulosa značajno razlikuje.

OPLS-DA i identifikacija markera

Za prepoznavanje potencijalakemijskimarkera za razlikovanje dviju vrsta, generirana je S-plota OPLS-DA (slika 3). Na S-grafikonu svaka točka predstavlja jedan tR–m/z ionski par. X i Y osi predstavljaju doprinos odnosno pouzdanost iona; što je veća udaljenost koju ion t R–m/z par pokazuje od nule, to je veći doprinos/pouzdanje ovog iona razlici između dviju skupina. Stoga, tR–m/z ion koji pokazuje na dva kraja 'S' predstavlja karakteristične markere s najvećom pouzdanošću u svakoj skupini.

Slika 3 OPLS-DA (S-grafikon) C. deserticola i C. tubulosa.

Jedan grafikon predstavlja jedan tR–m/z ionski par. Ove kvadratne parcele bile sukemijskiioni markeri koji razlikuju dva izvora. Kvadratni prikazi u trećem kvadrantu bili su ioni kemijski markeri s većim doprinosom i pouzdanošću u C. deserticola, a kvadratni prikazi u prvom kvadrantu bili su ioni kemijski markeri s većim doprinosom i pouzdanošću u C. tubulosa.

Rezultati OPLS-DA pokazali su da se UPLC-QTOF/MS može koristiti za razlikovanje C.deserticolaod C.tubuloza(slika 3). Utvrđeno je ukupno šest vjerodostojnih i značajnih markera koji olakšavaju diskriminaciju ovih skupina (Tablica 3). Identiteti triju potencijalnih markera provizorno su dodijeljeni. Komponente u korelaciji s ova tri iona provizorno su identificirane kao izomeri kampneozida II, cistanozida C i cistanozida A. Spojevi markeri a, b i c mogu se koristiti za razlikovanje dviju biljnih vrsta, kao intenzitet iona a i b u C.deserticolabio veći nego u C. tubulosa (Sl. 4A, 4B), a marker c se mogao detektirati u C. tubulosa, ali ne i u C. deserticola (Sl. 4C).

Slika 4 Intenziteti iona markera a, b i c.

Intenziteti iona markera a i b u C. deserticola bili su viši nego u C. Tubulosa, a marker ion c mogao se detektirati u C. tubulosa, ali nije se mogao detektirati u C. deserticola.

Tablica 3 Marer tR–m/z ionski parovi u S-grafikonu.

DNK barkodiranje: informacija o slijedu i učinkovitost identifikacije

Podaci o sekvenci prikazani su u tablici 4. Prosjekgenetskiudaljenost psbA-trnH (0.1732) bila je značajno veća od druge dvije regije (0.0740, 0,1197). Prosječni GC sadržaj psbA-trnH (20,64 posto) bio je manji od druge dvije regije (55.00 posto, 55.00 posto). Iako stopa uspješnosti ITS i ITS2 nije dobivena u ovoj studiji, regija psbA-trnH pokazala se dobro u PCR amplifikaciji i sekvencioniranju (100 posto, 87,23 posto). Učinkovitost identifikacije postignuta je analizom BLAST1 i metodom najbliže udaljenosti, a uglavnom odražava stopu uspješnosti bar kodova. Regija psbA-trnH bila je jasno bolja od druga dva crtična koda u učinkovitosti identifikacije na temelju dvije metode. Nedostatak sekvenci najvjerojatnije je razlog što je ITS regija pokazala 100 postotnu učinkovitost identifikacije na temelju metode BLAST1, odnosno 0 na temelju metode najbliže udaljenosti.

Tablica 4 Učinkovitost identifikacije triju lokusa različitim metodama identifikacije vrsta.

Analiza genetske divergencije pomoću šest parametara

Korišteno je šest parametara za analizu intraspecifične varijacije i interspecifične divergencije pomoću tri crtična koda (Tablica 5). Značajna razlika između inter- i intra-specifičnih varijacija bila je indikativna za korisnost DNK barkodova. Ovdje je minimalna međuvrsna udaljenost tri crtična koda bila veća od maksimalne intraspecifične udaljenosti. Štoviše, regija psbA-trnH imala je veću maksimalnu intraspecifičnu udaljenost i prosječnu interspecifičnu udaljenost od druga dva barkoda, što ukazuje da je regija psbA-trnH bila dobra u razlikovanju dvaju izvoraCistanchesHerba.

