Transkripcijska dinamika rekonsolidacije pamćenja i recidiva specifična za alkohol, 4. dio

Uz Arc, otkrili smo da su razine mRNA Egr1, ali ne i Bdnf, povećane u DH i mPFC dohvaćanjem sjećanja na alkohol.

Kako vrijeme prolazi, ljudi postupno stječu novo razumijevanje misterija zaborava. U tom procesu, nova tehnologija za pronalaženje memorije postupno je postala žarište istraživanja.

Dakle, postoji li veza između obnavljanja sjećanja na alkohol i performansi pamćenja? Dođite odmah pogledati! Prije svega, moramo biti jasni: vraćanje sjećanja na alkohol nije zasebna tehnologija. To je tehnologija koja putem alkohola utječe na moždane neurone. Ovaj proces može aktivirati neka "uspavana" sjećanja u mozgu, omogućujući nam da osvježimo ta sjećanja.

Drugo, moramo znati da nam poboljšanje pamćenja ne omogućuje samo da se "sjećamo" više stvari, već je to proces vraćanja i rekonstruiranja sjećanja na različite načine. Ovaj proces nam može pomoći da bolje konsolidiramo i razumijemo znanje koje smo naučili, čime poboljšavamo svoje pamćenje.

Stoga možemo zaključiti da postoji odnos između vraćanja sjećanja na alkohol i performansi pamćenja. Kada koristimo ovu tehnologiju za ponovno izdvajanje prethodnih sjećanja nakon pijenja alkohola, prolazimo kroz proces ponovne konsolidacije tih sjećanja, čime se do određene mjere poboljšava naše pamćenje.

Naravno, također moramo napomenuti da alkoholno vraćanje sjećanja nije dugotrajna i pouzdana tehnika za poboljšanje pamćenja. Ako želimo imati izvrsno pamćenje dugo vremena, potrebno je kontinuirano jačati i poboljšavati svoje pamćenje kroz svakodnevno učenje i život, u kombinaciji s drugim tehnikama vježbanja pamćenja.

U tom procesu, moramo zadržati optimističan stav u svakom trenutku, kako bismo bolje stimulirali svoju motivaciju za učenje i potencijal pamćenja. Stoga, aktivno se suočimo s vježbanjem pamćenja, budimo nepokolebljivi svoji i hrabro naprijed na putu stalnog poboljšanja pamćenja! Vidi se da moramo poboljšati pamćenje, a Cistanche deserticola može značajno poboljšati pamćenje, jer Cistanche deserticola također može regulirati ravnotežu neurotransmitera, poput povećanja razine acetilkolina i faktora rasta. Ove tvari su vrlo važne za pamćenje i učenje. Osim toga, meso također može poboljšati protok krvi i pospješiti opskrbu kisikom, što može osigurati da mozak dobije dovoljno hranjivih tvari i energije, čime se poboljšava vitalnost i izdržljivost mozga.

Kliknite sada za poboljšanje kratkoročnog pamćenja

Povećana ekspresija mRNA Egr1 prethodno je bila uključena u rekonsolidaciju sjećanja na strah i droge [19, 21, 48, 61], povećavajući mogućnost da ovaj faktor transkripcije također igra ulogu u rekonsolidaciji sjećanja na alkohol.

Dok je uloga Bdnf-a u rekonsolidaciji pamćenja i dalje kontroverzna [19, 49], poznato je da je indukcija Bdnf-a ključna za stjecanje pamćenja i učenje o gašenju [19, 62]. Prema tome, nedostatak promjene u ekspresiji Bdnf u našoj studiji mogao bi sugerirati da naš postupak vraćanja pamćenja nije pokrenuo učenje izumiranja usporedno s vraćanjem pamćenja.

Štoviše, nedavno smo izvijestili da, iako se razine mRNA Bdnf-a u DH-u ne povećavaju samim povlačenjem sjećanja na alkohol, ekspresija faktora rasta je bila povišena kada je nakon vraćanja uslijedilo averzivno protuuvjetovanje koje je spriječilo povratak [44], što ukazuje na složenu ulogu Bdnf-a. u dinamici pamćenja alkohola.

