Ekstrakt staničnih kultura Oenothera Biennis s djelovanjem protiv starenja kože poboljšava mehanička svojstva stanica

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

Sažetak:Starenje kože vrlo je dobro poznat proces koji postavlja postupno pogoršanje mehaničkih svojstava kože zbog smanjenja proizvodnje strojeva izvanstaničnog matriksa i istodobne promjene u procesu kontrakcije. Kako bi se usporilo ovo napredovanje, ključno je inducirati ekspresiju nekoliko proteina koji mogu potaknuti stvaranje elastičnih vlakana i popravak tkiva. Ovdje je vodeni ekstrakt stanične kulture Oenothera bi-Ennis ispitan s kemijskog gledišta, a zatim je testiran in vitro, u stanici i u ex vivo eksperimentima kao adjuvans u suzbijanju starenja kože. Sukladno tome, pokazalo je da je ekstrakt Oenothera biennis bio u stanju, povećanjem ekspresije gena MYLK, pospješiti kontrakciju kolagena matriksa, polimerizaciju aktina i proizvodnju esencijalnih ECM proteina.

Ključne riječi:metabolomika; molekularne mreže; hidrofilni ekstrakt kultura stanica Oenothera biennis; kontrakcija kolagena matriksa; starenje kože

1. Uvod

Starenje kože vrlo je dobro poznat proces uzrokovan endogenim i egzogenim čimbenicima. Tijekom starenja, sve kožne fiziološke funkcije neumitno degeneriraju, a to progresivno pogoršanje oštećuje kožu [1]. Doista, koža postupno gubi svoja mehanička svojstva, zahvaljujući smanjenju proizvodnje proteina izvanstaničnog matriksa i istodobnoj promjeni u procesu kontrakcije [2]. Najvažnije komponente izvanstaničnog matriksa dermisa su proteini kao što su kolagen I i IIl, laminin, periostin, tenascin, elastin, fibronektin i proteoglikani, jer njihova relativna količina i stanje savijanja igraju ključnu ulogu u interakciji između stanica i matrica, koja jamči pravilnu teksturu dermisa [3]. Na primjer, u izvanstaničnom prostoru, fibronektin igra ključnu ulogu u sastavljanju matriksa jer tvori most između receptora stanične površine (npr. integrina) i kolagena, proteoglikana i drugih fokalnih adhezijskih molekula. Laminini doprinose strukturi izvanstaničnog matriksa i moduliraju adheziju, diferencijaciju, migraciju, stabilnost fenotipa i otpornost prema apoptozi. Elastin je također važan za staničnu adheziju i staničnu migraciju te ima sposobnost sudjelovanja u staničnoj signalizaciji. Fibrilini na sličan način blisko djeluju s tropoelastinom i integrinima, a važni su za sastavljanje elastina u elastična vlakna. Fabulous je čvrsto povezan s bazalnim membranama, elastičnim vlaknima i drugim komponentama izvanstaničnog matriksa te sudjeluje u formiranju elastičnih vlakana. Tenascini su polimorfni glikoproteini izvanstaničnog matriksa (ECM) koji posreduju u fibroznim procesima kako bi se omogućio učinkoviti popravak tkiva [4] Osim toga, proces kontrakcije kože također se temelji na djelovanju fibroblasta, najzastupljenijih stanica u dermalnom matriksu; oni uspostavljaju odgovarajuću napetost kože, potičući kontakte između komponenti matriksa, koje su zauzvrat odgovorne za kompaktnost, gustoću i otpornost dermisa. U osnovi njihove stanične organizacije citoskeleta nalazi se aktin-miozinski mehanizam koji određuje moguće promjene u njihovom obliku i strukturi. Doista, vezanje aktina i miozina potiče kompaktniju staničnu konformaciju, približavajući vlakna, jamčeći razvoj zdravog i kompaktnog tkiva i sprječavajući raspadanje vlakana što rezultira borama. Međutim, sposobnost fibroblasta da se kontrahiraju i rastežu djelomično se gubi tijekom godina jer ostarjele stanice više nisu u stanju djelovati ispravno i potpuno. Zbog manje mehaničke sile, fibroblasti imaju zaobljeniju i iskrivljeniju morfologiju od izdužene [5]. Neki dokazi pokazuju da je tijekom starenja sinteza proteina zvanog MYLK (kinaza lakog lanca miozina) značajno smanjena. MYLK posjeduje kinaznu aktivnost koja se vrši fosforilacijom specifične miozinske domene, nazvane miozin regulatorni laki lanac, sposobna inducirati vezanje aktina i stoga pospješiti kontraktilnost stanice [6].bioflavonoidiKada je otkrivena niska aktivnost ovog proteina, zbog, na primjer, manje ekspresije proteina, izmjereno je odgovarajuće smanjenje kontrakcije kolagena matriksa [7] i polimerizacije aktina [8]. Sastavljanje aktinskog citoskeleta povezano je ne samo s kretanjem stanica i sposobnošću kontrakcije, već i s proizvodnjom proteina ECM matriksa putem aktivacije TGF-II receptora (TGFBRII)[9]. TGFBRII pripada TGF-staničnom površinskom receptorskom kompleksu koji, putem aktivacije Smad transkripcijskih faktora, regulira ekspresiju mnogih gena koji kodiraju komponente ECM-a, uključujući kolagen, laminine, fibronektin i proteoglikan [10]. Rastavljanje aktinskog citoskeleta smanjuje TGF-Il receptor. Ova regulacija, zauzvrat, smanjuje proizvodnju kolagena i drugih ECM proteina, što rezultira gubitkom dermalne mase i krhkosti kože.