Tablica 5. Analiza međurodovno specifične divergencije i unutarspecifične varijacije tri crtična koda.

Analiza praznina kodiranja za identifikaciju C. deserticola i C. tubulosa

Praznina kodiranja predstavlja nevjerojatnu varijaciju među vrstama i unutar vrsta i pokazuje odvojene distribucije koje se ne preklapaju između uzoraka unutar i među vrstama. U ovoj studiji (slika 5), ​​raspon udaljenosti postavljen je na 0–0.45, jer je najveća K2P udaljenost psbA-trnH između C. deserticola i C. tubulosa bila blizu { {11}}.45. Tri barkoda pokazala su jasne nedostatke u distribuciji intra- i inter-specifične varijacije. Nadalje, razmak psbA-trnH bio je znatno veći od druga dva barkoda. Stoga bi regija psbA-trnH mogla biti idealan crtični kod za razlikovanje dvaju izvoraCistanchesHerba.

Slika 5 Relativna distribucija međuspecifične divergencije i unutarspecifične varijacije u tri crtična koda.

Tri crtična koda ITS2, ITS, psbA-trnH analizirana su za relativnu distribuciju međuspecifične divergencije i unutarspecifične varijacije između C. deserticola i C. tubulosa na temelju K2Pgenetskiudaljenost.

Stablo spajanja susjeda (NJ).

NJ stablo ilustrira odnos među vrstama i olakšava određivanje njihovog grupiranja. U ovoj studiji, NJ stablo od tri crtična koda izgrađeno je na temelju K2P modela (slika 6). Rezultati su pokazali da postoje dva podrijetlaCistanchesHerba se zasebno grupira u dva klasusa. Dakle, stablo NJ jasno razlikuje izmeđuC. deserticola i C. tubulosa.

Slika 6 NJ stablo C. deserticola i C. tubulosa s tri crtična koda.

Izgrađeno je stablo NJ C. deserticola i C. tubulosa s tri barkoda. Bootstrap rezultati (1000 ponavljanja) prikazani su (veće ili jednako 50 posto) za svaku granu. C. deserticola i C. tubulosa bile su jasno grupirane u dvije klade.

Rasprava i zaključci

CistanchesHerba je važan ljekoviti materijal koji se obično koristi za prehranu azijske zajednice [38]. Međutim, dva izvora Cistanches Herba, C. deserticola i C. tubulosa, imaju različite kemijske sastave i farmakološku aktivnost. Istodobno, dva izvora se razlikuju u kliničkoj primjeni i tržištu robe. KlasifikacijaCistancheje zbunjen i masovni nadomjesci i štetnici preplavljuju tržište zbog nedostatka resursa i posebnog okruženja za uzgoj Cistanches Herba. Prihvaćeno je da rod Cistanche uključuje četiri vrste i jednu varijantu: C. deserticola, C. tubulosa, C. Sinensis, C. salsa i C. salsa var. albiflora [39]. Istraživači u Japanu smatrali su porijeklo Cistanches Herba kao C. salsa [40]–[43], dok ju je Tu [44]–[46] identificirao kao C. deserticola. Stoga postoji zabuna u klasifikaciji Cistanche i teško je razlikovati dva porijekla Cistanches Herba.