Naša otkrića pokazuju da povećanje ekspresije IEG-a nije jedinstveno za rekonsolidaciju sjećanja povezanih s alkoholom.

Doista, ARC i EGR1 su prethodno bili uključeni u konsolidaciju nekoliko vrsta sjećanja, uključujući sjećanja na strah [19, 46, 47, 62], sjećanja na prepoznavanje [21] i sjećanja povezana s različitim drogama [20, 22, 61].

Međutim, također postoji sve više dokaza da se neki od mehanizama koji leže u pozadini traženja alkohola mogu razlikovati od onih koji kontroliraju prirodno traženje nagrade [5, 27, 28, 63]. Također, postoje dokazi da se sjećanja za različite nagrade (a posebno za različite lijekove) različito obrađuju [29-32]. Nalazi naše RNAseq analize doista su otkrili jedinstveni transkriptomski potpis induciran vraćanjem sjećanja na alkohol.

Točnije, pronašli smo 44 gena u DH i drugačiji skup od 9 gena u njimaPFC, koji su pokazali značajne promjene nakon pronalaženja sjećanja na alkohol. Nakon daljnje provjere podataka, usredotočili smo se na jedan gen u mPFC (Fkbp5) i tri gena u DH (Adcy8, Scl8a3 i Neto1) i otkrili da na njihovu ekspresiju nije utjecalo pronalaženje sjećanja povezanih sa saharozom.

Ovo sugerira da, za razliku od Arc i Egr1, ova 4 specifična gena vjerojatno ne igraju općenite uloge u obradi sjećanja na nagradu, već mogu igrati selektivne uloge u obradi sjećanja na alkohol.

Zanimljivo je da su ova četiri gena ranije bila povezana s poremećajem konzumiranja alkohola te učenjem i pamćenjem. Stoga Fkbp5 kodira FK506 vezni protein 5, regulator stresnog neuroendokrinog sustava [64].

Varijante FKBP5 moduliraju težinu sindroma ustezanja od alkohola [65] i predviđaju sklonost prekomjernom pijenju kod ljudi [66-68]. Pokazalo se da brisanje Fkbp5 povećava težinu apstinencije od alkohola [65] i pijenje alkohola [67] kod miševa, dok je farmakološka inhibicija proteina smanjila umjerenu konzumaciju alkohola i ponovnu uspostavu CPP-a kod miševa [69] i smanjila konzumaciju alkohola kod muških štakora pod stresom [70].

Razine Adcy8 mRNA, koja kodira adenilateciklazu 8 (AC8) koja katalizira stvaranje cAMP-a kao odgovor na priljev kalcija i nedavno označena kao mogući regulator unosa alkohola [28, 71], smanjene su u krvnim stanicama dugotrajnih apstinentnih alkoholičara [72].

Prethodno se pokazalo da delecija Adcy8 smanjuje konzumaciju alkohola i povećava osjetljivost na sedativne učinke alkohola kod miševa [73]. Osim toga, kronična izloženost alkoholu u štakora povećala je ekspresiju u mozgu obitelji nosača otopljene tvari 8 (izmjenjivač natrij/kalcij), član 3 (NCX3), proteina kodiranog sa Scl8a3 [74, 75].

Konzumacija alkohola kod štakora također je bila povezana sa smanjenom ekspresijom Neto1[76] u moždanom deblu, koji kodira neuropilin tolloid-like 1 (NRP1), komponentu NMDA-receptorskog kompleksa [77].

Ovaj protein je uključen u sinaptičku reorganizaciju i prijenos u hipokampusu [78] i potreban je za prostorno učenje i pamćenje [77].

Dakle, naša otkrića pokazuju da puko vraćanje sjećanja na alkohol, čak i bez ikakvih farmakoloških učinaka alkohola, utječe na ekspresiju ovih gena. Međutim, njihovu specifičnu ulogu u rekonsolidaciji sjećanja na alkohol i recidivu tek treba ispitati.

Ograničenje ove studije je to što je RNA-seq analiza provedena na masovnim mPFC i DH tkivima, a ne na pojedinačnim stanicama aktiviranim vraćanjem memorije. Konkretno, nedavne studije sugeriraju da su sjećanja općenito [79, 80], a posebno sjećanja povezana s alkoholom [32, 81, 82], kodirana putem aktivacije neuronskih ansambala koji se sastoje od malog broja neurona, koji se mogu identificirati putem neuronaaktivacijskih markera ( npr. cFOS) [80].