Zapravo, mnogi kozmetički sastojci imaju za cilj potaknuti sintezu nekoliko ključnih čimbenika odgovornih za održavanje pravilne kompaktnosti dermalnog matriksa i dobre kontrakcije kože. U ovom scenariju, ekstrakti dobiveni iz vrste Oenothera biennis (večernji jaglac), koja pripada obitelji Onagraceae, od velikog su interesa zbog sadržaja bioaktivnih spojeva kao što su masne kiseline, fenoli, triterpeni i flavonoidi, koji su već istraženi. ispitan u liječenju različitih kožnih patoloških bolesti [11]. Neki od tih metabolita, zauzvrat, suzbijaju medijatore upale kao što su interleukin 1 (IL-1), interleukin 6 (IL-6), citokini i faktor nekroze tumora (TNF-)[12 ]. Štoviše, ekstrakti nadzemnih dijelova Oenothera biennis štitili su HaCaT stanice od oštećenja DNK izazvanog H, O i stanične smrti blokiranjem staničnih oštećenja uslijed oksidativnog stresa kroz mehanizam koji uključuje eliminaciju ROS-a i signalni put Nrf2/HO-1 [ 13]. Nadalje, ulje Oenothera biennis, koje je bogato lipidima, predloženo je kao dobar hidratant za pacijente s ekcemom zahvaljujući svojoj sposobnosti da lako prodire u kožu [14]. Nažalost, pripravci ekstrakta kultiviranih biljaka, koji se koriste u kozmetici, mogu imati neke nedostatke: prvo, mogu biti kontaminirani otrovnim ili alergenskim tvarima kao što su pesticidi, gnojiva ili zagađivači; tada su biljke podložne nepredvidivom stresu i sezonskim uvjetima ili varijacijama u dostupnosti hranjivih tvari, što može potaknuti sintezu neočekivanih metabolita. Dodatno, ekstrakti mogu sadržavati patogene mikroorganizme koji smanjuju kvalitetu gotovih proizvoda. Svi ovi nedostaci, zauzvrat, konvergiraju u rizik postojanja promjenjivog sadržaja sekundarnih metabolita i niske ponovljivosti. Kako bi se prevladale te slabosti, uporaba kultura biljnih stanica u kozmetici postaje sve popularnija i vrlo cijenjena, budući da prevladava mnoge od gore navedenih nedostataka [15].

Kliknite ovdje da saznate više

U ovoj studiji, hidrofilni ekstrakt staničnih kultura Oenothera biennis (ObHEx) u potpunosti je karakteriziran naprednim pristupima koji se temelje na spektrometriji mase, potpomognuti bioinformatikom, te testiran u više biokemijskih i bioloških testova. Mješavina sadrži bioaktivne spojeve uglavnom lignana i triterpena, kao što su arjunolna i azijska kiselina, koji su prethodno bili povezani s proizvodnjom pro-kolagena I u ljudskim fibroblastima [16,17]. Istraživana je sposobnost ekstrakta da poveća ekspresiju MYLK, pospješuje kontrakciju kolagena matriksa, polimerizaciju aktina i proizvodnju TGF-reguliranih ECM proteina, koji pogoduju kontrakciji dermisa, čime se usporava starenje kože.

2. Rezultati

2.1. Kvalitativna i kvantitativna analiza ekstrakta topljivog u vodi stanične kulture Oenothera Biennis

Provedena je UPLC-MS/MS analiza ObHExa, a spektrometrijski podaci visoke rezolucije iskorišteni su za kemijsku karakterizaciju korištenjem Globalne društvene molekularne mreže prirodnih proizvoda (GNPS), sustava masene spektrometrije temeljene na webu koji pomaže u identifikaciji i označavanju prirodnih proizvoda (NPS)[18]. Cilj mu je biti baza znanja s otvorenim pristupom za organizacije u cijeloj zajednici i za dijeljenje neobrađenih, obrađenih ili označenih podataka fragmentacijske masene spektrometrije (MS/MS). Konkretno, obavljena su pretraživanja GNPS spektralne biblioteke i zadatak molekularnog umrežavanja temeljenog na karakteristikama (FBMN): prva analiza nam je omogućila identificiranje prirodnih spojeva, uspoređujući njihove MS/MS spektre s onima strukturno karakteriziranih metabolita, druga s grupno povezanim NP-ovi unutar mreže budući da su strukturno slične molekule pokazivale slične obrasce MS/MS fragmentacije [19]. Kao što je prikazano na slici 1 i tablici 1, mnogi NPS su nedvojbeno identificirani kao pripadnici nekoliko klasa sekundarnih metabolita, uglavnom lignana (Salvador i liriodendron) i triterpena (murijatična kiselina, ariunolna kiselina, azijska kiselina i hederagenin). Kemijske vrste koje GNPS nije identificirao dodijeljene su u skladu s literaturom.

Kao primjer upotrebe GNPS-a, mreža izvedena iz FBMN analize prikazana je na slici 2a, pokazujući da ObHEx sadrži mnogo drugih nekarakteriziranih triterpena povezanih s murijatnom kiselinom (18, m/z 503,3389, RT 21,89 min: identifikacija solatne kiseline je potvrđeno usporedbom s njegovim analitičkim standardom). Na primjer, razne prethodno neokarakterizirane vrste na m/z 701 i 665 identificirane su kao glikozilirani oblici povezani s murijatnom kiselinom ili njezinim izomerima, odnosno hidratirani ili ne s dvije molekule HO

Nadalje, prijavljeni ioni na m/z 729, 703, 699,687,685, 683 izvedeni redom iz glikozilacije plus dvije molekule H, O vrsta na m/z531, 505,501, 489,487 i 485: njihova jednoznačna identifikacija nije postignuta, ali svi bi oni trebali biti triterpeni, budući da su povezani s murijatnom kiselinom ili njezinim kongenerima, zbog svog puta fragmentacije MSMS-a. Nedavno su mnogi triterpeni s m/ 501 i 485 izolirani iz druge vrste Oenothera, Oenothera Maritima, a njihova struktura je razjašnjen je na temelju spektroskopskih podataka, stoga dobro korelirajući s našim rezultatima [20].