Tradicionalne metode kontrole kvaliteteCistanchesHerba su morfološka identifikacija [47], [48], mikroskopska identifikacija [49] i TLC (tankoslojna kromatografija) [50], [51], FTIR (Fourierova transformacijska infracrvena spektroskopija) [14], HPLC (tekućinska kromatografija visoke učinkovitosti). ) [52], [53]. Morfološkim i mikroskopskim metodama lako se mogu razlikovati vrste iz različitih rodova ili familija koje imaju velike razlike u morfološkim i mikroskopskim karakteristikama, dok je srodne vrste teško razlikovati. TLC i FTIR mogu jasno razlikovati vrste koje imaju različite vrste kemijskog sastava, dok je teško odreditikemijskikomponenta i sadržaj. HPLC se uglavnom koristi za razlikovanje vrsta s različitimkemijskisadržaja elemenata, međutim, vrijeme analize je dulje i osjetljivost je relativno niža u usporedbi s UPLC-om. Sukladno tome, tehnologija UPLC-QTOF/MS bila je brža i točnija u određivanju kemijskog sastava od drugih kemijskih metoda. Metode molekularne identifikacije dobro se pokazuju u razlikovanju na temeljugenetskivarijacija, kao što je SDS-PAGE (elektroforeza natrijevog dodecil sulfata i poliakrilamidnog gela) [54], AFLP (polimorfizam duljine pojačanog fragmenta) [55], [56]. Međutim, ovim molekularnim metodama nije lako upravljati i nisu univerzalne. U skladu s tim, DNK barkodiranje bi moglo diskriminirati vrste univerzalnije, brže i točnije od drugih molekularnih metoda. Za vrste iz istog i bliskog rodagenetskiodnos, te metode same po sebi možda neće imati dobre rezultate u identifikaciji. Ovdje smo kombinirali UPLC-QTOF/MS i DNA barkodiranje u identificiranju C. deserticola i C. tubulosa i procijenili kemijske i molekularne markere koji bi omogućili njihovu diskriminaciju. Otkrivena su 23 kvalificirana maksimuma mase, a 16 ih je identificirano pomoću UPLC–QTOF/MS, a prvo je pronađeno da tri potencijalna markerska spoja olakšavaju razlikovanje dvaju izvora PCA i OPLS-DA analizom. Nadalje, četiri su pokazatelja procijenjena tehnologijom DNK barkodiranja u smislu njihove sposobnosti razlikovanja dvaju podrijetla: učinkovitost identifikacije, genetička učinkovitost, praznina u barkodiranju i analiza NJ stabla. Regija psbA-trnH podržana je kao pogodan DNA barkod za razlikovanje C. deserticola i C. tubulosa.

Zaključno, najprije smo uspostavili novu molekularnu ikemijskianaliza-kombinirana metoda za razlikovanje i kontrolu kvalitete u dva izvoraCistanchesHerba. DNK barkodiranje može razlikovati dva porijeklagenetskivarijaciju i autentifikaciju vrsta univerzalno i točno; UPLC-QTOF/MS tehnologija može analizirati kemijski sastav kako bi se brzo i točno procijenila kvaliteta medicinskih materijala. Kombinirana metoda DNA barkodiranja i UPLC-QTOF/MS tehnologije jamče točniju i znanstveniju identifikaciju višestrukih izvora medicinskih materijala i mogu poslužiti kao metoda za identifikaciju drugih zbunjujućih vrsta ili rodova u klasifikaciji.

Izjava o financiranju

Studija je podržana potporama Nacionalne zaklade za prirodne znanosti Kine (br. 81274013, web stranica: www.nsfc.gov.cn). Financijeri nisu imali nikakvu ulogu u dizajnu studije, prikupljanju podataka i analizi, odluci o objavljivanju ili pripremi rukopisa.

Reference

1. Tu PF, Lou ZC, Li SC, Wang CS, Jiang WY, et al. (1996) Usporedba hranjenja bubrega i jačanja janga učinkovitosti tri različite vrste biljakaudaljenosti. Časopis kineskih medicinskih materijala 19: 420–421. [Google znalac]

2. Zhang Y, Wu H, Wang SN, Zheng HC (1994.) Usporedba funkcija hranjenja bubrega i jačanja janga tri različite vrste herba cistanches. China Journal of Chinese Materia Medica 19: 169–171. [PubMed] [Google Scholar]

3. Lei L, Song ZH, Tu PF (2003) Napredak u istraživanjukemijskisastojci u biljkama odCistancheHoffing. et Link. Kineski tradicionalni i biljni lijekovi 34: 473–476. [Google znalac]

4. Yoshikawa M, Matsuda H, Morikawa T, Xie H, Nakamura S, et al. (2006) Feniletanoidni oligoglikozidi i acilirani oligosećeri s vazorelaksantnim djelovanjem iz Cistanche tubulosa. Bioorg Med Chem 14: 7468-7475. [PubMed] [Google Scholar]

5. Shimoda H, Tanaka J, Takahara Y, Takemoto K, Shan SJ, et al. (2009) Hipokolesterolemijski učinci ekstrakta Cistanche tubulosa, kineskog tradicionalnog sirovog lijeka, u miševa. Am J Chin Med 37: 1125–1138. [PubMed] [Google Scholar]

6. Yamada P, Iijima R, Han J, Shigemori H, Yokota S, et al. (2010) Inhibicijski učinak akteozida izoliranog izCistanchetubuloza nakemijskiotpuštanje medijatora i stvaranje upalnih citokina stanicama RBL-2H3 i KU812. Planta Med, 1512–1518. [PubMed]

7. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Matsuda H, et al. (2010) Acilirani feniletanoidni oliglikozidi s hepatoprotektivnim djelovanjem iz pustinjske biljkeCistanchetubuloza. Bioorg Med Chem 18: 1882–1890. [PubMed] [Google Scholar]

8. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Yuan D, et al. (2010) Iridoidni i aciklički monoterpenski glikozidi, kankanozidi L, M, N, O i P iz Cistanche tubulosa. Chem Pharm Bull (Tokio) 58: 1403–1407. [PubMed] [Google Scholar]

9. He YP, Yin ZZ, Tu PF, Lou ZC (1997) Identifikacija i pregled komercijalne sirove droge herba cistanchis. Časopis kineskih medicinskih materijala 20: 117–122. [PubMed] [Google Scholar]

10. Zhu SY (2001) Farmakognostička identifikacija Cistanche tubulosa zbunjujuće vrsteCistanchedeserticola. Časopis kineskih medicinskih materijala 24: 24–25. [PubMed] [Google Scholar]

11. Xu XQ, Ni H, Wei HY, Jia XG, Zhang BG, et al. (2013) Mikroskopska identifikacija tri herba cistanches u Xin Jiangu. Shizhen Medicine and Materia Research 24: 881–883. [Google znalac]

12. Zhang M, Fu XL, Wang SY (2004) Mikroskopska identifikacija komercijalnih Herba Cistanches tehnikom digitalnog snimanja. Časopis kineskih medicinskih materijala 27: 400–402. [PubMed] [Google Scholar]

13. Li JS, Yao ZQ, Yu MX (2000) Studija o identifikaciji herbacistančei preljubnici. Shizhen Medicine and Materia Research 11: 317–318. [Google znalac]

14. Xu R, Sun SQ, Liu YG, Chen J, Liu TN, et al. (2010.) FTIR i 2D-IR spektroskopske studije na različitim izvorima herbacistanče. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi 30: 897–900. [PubMed] [Google Scholar]

15. Chen J, Sun SQ, Xu R, Liu YG, Yu J, et al. (2009) Identifikacija Cistanche deserticola iz Boschniakla rossica i Cynomorium songaricum pomoću FTIR i dvodimenzionalne korelacijske IR spektroskopije. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi 29: 1502–1507. [PubMed] [Google Scholar]

16. Yang HC, Xia PX, Huang JX, Yuan HZ (2008.) Studija o HPLC otisku prstaCistanchedeserticola. Pharm Care & Res 8: 255–257. [Google znalac]

17. Xie JN, Zhao MB, Wu FW, Tu PF (2005) Kromatografski otisak Cistanche deserticola pomoću HPLC-a. Kineski tradicionalni i biljni lijekovi 36: 268–271. [Google znalac]

18. Han JP, Song JY, Liu C, Chen J, Qian J, et al. (2010) IdentifikacijaCistanchevrsta (Orobanchaceae) na temelju sekvenci intergenske regije plastida psbA-trnH. Acta Pharmaceutica Sinica 45: 126–130. [PubMed] [Google Scholar]

19. Shi HM, Wang J, Wang MY, Tu PF, Li XB (2009) Identifikacija vrsta Cistanche poKemijskii Inter-simple Sequence Repeat Fingerprinting. Biol. Pharm. Bik. 32: 142–146. [PubMed] [Google Scholar]

20. Han LF, Yiadom MB, Liu EW, Zhang Y, Li W, et al. (2012) Strukturna karakterizacija i identifikacija feniletanoidnih glikozida izCistanchesdeserticola YC Ma pomoću UHPLC/ESI-QTOF-MS/MS. Fitokemijska analiza 23: 668–676. [PubMed] [Google Scholar]

21. Jiang X, Huang LF, Wu LB, Wang ZH, Chen SL (2012) UPLC-QTOF/MS analiza alkaloida u tradicionalno prerađenom Coptis Chinensis Franch. Evid Based Complement Alternat Med 2012: 942384. [PMC besplatan članak] [PubMed] [Google Scholar]

22. Wu LB, Jiang X, Huang LF, Chen SL (2013.) Ispitivanje tehnologije obrade lista mušmula (Eriobotrya japonica) tekućinskom kromatografijom ultraučinkovitosti – kvadrupolna vremenski proletna spektrometrija mase u kombinaciji s kemometrijom. PLoS ONE 8: e64178. [PMC besplatan članak] [PubMed] [Google Scholar]