Doista, slični obrasci aktivacije IEG (cFOS) vraćanjem operantno uvjetovanih sjećanja na alkohol i slatke nagrade pronađeni su u mPFC i dodatnim mezolimbičkim regijama u mozgu štakora [32, 81]. Stoga je moguće da bi selektivno provođenje RNA-seq testa na lećama neurona aktiviranim vraćanjem sjećanja dalo točnije rezultate.

Ukratko, naša otkrića sugeriraju da pronalaženje sjećanja na alkohol potiče dva paralelna programa transkripcije. Jedan program, koji se prenosi putem zajedničkih molekularnih mehanizama učenja i pamćenja, uključujući IEGs Arc i Egr1, angažiran je u konsolidaciji sjećanja, općenito.

Drugi transkripcijski program, pokrenut vraćanjem sjećanja na alkohol, kontroliraju geni koji posebno promiču ponašanje povezano s alkoholom. Ovaj model dvostruke obrade za alkoholna sjećanja otvara mogućnost da rekonsolidacija sjećanja za različita sjećanja može imati slične molekularne mehanizme dualne obrade, s nekim komponentama koje dijele višestruka sjećanja, a druge jedinstvene za svaku vrstu sjećanja.

Ovaj hipotetski model tek treba procijeniti testiranjem utječe li manipuliranje ovim genima različito na rekonsolidaciju sjećanja na alkohol i saharozu. Ako je tako, to bi sugeriralo da bi moglo biti moguće ciljati na specifične molekularne ciljeve za nagrađivanje za liječenje poremećaja povezanih s patogenim sjećanjima, kao što je ovisnost, radije nego poremetiti glavne molekularne mehanizme bitne za mnoge funkcije izvan rekonsolidacije sjećanja na alkohol.

MATERIJALI I METODE

Pogledajte dodatne informacije za detalje o aparatu, lijekovima i reagensima, dizajnu i pripremi oligodeoksinukleotida (ODN), westernblot i qRT-PCR analizama i pripremi biblioteke RNA-seq.

Životinje

Muški i ženski C57BL/JRccHsd miševi (25-30 g), smješteni 3-4 po kavezu, uzgajani su u Sveučilišnoj ustanovi za životinje u Tel Avivu (Izrael) i držani u ciklusu svjetlo-tama od 12 sati (svjetla se pale u 7 ujutro), s hranom i vodom dostupnom adlibitum.

U eksperimentima koji su uključivali kondicioniranje saharoze na mjestu, pristup hrani bio je ograničen 6 sati prije treninga kako bi se potaknula motivacija miševa za skupljanje kuglica saharoze. Ovo kratko trajanje nedostatka hrane temelji se na nalazima da tijekom dana gladovanje od 2 do 6 sati ne utječe na ponašanje pri hranjenju [83] i ne izaziva značajan pomak u metaboličkim markerima [84], čime se minimiziraju učinci restrikcije hrane per se. .

Miševi su vagani dva puta tjedno kako bi se kontrolirao gubitak težine. Sve eksperimentalne protokole odobrio je i uskladio sa smjernicama Institucionalnog odbora za skrb i korištenje životinja Sveučilišta u Tel Avivu i smjernicama NIH-a (broj osiguranja dobrobiti životinja A5010-01). Uloženi su svi napori da se smanji broj korištenih životinja.

Postupci ponašanja

Kondicioniranje mjesta

Alkoholno uvjetovano preferirano mjesto (CPP): Svi miševi su naviknuti na dnevne ip injekcije fiziološke otopine tijekom 3 dana.

Osnovni test (1. dan): Prvog su dana klizna vrata bila uvučena i miševima je bilo dopušteno da slobodno istražuju cijeli aparat 30 minuta. Kondicioniranje mjesta alkoholom (2. – 9. dan): Obuka je započela 24 sata nakon osnovnog testa s jednom sesijom primijenjeno dnevno tijekom 8 dana, sa zatvorenim kliznim vratima. Dana 3, 5, 7 i 9, miševi su primili alkohol (1,8 g/kg, 20% v/v; ip) i odmah su zatvoreni u parni odjeljak na 5 minuta.