Cistanche može spriječiti starenje

FBMN analiza također je pružila informacije o metabolitima na m/z 617,3862 (MS2 ioni na m/z 453, 145 i 119) prisutnima u molekularnim mrežama prikazanim na slici 2b i koji nisu navedeni u literaturi za vrste Oenothera. Ova m/z vrijednost i njezina fragmentacija odgovaraju 2-OEp-kumaroilnoj kiselini ili njezinim izomerima, dokazujući barem prisutnost triterpen kumaroilnih i kafeoilnih estera u ekstraktu. Doista, MS-spektri vrsta na m/z 649 (RT 25,72 i 27,19) pokazali su prisutnost iona na m/z 179, 161 i 135 zbog cijepanja ostatka kavene kiseline, dok su MS2 spektri drugih vrsta prikazano na slici 2b na m/z 633 (RT 26,88, 27,20, 28,12 i 28,43), 649 (RT 24,18, 24,65, 24,83) i 661 (RT 30,28) pokazalo je ione na m/z 145 i 119, koji su bili karakteristični za kumaroilni dio.

After, the content of some identified lignans and triterpenes was determined. Ouantifi-cation methods were validated as reported in Table2. All calibration curves showed good linearity (R>0.9911) unutar testiranih raspona. Štoviše, granica detekcije (LOD) i granica kvantifikacije (LOO) pokazuju da se korištene metode odlikuju visokom osjetljivošću. Dobiveni rezultati kvantitativne analize (tablica 3) pokazali su da su liriodendron i hederagenin glavni zastupljeni lignani triterpeni, redom.

2.3. Analiza ekspresije gena MYLK u HDF

Aktivnost ObHEx testirana je u HDF-u na ekspresiju gena MYLK, koji kodira za kinazu odgovornu za fosforilaciju lakog lanca miozina (Slika 3a). Rezultati su pokazali da je tretman s ekstraktom u obje koncentracije povećao ekspresiju MYLK gena za oko 50 posto, slično pozitivnoj kontroli TGF-.

2.4. Analiza kapaciteta kontrakcije kolagenske matrice

Kako bismo procijenili aktivnost ObHExa na kontraktilnu sposobnost kolagenih vlakana, upotrijebili smo HDF raspršen u kolagenskim gel diskovima [21]. Kao što je prikazano na slici 3b, ekstrakt je u nižoj koncentraciji izazvao značajno povećanje kontrakcije kolagenskog diska, što ukazuje na potencijalni učinak na čvrstoću kolagena. Liječenje s ML7(1-(5-jodonaftalen-1-sulfonil)-1H-heksahidro-1,4-diazepinom), inhibitorom MYLK, ukinuo je ovo povećanje, što ukazuje da i ekstrakt i TGF- djeluju preko MYLK-a na kontrakciju kolagenskog diska.

2.5. Mjera razine polimerizacije aktina

Sposobnost ObHExa da stimulira polimerizaciju aktina ispitivana je mjerenjem razine polimeriziranog aktina u stanicama, tretiranim ekstraktom i pozitivnom kontrolom TGF-, samim i u prisutnosti ML7. Kao što je prikazano na slici 3c, tretman s obje koncentracije ekstrakata doveo je do povećanja količine polimernog aktina za oko 50 posto, u usporedbi s 33 posto TGF-a.kupiti cistancheOpet, predinkubacija s ML7com-u potpunosti je ukinula ovaj učinak, što ukazuje na uključenost MYLK-a u polimerizaciju aktinskih filamenata.

2.6. Analiza TGF RII/SMAD putanje u HDF-u

Kako bismo provjerili je li povećanje polimerizacije aktina i kontrakcije kolagena stanica tretiranih ObHExom također povezano s aktivacijom puta prijenosa signala posredovanog TGF RII, prvo smo promatrali ekspresiju gena TGF RII, a zatim transficirali HDF sa SMAD{{ 0}}luciferazni reporterski plazmid i procijenili povećanje aktivnosti luciferaze kao odgovor na tretman ObHExom. Rezultati prikazani na slici 3d,e pokazuju da je tretman s ObHEx na 0.002 posto i 0,006 posto povećao ekspresiju TGF RII na način sličan TGF-u koji se koristi kao pozitivna kontrola i, paralelno, aktivnost luciferaze povezana sa SMAD je povećana za 80 odnosno 40 posto. Postignuto je značajno smanjenje signala kada su stanice tretirane s ML7, što također pokazuje da je ova aktivnost povezana s MYLK.

2.7. Analiza pro-kolagena I, tropoelastina i periostina

Kao posljedicu aktivacije transdukcije signala TGF RII, analizirali smo sintezu glavnih proteina izvanstaničnog matriksa kao što su prokolagen tipa I, tropoelastin i periostin u HDF-u tretiranom s ObHEx na 0.002 posto. Kao što je prikazano na slici 3f, ObHEx je povećao proizvodnju navedenih proteina za oko 98 posto, 75 posto, odnosno 51 posto, slično pozitivnoj kontroli TGF-. Mjerenja su provedena ELISA testom, korištenjem specifičnih protutijela protiv pro-kolagena I, tropoelastina i periostina.