23. Hebert PD, Ratnasingham S, Waard JR (2003) Barkodiranje životinjskog svijeta: divergencija podjedinice 1 citokrom c oksidaze među blisko srodnim vrstama. Proc. R. Soc. Lond. B. 270 Suppl 1S96–99. [PMC besplatan članak] [PubMed] [Google Scholar]

24. Hebert PD, Cywinska A, Ball SL, Waard JR (2003) Biološke identifikacije putem DNK barkodova. Proc Biol Sci., 270 313: 321. [PMC besplatan članak] [PubMed] [Google Scholar]

25. Kress WJ, Wurdack KJ, Zimmer EA, Weigt LA, Janzen DH (2005.) Upotreba DNK barkodova za identifikaciju cvjetnica. Proc Natl Acad Sci. 102: 8369-8374. [PMC besplatan članak] [PubMed] [Google Scholar]

26. Chen S, Yao H, Han J, Liu C, Song J, et al. (2010.) Validacija ITS2 regije kao novog DNK barkoda za identifikaciju ljekovitih biljnih vrsta. PLoS One 5: e8613. [PMC besplatan članak] [PubMed] [Google Scholar]

27. Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, et al. (2011) MEGA5: Molecular EvolutionaryGenetikaAnaliza korištenjem metoda maksimalne vjerojatnosti, evolucijske udaljenosti i metode maksimalne štedljivosti. Mol Biol Evol 28: 2731-2739. [PMC besplatan članak] [PubMed] [Google Scholar]

28. Meyer CP, Paulay G (2005) DNK barkodiranje: stope pogrešaka temeljene na sveobuhvatnom uzorkovanju. PLoS Biol 3: e422. [PMC besplatan članak] [PubMed] [Google Scholar]

29. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1984) Studije o sastojcima Cistanchis Herba. IV. Izolacija i strukture dvaju novih fenilpropanoidnih glikozida, cistanozida C i D. Chem Pharm Bull 32: 3880–3885. [Google znalac]

30. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1985) Studije o sastojcima Cistanchis Herba. VI. Izolacija i strukture novog iridoidnog glikozida, 6-Deoxyeatalpol. Chem Pharm Bull 33: 3645-3650. [Google znalac]

31. Jiang Y, Li SP, Wang YT, Chen XJ, Tu PF (2009) Diferencijacija HerbaCistanchesotiskom prsta s tekućinskom kromatografijom visoke učinkovitosti–detekcijom niza dioda–spektrometrijom mase. Journal of Chromatography A 1216: 2156–2162. [PubMed] [Google Scholar]

32. Han LF, Boakye YM, Liu E, Zhang Y, Li W, et al. (2012) Strukturna karakterizacija i identifikacija feniletanoidnih glikozida iz Cistanches deserticola YC Ma pomoću UHPLC/ESI–QTOF–MS/MS. Phytochem Anal 23: 668–676. [PubMed] [Google Scholar]

33. Li L, Tsao R, Yang R, Liu CM, Young JC, et al. (2008) Izolacija i pročišćavanje feniletanoidnih glikozida iz Cistanche deserticola brzom protustrujnom kromatografijom. Kemija hrane 108: 702–710. [PubMed] [Google Scholar]

34. Lu DY, Zhang JY, Yang ZY, Liu HM, Li S, et al. (2013) Kvantitativna analizaCistanchesHerba koristi tekućinsku kromatografiju visoke učinkovitosti u kombinaciji s detekcijom niza dioda i masenom spektrometrijom visoke rezolucije u kombinaciji s kemometrijskim metodama. J Sep Sci 26: 1945–1952. [PubMed] [Google Scholar]

35. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1985) Studije o sastojcima Cistanchis Herba. V. Izolacija i strukture dvaju novih fenilpropanoidnih glikozida, cistanozida E i F. Chem Pharm Bull 33: 1452–1457. [Google znalac]

36. Jiang Y, Tu PF (2009.) Analizakemijskisastavni dijelovi vrste Cistanche. J Chromatogr A 1216: 1970–1979. [PubMed] [Google Scholar]

37. Masssart DL, Vandeginste BGM, Deming SN, Michotte Y, Kaufman L (1988) Rukovanje podacima u znanosti i tehnologiji. Kemometrija: udžbenik.