Prethodno se pokazalo da ova doza i trajanje kondicioniranja proizvode CPP izazvan alkoholom [42, 85]. Drugih dana (tj. dana 2, 4, 6 i 8), miševi su primili fiziološku otopinu i bili su zatvoreni u nespareni odjeljak na isto vrijeme kao i na dan kondicioniranja alkoholom.

Upareni odjeljci su uravnoteženi. Test preferencija mjesta 1 (dan 10): Testiranje preferencija mjesta bilo je kao što je opisano za osnovni test, a služilo je za indeksiranje alkohola-CPP [41]. Preferencija je definirana kao povećanje postotka vremena provedenog u odjeljku s parom alkohola tijekom testa preferiranja mjesta 1, u usporedbi s osnovnim testom.

Vraćanje pamćenja (11. dan): Prije ove faze, miševima su dodijeljeni različiti eksperimentalni uvjeti (usklađeni za CPP rezultate i spol). Tijekom sesije vraćanja sjećanja, miševi su bili zatvoreni u odjeljak s alkoholom na 3 minute, a zatim vraćeni u svoje kućne kaveze. Kontrolni miševi su kratko tretirani. Test preferencija mjesta 2 (dan 12): Miševi su podvrgnuti testu preferencija mjesta identičnom testu preferencija mjesta 1.

CPP za saharozu: prethodna obuka za saharozu (1. – 6. dan): 1. – 3. dana, miševi su naviknuti skupljati 5 – 6 kuglica saharoze (45 mg, PrecisionPellets bez prašine, Bio-Serv, Frenchtown, NJ, SAD) u kućnim kavezima . Dana 4-6, miševi su trenirani da skupljaju 3 kuglice u praznu kutiju od pleksiglasa tijekom 30-minutnih sesija. Miševi koji su prikupili manje od šest kuglica (od ukupno devet kuglica tijekom 3 dana) tijekom treninga saharozom bili su isključeni iz eksperimenta (2 miša od 32).

Osnovni test (dan 7): Sedmog dana, klizna vrata u CPP komori su uvučena i miševima je dopušteno da istražuju cijeli aparat 30 minuta. Ovdje je također usvojen nepristrani pristup aparatu/nepristranom dodjeljivanju, kako je opisano u proceduri alkohol-CPP. Kondicioniranje mjesta saharoze (dani 8-15): Obuka je započela 24 sata nakon osnovnog testa s jednom sesijom dnevno tijekom 8 dana, s kliznim vrata zatvorena. Dana 9, 11, 13 i 15, miševi su stavljeni u spareni odjeljak, a minutu kasnije, tri kuglice saharoze su rasute po podu.
Miševi su vraćeni u svoje kućne kaveze 15 minuta kasnije. Drugih dana (tj. dana 8, 10, 12 i 14), miševi su stavljeni u nespareni odjeljak na 15 minuta bez smetnji.

Upareni odjeljci su uravnoteženi. Test preferencija mjesta 1 (dan 16): Testiranje preferencija mjesta je kao što je opisano za osnovni test, i služio je za indeksiranje saharoze-CPP. Preferencija je definirana kao povećanje postotka vremena provedenog u odjeljku s parom saharoze tijekom testa preferiranja mjesta 1, u usporedbi s osnovnim testom. Vraćanje sjećanja (17. dana): Postupak vraćanja sjećanja na saharozu bio je identičan postupku vraćanja sjećanja na alkohol (vidi gore). ).

Validacija oligodeoksinukleotida (ODN).

Dizajn lučnog antisense ODN (AS-ODN) i kodiranog ODN (SCR-ODN) (Sigma-Aldrich, Rehovot, Izrael) slijedio je prethodno opisane smjernice [56, 86].