2.8. Analiza MYLK, fosfo-miozina, kolagena I i tropoelastina na eksplantatima kože Ex-Vivo

Kao što je prikazano na slici 4a-c, ObHEx je proizveo značajno povećanje proizvodnje MYLK i fosforiliranog miozina u eksplantatima ljudske kože.

Indukcija kolagena I i tropoelastina također je analizirana u kožnim eksplantatima prethodno tretiranim ObHExom, a zatim tretiranim hidrokortizonom tijekom 8 dana kako bi se simuliralo kronološko starenje [22]. Tretman hidrokortizonom smanjio je količinu kolagena I i tropoelastina za više od 100 posto, a prisutnost 0,002 posto ObHExa obnovila je količinu tropoelastina za gotovo 91 posto i kolagena za 120 posto, u usporedbi s askorbat korišten kao pozitivna kontrola (Slika 4d-f). Ovo sugerira potencijalni učinak ObHExa protiv starenja, posebno učinkovit u povećanju čvrstoće kože djelovanjem na komponente dermalnog matriksa.

2.9. Mikroskopija atomske sile (AFM) u eksplantatima kože

Kako bismo prikupili više informacija o biomehaničkim svojstvima kože koje potiče tretman ObHExom, procijenili smo elastičnost, intrinzično mehaničko svojstvo uzoraka kože u smislu njihovih Youngovih modula [23]. Kao što je opisano u odjeljku 4, za izračun modula elastičnosti, i na tretiranim i na netretiranim uzorcima kože, prikupili smo krivulje sile s mikroskopom atomske sile (AFM) i uskladili ih s Hertzovim modelom [24,25]. Kao što je prikazano na slici 5, tretman uzoraka kože ekstraktom imao je niže vrijednosti Youngovog modula u usporedbi s netretiranim uzorcima, što ukazuje na poboljšanje elastičnih svojstava kože. Konkretno, netretirani uzorci kože otkrili su srednju vrijednost Youngovog modula od 0.37±0.15 GPa, dok su uzorci kože tretirani s ObHEx pokazali nižu srednju vrijednost od 0.{{11 }}7±0,02 GPA. Vrijednosti Youngovog modula uzoraka kože bile su u skladu s literaturom [26-28].

3. Rasprava

Kulture biljnih stanica predstavljaju pristup koji najviše obećava za održivu proizvodnju biljnih sekundarnih metabolita od komercijalnog interesa, nudeći kontinuiranu opskrbu materijalom putem kulture velikih razmjera i čineći održiv i ekološki prihvatljiv sustav [29,30]. Ekstrakti iz kultura biljnih stanica pronašli su obećavajuće primjene u sektoru zdravstva i kozmetike, budući da predstavljaju neke značajne prednosti; (i) sadrže metabolite biosintetizirane u laboratorijskim uvjetima kontroliranog rasta; (i) potječu iz standardiziranih proizvodnih procesa, jamčeći iste kvalitativne i kvantitativne karakteristike dobivenih vrsta; (ii) ekstrakti su bez kontaminanata kao što su mikroorganizmi, herbicidi, pesticidi i fungicidi; (iv) neovisni su o geografskim ili ekološkim fluktuacijama i biljne vrste mogu se sačuvati za budućnost generacije. U ovom natjecanju ispitivan je vodeni ekstrakt stanične kulture Oenothera biennis (ObHEx) kao obećavajući izvor bioaktivnih molekula koje djeluju protiv starenja kože. Doista, ObHEx je istražen UPLC-MSMS analizama visoke rezolucije u kombinaciji s bioinformatičkim pristupima kako bi se postigla široka strukturna karakterizacija. Karakterizacija spojeva ostvarena je uglavnom korištenjem GNPS-a za ubrzavanje procesa identifikacije, usporedbu MS/MS spektra sa onima strukturno karakteriziranih metabolita i, nadalje, otkrivanje novih neočekivanih vrsta, grupiranje sličnih NP-ova unutar mreže. Štoviše, vrijeme zadržavanja, točna mjerenja mase i MS2 analize također su uspoređeni s onima standarda, a svi su podaci usklađeni s literaturom. Identificirani su bioaktivni lignani i triterpeni, kao što su Salvador aside, liriodendron, my-anthemic acid, arjunolic acid, Asiatic acid i hederagenin. Liriodendron [31] i murijatska kiselina [32] pokazali su snažno antioksidativno djelovanje, dok je hederagenin pokazao svojstva protiv starenja kože zbog smanjenja stanične oksidacije i aktivacije funkcije proteasoma [33]. Međutim, smatra se da su arjunolna i azijska kiselina uglavnom odgovorne za neke od sljedećih testiranih aktivnosti, budući da stimuliraju sintezu kolagena I. Doista, dokazano je da je ObHEx poboljšao biomehanička svojstva kože, koja uglavnom ovise o relativnoj količini različitih komponenti ECM-a i o tome kako su fibroblasti sposobni kontrahirati i pružiti pravu napetost dermalnim vlaknima.cistanchZapravo, ObHEx potiče kontrakciju kolagenskog matriksa i polimerizaciju aktina povećanjem ekspresije MYLK gena, pojačavajući snagu kontrakcije dermalnih fibroblasta. Sklapanje aktinskog citoskeleta pojačava TGF-receptor tipa II i, u skladu sa stimulacijom TGF-/Smad signalizacije, povećava razine TGF-reguliranih ECM proteina. Doista, ObHEx potiče proizvodnju kolagena tipa I, periostina i tropoelastina. Stoga ga sva ova svojstva čine dobrim obećavajućim sastojkom kandidatom za upotrebu u kozmetičkim formulacijama za borbu protiv gubitka čvrstoće i elastičnosti kože uzrokovanog starenjem. Ovu su pretpostavku poduprli rezultati dobiveni u AFM analizi, koji su pokazali da je tretman presjeka kože s ObHExom proizveo poboljšanje mehaničkih svojstava kože, otkriveno kao smanjenje Youngovog modula, što ukazuje na značajno smanjenje krutosti i krutosti kože.