38. Huang LF, Zheng SH, Wu LB, Jiang X, Chen SL (2014.) EkotipoviCistanchedeserticola na temeljukemijskisastav i molekularna svojstva. SCIENTIA SINICA Vitae 44: 318–328. [Google znalac]

39. Tu PF, Jiang Y, Guo YH (2011.) istraživanje i industrijski razvoj herba cistanches. Journal of Chinese pharmaceutical 46: 882–887. [Google znalac]

40. Kobayashi H, Oguchi H, Takizawa, Miyase T, Ueno A, et al. (1987) Novi feniletanoidni glikozidi izCistanchetubulosa (SCHRENK) Kuka. f. I. Chem Pharm Bull 35: 3309–3314. [Google znalac]

41. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1984) Studije o sastojcima Cistanchis herba III. Chem Pharm Bull 32: 3009–3014. [Google znalac]

42. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1984) Studije o sastojcima Cistanchis herba IV. Chem Pharm Bull 32: 3880–3885. [Google znalac]

43. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1985) Studije o sastojcima Cistanchis herba VI. Chem Pharm Bull 33: 3645-3650. [Google znalac]

44. Moriya A, Tu PF, Karasawa D, Arima H, Deyama T, et al. (1995) Farmakognostičke studije Cistanchis Herba (I). Nat Med 49: 383–393. [Google znalac]

45. Moriya A, Tu PF, Karasawa D, Arima H, Deyama T, et al. (1995) Farmakognostičke studije Cistanchis Herba (II). Nat Med 49: 394–400. [Google znalac]

46. ​​Liu XM, Jiang Y, Sun YQ, Xu XW, Tu PF (2011.) Studija okemijskisastavnice odCistanchedeserticola. Chin Pharm J 46: 1053-1058. [Google znalac]

47. Gu XY, Wang X (2013) Identifikacija između izvornih biljaka RouCongRong i zbunjenih sorti. Western Journal of Traditional Chinese Medicine 26: 17–18. [Google znalac]

48. Zhang HJ, Ding XF Identifikacija Cistanche deserticola i štetočina. Shizhen Medicine and Materia Research, 183.

49. Xu XQ, Ni H, Wei HY, Jia XG, Zhang BG, et al. (2013.) istraživanje mikroskopske identifikacije triju vrsta Cistanche koje potječu iz pokrajine Xinjiang. Shizhen Medicine and Materia Research 24: 881–883. [Google znalac]

50. Huang M, Liu G (2004) Identifikacijsko istraživanjeCistanchedeserticola i Cynomorium songaricum. HuBei časopis tradicionalne kineske medicine. 26: 54–55. [Google znalac]

51. Liu YG, Xu R, Wang W, Liu TN, Chen J (2009) Napredak istraživanja kontrole kvalitete i procjene Cistanche deserticola YC Ma. Svjetska znanost i tehnologija - Modernizacija tradicionalne kineske medicine. 11: 439–444. [Google znalac]

52. Ma ZG (2011) Diferencijacija obrađenih Cistanche Sinensis G.Beck i Herba Cistanches HPLC otiscima. Brada. Pharm J. 46: 899-902. [Google znalac]

53. Huang LX, Wang YE, Shi MH, Jia XG, Xie X, et al. (2011.) HPLC istraživanje otisaka prstijuCistanchetubuloza. Xinjiang časopis tradicionalne kineske medicine. 29: 54–56. [Google znalac]

54. Chen P, Guo YH, Wang BM, Zhai ZX (2006) SDS-PAGE topivih proteina u četiri biljke Cistanche Hoffing. Et Link. Kineski tradicionalni i biljni lijekovi 37: 1399–1402. [Google znalac]

55. Xu R, Chen J, Chen SL, Liu TN, Na R (2007) AFLP analiza o raznolikosti resursa germplazme u kultiviranoj i divljoj Cistanche deserticola. Kineski tradicionalni i biljni lijekovi 38: 1703–1707. [Google znalac]

56. Gan XY, Li M, Ma HA, Song YX (2011.) Studija o intraspecifičnim varijacijamaCistanchedeserticola YCMa koristeći AFLP molekularne markere. Sjeverna hortikultura, 141–143.

Članci iz PLoS ONE dostupni su ovdje zahvaljujući Public Library of Science

PLoS jedan. 2014.; 9(5): e98061.

Objavljeno online 22. svibnja 2014. doi: 10.1371/journal.pone.0098061

PMCID: PMC4031141

PMID: 24854031