Funkcionalna validacija Arc AS-ODN. Arc AS-ODN (2 nmol/µl, 0.5 µl, 0.25 µl/min) ubrizgan je u DH u jednoj hemisferi, a SCR-ODN (2 nmol/µl, { {9}}.5 µl, 0.25 µl/min) uneseno je u drugu hemisferu (strane su bile u ravnoteži). Dva ili četiri sata kasnije, tretirani miševi istraživali su nepoznati kontekst (CPP odjeljak, vidi opis aparata, gore) tijekom 5 minuta kako bi inducirali ekspresiju ARC ovisnu o novosti. Miševi su eutanazirani sat vremena kasnije (tj. 3 ili 5 sati nakon infuzije ODN), tkivo mozga je sakupljeno, a razine proteina ARC procijenjene su Western blotanalizom (Slika S4).

Kirurški zahvat i intrahipokampalna mikroinfuzija Kirurški zahvat i mikroinfuzije provedeni su kako je prethodno opisano [42, 87].

Kirurgija. Stereotaksične operacije provedene su pod anestezijom izofluranom. Miševi su stavljeni u stereotaksički okvir (RWD Life Science, Shenzhen, Kina), a bilateralne kanile za vođenje (C235G-2.6, 26G; Plastics One Inc., Roanoke, VA, SAD) usmjerene su na DH na sljedeće koordinate (-2 mm posteriorno od bregme, ±1,3 mm mediolateralno, -1,45 mm ventralno od površine lubanje). Kanile su učvršćene dentalnim akrilom. Odgovarajuće lažne kanile (Plastics One Inc., Roanoke, VA, SAD) umetnute su u kanile za vođenje i na vrhu su postavljene čašice za prašinu kako bi mjesto ubrizgavanja bilo pokriveno i čisto od krhotina. Miševima je dopušteno da se oporave 7-10 dana prije treninga s alkoholom i CPP-om.

Intrahipokampalne infuzije. Aktinomicin D (4 µg/µl, 0.5 µl po strani, 0.25 µl/min, u DMSO) [19] ili ekvivalentni volumen vehikuluma bio je mikroinjektiran u DH odmah nakon vraćanja sjećanja . Pokazalo se da infuzija aktinomicina D u hipokampus u sličnoj koncentraciji remeti rekonsolidaciju pamćenja [19]. Arc AS-ODN ili kontrolni SCR-ODN (2 nmol/µl, 0.5 µl/strana, 0.25 µl/min; u PBS) mikroinjektiran je u DH 4 sata 2 h prije ili 4 h nakon vraćanja memorije.

Nakon uklanjanja čašice za prašinu i lažne kanile, mikroinfuzija je provedena tijekom 2 minute na budnim miševima koji su bili obuzdani, korištenjem injekcijske kanile (33 G; Plastics One Inc., Roanoke, VA, SAD) koja se proteže 0.5 mm izvan vodilice vrh kanile. Injekcijske kanile ostavljene su na mjestu dodatne 2 minute. Nakon infuzije, lažne kanile su umetnute u kanile vodilice, pričvršćene čašom za prašinu, a životinje su vraćene u svoje kaveze. Lokacije kanile provjerene su u kruničnim presjecima debljine 30 μm tkiva fiksiranog paraformaldehidom obojenim krezil ljubičastom.

Analiza podataka

Place preference was assessed as the percentage of time spent in the alcohol/sucrose-paired compartment, relative to the total test time. Mice that spent >75% vremena u bilo kojem od odjeljaka tijekom osnovnog testa bilo je isključeno iz studije (9 od 267). Uspostava CPP-a potvrđena je usporedbom CPP rezultata između osnovne vrijednosti i CPP testa 1 i analizirana je uparenim t-testom. Budući da je ekspresija CPP-a (tj. formiranje pamćenja) potrebna za vraćanje pamćenja, podaci iz miševa koji nisu pokazali CPP (najmanje 5% povećanja sklonosti između osnovne vrijednosti i Testa 1) isključeni su iz eksperimenta (48 od 258).

Alkohol-CPP nakon interferencije s rekonsolidacijom pamćenja analiziran je ANOVA-om mješovitog modela s faktorom liječenja između subjekata (aktinomicin D ili ODN) i faktorom testa unutar subjekata (CPP test 1, CPP test 2). Značajne interakcije analizirane su Student-Newman-Keulsovim post hoc testom. Gustoće Western blotimmunoreaktivnih ARC razina proteina normalizirane su na one GAPDH i analizirane jednosmjernom ANOVA-om s faktorom liječenja između subjekata, nakon čega je slijedio Dunnettov post hoc test. Podaci o ekspresiji qRT-PCR mRNA normalizirani su na Gapdh i izraženi kao postotak ekspresije kontrolne skupine.