4. Materijali i metode

4.1. Kulture biljnih tkiva i priprema ekstrakta

Biljke Oenothera biennis osigurao je GEEL Floricultura ss i bile su talijanskog porijekla (izbjegavajući primjenu Nagoya protokola). Stanične kulture dobivene su iz listova biljke Oenothera biennis induciranjem proliferacije meristematskih stanica na čvrstim agar pločama do dobivanja kalusa. Stanice su prenesene u tekući medij za rast (Gamborg B5, nadopunjen s 24 diklorofenoksioctene kiseline (1 mg/L), adeninom (1 mg/L) i kinetinom (0.01 mg/L)). Zatim , stanice su uzgajane kao suspenzijske kulture uz orbitalno mućkanje. Nakon što su dobivene kulture od oko 150 g/L, stanice su sakupljene i lizirane u fosfatnom puferu (PBS) na pH 7,4 kako bi se pripremio ekstrakt topiv u vodi, koji je liofiliziran. Prašak je otopljen u vodi ili mediju stanične kulture u odgovarajućim koncentracijama za ispitivanje.

4.2. UPLC-MSMS analiza za kemijsku karakterizaciju

ObHEx(5{{10}} mg/mL) je pripremljen i podvrgnut bifaznoj ekstrakciji butanol/voda. Frakcija butanola je osušena i otopljena u metanolu (10mg/mL) prije UPLC-MS/MS analize. Provedeno je na Q-Exactive Classic masenom spektrometru tvrtke Thermo-Scientific (Waltham, MA, SAD) opremljenom Thermo ScientificTM UltiMateTM 3000 UPLC sustavom. Sve kromatografske serije izvedene su korištenjem kolone Phenomenex Luna③C18 100 A （150×2,0 mm, veličina čestica 3 µm） pri 40 stupnjeva C i brzini protoka od 0,200 mL/min. Volumen injekcije bio je 5 μL. Mobilna faza sastojala se od A (voda iz ROMIL Ltd, Convent Drive, Waterbeach, Cambridge, UK s 0,1 posto octene kiseline) i B (100 posto acetonitrila iz ROMIL Ltd, Convent Drive, Waterbeach, Cambridge, UK) korištenjem gradijentnog eluiranja od 5 posto B na0-5min, 5-14 posto B na5-8 min,14-32 posto B na 8-11 min, 32-95 posto Bat {{ 26}}min,95-98 posto Bat32-33 min,98 posto B na 33-38min,98-5 posto Bat38-39 min, i 5 posto B na { {34}} min. Sve MS i MSMS analize provedene su u ESI negativnom načinu rada s brzinom protoka plina omotača na 30 (proizvoljne jedinice), brzinom protoka pomoćnog plina na 5 (proizvoljne jedinice), naponom raspršivanja na 3,2 kV, i kapilarnom temperaturom i temperatura pomoćnog plinskog grijača na 300 stupnjeva. Podaci su prikupljeni s Full MS/dd-MS2 (Top5) modom. Potpune MS postavke bile su: razlučivost 70.000, AGC cilj 1×106, maksimalni IT od 200 ms, a može se kretati od 100 do 800 m/z.dd-MS2 postavke su bile: razlučivost 17.500, AGC cilj 2×105, maksimum IT od 65 ms, izolacijski prozor od 1,5 m/z i NCE od 35.

dobiveni su ručno provjereni. mzXML podaci obrađeni su pomoću Mzmine 2.53 prije posla Molekularnog umrežavanja temeljenog na značajkama (FBMN) na GNPS-u. Korak detekcije mase izveden je pomoću centroidnog detektora mase uz održavanje razine šuma na 5 × 1{{10}}3. Izgradnja kromatograma Automated Data Analysis Pipeline (ADAP) ostvarena je sa sljedećim postavkama: minimalna veličina grupe u broju skeniranja od 5, prag intenziteta grupe od 5 × 1{{20}}³, minimalni najveći intenzitet od 5× 10 plus ,m/z tolerancija od 0.01 m/z ili 10 ppm. Dekonvolucija kromatograma postignuta je korištenjem valića (ADAP) kao algoritma, S/N prag od 3, minimalna visina značajke od 1 × 105, koeficijent/površinski prag od 5, raspon trajanja vrha od 0.{{ 18}}.00 min, i RT talasni raspon od 0.00-0.05. Kromatogrami su deizotopirani korištenjem izotopskog peaks grouper algoritma s m/z tolerancijom od 0,001 m/z ili 5,0 ppm i RT tolerancijom od 0,10 min. FBMN posao je izveden korištenjem tolerancije roditeljske mase od 0,02 Da i tolerancije MS4 fragmenta iona od 0,02 Da. Rubovi su filtrirani kako bi imali prag rezultata od 0,7 i najmanje 2 podudarna vrha. Štoviše, najveći broj susjednih čvorova za svaki čvor postavljen je na 10.

4.4. Kvantitativna analiza lignana i triterpena

Isti UPLC uvjeti navedeni za kvalitativnu analizu korišteni su za kvantitativnu analizu lignana, dok su za triterpene optimizirani kako bi se odvojila dva para izomera, arjunolna i azijska kiselina. Analiza je provedena na Q-Exactive Classic masenom spektrometru kao što je prethodno opisano. Odvajanje je provedeno Phenomenex Kinetex⑧EVO C18 300 A（150×2,1 mm, veličina čestica 5 μm）. Mobilna faza sastojala se od A(5 mM vodene otopine amonijevog acetata, pH 9.00 prilagođen amonijevim hidroksidom) i B(100 posto acetonitrila) korištenjem gradijentnog eluiranja 17-28 postotak B na 0-18 min, 28-65 posto B na 18-22 min, 65-75 posto B na 22-26min, 75-95 posto na {{17 }}, 5 min, 95 posto na 26,5-30 min, 95-17 posto na 30-30,1 min, 17 posto na 30,1-42 min. Brzina protoka je bila 0,450 mL/min, a volumen injekcije je bio 5 uL. I za lignane i za triterpene, podaci su prikupljeni s Full MS-SIM i PRM modom. Potpune postavke MS-SIM-a bile su: razlučivost od 70.000, cilj AGC od 3×106, maksimalni IT od 200 ms, a može se kretati od 200 do 800 m/z za lignane i od 400 do 850 m/z za triterpene. PRM postavke bile su: razlučivost od 70.000, AGC cilj od 2×10 stupnjeva, maksimalni IT od 100 ms, izolacijski prozor od 1,0 m/z i NCE od 35 u slučaju lignana i 50 u tom od triterpena.cistanche AustralijaKupili smo Salvador (#{{0}}XS172930) od Biosynth Carbosynth (Staad, St. Gallen, Švicarska), liriodendron (#SMB00181) i arjunolnu kiselinu (#SMB00119) od Sigme -Aldrich (St. Louis, MO, SAD), azijska kiselina (#0027) od Extrasynthese (Genay, Lyon, Francuska) i hederagenin (#89706) od PhytoLab GmbH & Co.KG (Vestenbergsgreuth, Bayern-Mittelfranken, Njemačka). Mirijanska kiselina bila je dar prof. Marije Valerie D'Auria sa Sveučilišta u Napulju. Kalibracijske krivulje dobivene su ubrizgavanjem standardnih otopina u rasponu koncentracija od 0.25-25 μM za lignane i 0.1-25 uM za triterpene. I čisti Salvador i liriodendron pokazali su dva LC-MSMS vrha, vjerojatno zbog kemijske ravnoteže uspostavljene u otopini. Granica detekcije (LOD) i granica kvantifikacije (LOO) za standarde određene su na temelju omjera signal/šum (S/N).

4.5. Kulture stanica kože i eksplantati

Ljudski dermalni fibroblasti (HDF) održavani su u Dulbeccovom modificiranom Eagle mediju (DMEM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) dopunjenom s 10 posto fetalnog goveđeg seruma (FBS; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD )u 95 posto zraka, 5 posto CO, i ovlaženoj atmosferi na 37 stupnjeva. Kožni eksplantati, dobiveni iz kože zdravih donorica (starih 44-47) u kirurškom centru Villa Cinzia (Napulj, Italija), uzgajani su u 24-transwell pločama u DMEM/FBS plus antibiotici u zraku tekući uvjeti na 37 stupnjeva u 5 posto CO2 ovlaženom zraku. Svi darivatelji dali su pismeni informirani pristanak za korištenje kožnih tkiva, prema Helsinškoj deklaraciji.

4.6. Test citotoksičnosti

Ispitivanja citotoksičnosti temeljila su se na upotrebi MTT spoja [{{0}}(45-dimetil tiazolil)-2,5-difeniltetrazolij-bromid][34]. Stanice su uzgajane u 96-pločicama s jažicama u mediju kulture DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), dopunjenom s 10 posto fetalnog goveđeg seruma, otprilike 8 h. Nakon tretmana s ObHEx između 0.05 posto i 0,0004 posto (500 ug/mL i 4 ug/mL) tijekom 48 sati, stanice su isprane u PBS-u i inkubirane sa 100 μL/jažici "reakcijski pufer" koji sadrži∶ 10 mMof Hepes, 1,3 mM CaCl2, 1 mM MgSO, 5 mM glukoze i 0,5 mg/mL MTT kolorimetrijskog supstrata u puferu PBS na pH 7,4. Nakon 3 sata inkubacije na 37 stupnjeva C u 5 posto CO, 100 μL solubilizirajućih otopina koje sadrže 10 posto Triton-X100, 0,1 N HCl u apsolutnom izopropanolu dodano je u svaku jažicu. Nakon 16 sati inkubacije, kolorimetrijska reakcija je izmjerena na 595 nm čitačem ploča Victor3 (PerkinElmer, Waltham, MA, SAD).