Podaci iz svih gena za svaku regiju mozga analizirani su jednosmjernom ANOVA-om s faktorom liječenja između subjekata, nakon čega je slijedio Dunnettov test za svaki gen, radi usporedbe s podacima dobivenim iz kontrolne skupine (bez povrata). Za RNA-seq, prikupili smo tkiva od 3 životinje za svaki replikat i pripremili sljedeći broj replikata: 3 za dorzalni hipokampus(DH)-bez pronalaženja, 2 za DH-vađenje, 3 za prefrontalni korteks (PFC)-bez pronalaženja, i 2 za ( PFC)-dohvaćanje. Nakon potpune izolacije RNK s Trizolom, biblioteke sekvenciranja su generirane pomoću metode koju smo razvili [88].

Knjižnice su bile podvrgnute jednostranom sekvenciranju od 50 bp s IlluminaHiseq 2000. Nakon potvrde kvalitete podataka o sekvenciranju putem FastQC-a, očitanja su mapirana na referentni genom mm9 pomoću Bowtie2 [89] i označena s Tophat2 [90].

Čitanja mapirana na gene kvantificirana su pomoću značajki (FeatureCounts) [91]. Isključili smo Rn45s, Lars2, Rn4.5s, Cdk8, Zc3h7a i njihovitohondrijski kromosom kako bismo izbjegli prebrojavanje prekomjerno amplificiranih gena koji bi mogli iskriviti normalizaciju knjižnice kao što je prethodno opisano [92]. DESeq2 [58] korišten je za identifikaciju različito eksprimiranih gena (DEG) u grupi za pronalaženje, u usporedbi s kontrolnom grupom bez pronalaženja, s p-vrijednošću prilagođenom graničnoj značajnosti (p(adj) < 0.05).

DOSTUPNOST PODATAKA Podaci RNA-seq dostupni su na NCBI Gene Expression Omnibus na https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi (GSE205586) s tokenom recenzenta:knyfwwiorbutvuv.

REFERENCE

1. Collins PY, Patel V, Joestl SS, March D, Insel TR, Daar AS, et al. Veliki izazovi za globalno mentalno zdravlje. Priroda. 2011;475:27-30.

2. Heilig M, Egli M. Farmakološko liječenje ovisnosti o alkoholu: ciljni simptomi i ciljni mehanizmi. Pharmacol Therap. 2006;111:855-76.

3. Sinha R. Nova otkrića o biološkim čimbenicima koji predviđaju ranjivost na povratak ovisnosti. Curr Psychiatry Rep. 2011;13:398.

4. Litt MD, Cooney NL, Morse P. Reaktivnost na podražaje povezane s alkoholom u laboratoriju i na terenu: prediktori žudnje kod liječenih alkoholičara. Ovisnost.2000;95:889–900.

5. Barak S, Liu F, Ben Hamida S, Yowell QV, Neasta J, Kharazia V, et al. Poremećaj sjećanja povezanih s alkoholom inhibicijom mTORC1 sprječava povratak. Nat Neurosci.2013;16:1111–7.
6. Milton AL. Piće, droga i poremećaj: manipulacija pamćenjem za liječenje ovisnosti. Curr Opin Neurobiol. 2013;23:706-12.

7. Nader K, Hardt O. Jedinstveni standard za pamćenje: slučaj za rekonsolidaciju. NatRev Neurosci. 2009;10:224–34.

8. Dudai Y. Ponovna konsolidacija: prednost ponovnog fokusiranja. Curr Opin Neurobiol. 2006;16:174–8.

9. Przybyslawski J, Sara SJ. Ponovna konsolidacija sjećanja nakon njegove reaktivacije. Behav.Brain Res. 1997;84:241-6.

10. Nader K, Schafe GE, Le Doux JE. Sjećanja na strah zahtijevaju sintezu proteina u amigdali za rekonsolidaciju nakon preuzimanja. Priroda. 2000;406:722-6.

For more information:1950477648nn@gmail.com