4.7. Analiza ekspresije gena MYLK i TGF6RII u HDF-u

Po jažici, 1×10 stupanj HDF-a uzgajan je u 6-pločama s jažicama u DMEM na 2 posto FBS, nakon 24 h FBS je dodatno razrijeđen na 0.5 posto, a stanice su tretirane s 0.002 posto i 0,006 posto koncentracije ObHEx i TGF- 2.5ng/mL, nakon čega je uslijedila inkubacija od 2 sata za MYLK i 48 za TGFRII. Za ekstrakciju RNA korišten je komplet "GenEluteM Total RNA Purification" koji je kupila tvrtka Merck (Darmstadt, Njemačka). Nakon navedenih tretmana, stanice su isprane s PBS-om, sakupljene u puferu za lizu i podvrgnute postupku ekstrakcije kako je navedeno. Uzorci su tretirani DNazom I (Ambion, Austin, TX, SAD) na 37 stupnjeva tijekom 30 minuta kako bi se uklonio kontaminant genomske DNA. Iz svakog uzorka, 2 μL je naneseno na gel 1 posto agaroze u prisutnosti denaturirajuće boje za punjenje u svrhu kvantiziranja količine RNA u odnosu na specifični marker za RNA (ThermoScientific, Waltham, MA, SAD). GeneTools (PerkinElmer, Waltham, MA, SAD) korišten je kao softver za kvantizaciju. Zatim je 300 ng ukupne RNA retro-transkribirano pomoću enzima reverzne transkriptaze (ThermoScientific, Waltham, MA, SAD). Semi-kvantitativni RT-PCR je proveden koristeći kao interne standarde par univerzalnih primera 18S primer/kompetitor (Ambion, Austin, TX, USA). PCR produkti su odvojeni na 1,5 postotnom agaroznom gelu, pregledani pomoću alata Reliance (PerkinElmer, Waltham, MA, SAD) i analizirani denzitometrijom pomoću softvera Genetools. Slijedovi početnica korištenih za amplificiranje bili su sljedeći: MYLK FW: ATCAAACTGTCAAGTTCAG, MYLK Rv: AGGCACTGCGTGCAGTCCA, TGFBR2 FW: GTCACTGACAACAACGGT, TGFBR2 RV: ATGTCAGAGCGGTCATCT.

4.8. Analiza kapaciteta kontrakcije kolagenske matrice

Što se tiče HDF stanica, 20× 10 stupanj resuspendirane su u 5x DMEM mediju za rast (Gibco, Waltham, MA, SAD) u 24-ploči s jažicama i 2 mg/ mL otopine kolagena iz goveđe kože (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) dodano je u svaku jažicu. pH otopine je podešen na 7,2. Ploča je inkubirana na 37 stupnjeva C tijekom 45 minuta kako bi se omogućilo skrućivanje kolagenskog gela. DMEM dopunjen s 10 posto FBS i/ili ML7 25 uM, kao inhibitor MYLKproteina, dodan je kasnije. Nakon 16 h, ML7 je očišćen i dodan je ObHExat koncentracije od 0,002 posto u DMEM s 2 posto FBS. TGF- 2.5 ng/mL korišten je kao pozitivna kontrola. Stvoreni disk kolagena odmah je odvojen od jažice korištenjem sterilne mikro spatule kako bi se pospješila njegova kontrakcija. Područja diska svakog tretmana izmjerena su u vremenu 0 i 5 h i analizirana pomoću softvera Image.

4.9. Analiza stupnja polimerizacije aktina

Zatim je 1,5×10 stupanj HDF stanica po jažici uzgojeno u 24-ploči s jažicom i sljedeći dan je mediju dodan 2 posto FBS i citohalazin B, koji je inhibitor aktina polimerizacija, na 2 μM tijekom 3{{1{{20}}}} min. Nakon 30 minuta, na stanicama je dodan ObHEx（0,002 posto i 0,006 posto ） zajedno s TGF- 2.5 ng/mL, korištenim kao pozitivna kontrola, i ML7 25μM, kao negativna kontrola MYLKenzima. Nakon 30 minuta tretmana, stanice su fiksirane s 4 posto paraformaldehida (PFA) u pufer fosfatu 30 minuta na ledu. Stanice su isprane s PBS-om i permeabilizirane s otopinom fosfatnog pufera i Triton-X100 na 0,2 posto tijekom 30 minuta. Nakon toga, stanice su inkubirane s otopinom od 0,4 μM faloidina konjugiranog s rodaminom (Santa-Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) 1 sat u mraku.cistanche koristiU vremenu 0 i nakon 18 sati, fluorescencija je izmjerena na 540/570 nm upotrebom Victor3 čitača ploča (PerkinElmer, Waltham, MA, SAD). 4.10. Analiza SMAD2 puta

HDF stanice su nasađene u gustoći od 3 × 103 u 96-ploče s jažicama i nakon 16 h su transficirane korištenjem X-tremeGeneTM HP DNA transfekcijskog reagensa (Roche Diagnostics, Basel, Švicarska) sa Smad2 reporter vektorom prema uputama proizvođača. Nakon 24 sata, stanice su tretirane s ObHEx ili TGF- 2.5 ng/mL, samim ili u kombinaciji s ML7 25 μM tijekom 24 sata. Na kraju inkubacije, stanice su isprane s PBS-om i aktivnost luciferaze je određena korištenjem SteadyGlo sustava za ispitivanje luciferaze (Promega Corporation, Madison, WI, SAD) u Multiwell Plate Reader Victor Nivo (PerkinElmer, Waltham, MA , SAD).

4.11. Analiza sinteze pro-kolagena I, tropoelastina i periostina

Po jažici, 8× 103 HDF je uzgajano u 96-pločama jažica i tretirano sa 0.002 posto ObHEx ili TGF 2,5 ng/mL. Nakon 24 sata, stanice su obrađene za ELISA pomoću monoklonskog primarnog antitijela protiv prokolagena tipa I (sc-166572, Santa-Cruz Biotechnology, Dallas, TX, SAD), nakon čega je uslijedila inkubacija sa sekundarnim anti-mišjim antitijelom označenim s peroksidazom (170-6516, Biorad, Hercules, CA, SAD). Supernatanti stanica obloženi su na drugu ploču za detekciju tropoelastina i periostina korištenjem anti-tropoelastinskog zečjeg antitijela (ab21600, Abcam, Cambridge, U ili anti-periostinskog mišjeg antitijela (sc-398631, Santa-Cruz Biotechnology) , Dallas, TX, SAD), nakon čega je uslijedila inkubacija sa sekundarnim protutijelima protiv kunića obilježenim peroksidazom (170-6515, Biorad, Hercules, CA, SAD). Kolorimetrijska reakcija razvijena je dodavanjem 100 μL vodene otopine OPD (O-fenilendiamin), 0,35 mg/mL u 50 mM citratnom puferu i 0,012 posto vodikovog peroksida (H2O2). Nakon 30 minuta, apsorbancija je izmjerena na 490 nm pomoću višestrukog čitača Victor Nivo (PerkinElmer, Waltham, MA, SAD).

4.12. Ex vivo testovi

Imunohistofluorescencija (IHF) MYLK-a i fosforiliranog miozina procijenjena je u eksplantatima kože {{0}}-godišnjih donora. Eksplantati ljudske kože izrezani su kiretama za biopsiju od 8 mm i uzgajani u 24-pločama s jažicama u DMEM s 10 posto FBS-a i antibioticima. Dobiveni udarci tretirani su s 0.002 posto i 0,006 posto ObHEx-a tijekom 24 sata. Inkubirane su u 15-postotnoj saharozi, zatim u 30-postotnoj saharozi i na kraju zamrznute. Zatim su dobivene sekcije od 10 μm pomoću kriostata CM1520 (Leica Microsystems, Wetzlar, Njemačka). Stakalca s kriosekcijama su hidratizirana 30 minuta u PBS-u i stavljena u "blokirajuću" otopinu (6 posto BSA, 5 posto seruma, 20 mM MgCl, 0,2 posto Tween) na 1 sat. Kriosekcije su inkubirane s primarnim anti-MYLK zečjim antitijelima (1:100, GeneTex, Irvine, CA, SAD) i primarnim antitijelima protiv fosfo-miozina (1:100, LifeTechnologies, Carlsbad, CA, SAD) 16 sati na 4 stupanj. Stakalca su isprana s PBS-om 30 minuta i zatim inkubirana sa sekundarnim anti-zečjim Alexa-Fluor 546 antitijelom (1:1000; A11035 ThermoFisher, Waltham, MA, SAD) 1 sat. Jezgre su obojene DAPI(4',6-5 diamidino-2-fenilindolom)1 ug/mL u PBS-u tijekom 10 minuta. Slike su dobivene fluorescentnim mikroskopom i analizirane softverom ImageJ. Za IHF tropoelastina i kolagena I korišteni su eksplantati kože 36--godišnjih donorica. Biopsije kože dobivene su kako je gore opisano i prethodno tretirane s 0,002 posto i 0,006 posto ObHEx-a tijekom 24 sata. Dodan je stres s hidrokortizonom od 10 ug/mL tijekom 8 dana u prisutnosti ObHEx. Nakon toga, biopsije su zamrznute kao što je gore opisano, a rezovi su inkubirani s primarnim protutijelima anti-tropoelastin zečji (1:1000 ab21600, Abcam, Cambridge, UK) i anti-kolagen I (1:100 C2456 Merck, Darmstadt, Njemačka) za 16h na 4 stupnja. Slajdovi su analizirani kako je gore opisano, a slike su dobivene i analizirane softverom ImageJ.

4.13. Mikroskopija atomske sile (AFM) u eksplantatima kože

Elastičnost uzoraka kože netretiranih i tretiranih ObHExom procijenjena je osiguravajući njihove Youngove module metodom u nanometrijskoj skali koja se temelji na mikroskopiji atomske sile (AFM), razvijenoj ne samo za biološke uzorke već i za anorganske. Ovi se pristupi temelje na pretpostavkama Hertzovih modela i razmatraju uzorak i konzolu kao dvije opruge u nizu u postavkama AFM eksperimenta. Ukratko, uzorci kože bivše biljke tretirani s 0.006 posto ObHEx i netretirane kože izrezani su kriostatom na kriške debljine 10 um. Uzorci su pohranjeni na 12 stupnjeva, zatim isprani s PBS-om i ispitani na fiksnoj temperaturi i relativnoj vlažnosti od 22 stupnja odnosno 55 posto. Svaki uzorak ispitan je NanoScope IIA AFM u jednom modu spektroskopije sile pomoću piramidalnog vrha (RESP-20) s konstantom opruge od 0,9 N/m. Za izračun Youngovog modula dobiveno je deset krivulja sile u deset različitih točaka iste površine uzorka. Svaka krivulja sile je krivulja otklona (Volt) u odnosu na pomak (nm) i može se pretvoriti u krivulje sile (N) u odnosu na odvajanje (nm). Zapravo, svaka krivulja sile prikazuje krivulje utovara i istovara. Oni predstavljaju trend vrha u odnosu na uzorak: kada je vrh daleko od uzorka, kada dođu u kontakt i vrh počinje skrenuti, a kada se ponovno odmiče. Može se istražiti samo prvi dio ovih krivulja. Svaki od ovih dijelova krivulje prilagođen je standardnom Hertzovom modelu, posebno tipičnoj Hertzevoj jednadžbi za vrh piramide, kako bi se izdvojio modul elastičnosti poznat kao Youngov modul u GPa.

4.14. Statistička analiza

Sve navedene vrijednosti bile su prosjek tri neovisna eksperimenta, od kojih je svaki izveden u tri primjerka. Zvjezdice označavaju statističku značajnost izračunatu u skladu s t-testom: *srednja vrijednost manja ili jednaka 0.05;** p vrijednost manja ili jednaka 0. 01;***p vrijednost Manje od ili jednako 0,001.

Ovaj je članak izvađen iz Metabolites 2021, 11, 527. https://doi.org/10.3390/metabo11080527 https://www.mdpi.com/journal/metabolites