Aktivnosti vođena izolacija fenolnih sastava iz stijenke Anneslea Fragrans. I njihov citoprotektivni učinak protiv oksidativnog stresa izazvanog vodikovim peroksidom u stanicama HepG2 1. dio

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

Sažetak: Anneslea fragrans Wall., commonly known as"Pangpo Tea", is traditionally used as folk medicine and healthy tea for the treatment of liver and intestine diseases. The aim of this study was to purify the antioxidative and cytoprotective polyphenols from A.fragrans leaves. After fractionation with polar and nonpolar organic solvents, the fractions of aqueous ethanol extract were evaluated for their total phenolic (TPC) and flavonoid contents(TFC) and antioxidant activities(DPPH, ABTS, and FRAPassays). The n-butanol fraction (BF)showed the highest TPC and TFC with the strongest antioxidant activity. The bio-guided chromatography of BF led to the purification of six flavonoids (1-6) and one benzoquinone lanthanoid (7). The structures of these compounds were determined by NMR and MS techniques. Compound 6 had the strongest antioxidant capacity, which was followed by 5 and 2. The protective effect of the isolated compounds on hydrogen peroxide (H2O2)-induced oxidative stress in HepG2 cells revealed that the compounds 5 and 6exhibited better protective effects by inhibiting ROS productions, having no significant difference with vitamin C(p>0.05), dok je 6 pokazalo najbolju aktivnost protiv apoptoze. Rezultati upućuju na to da bi A.fragrans mogao poslužiti kao vrijedan izvor fitokemijskih antioksidansa za razvoj funkcionalne hrane i zdravstvenih nutricionističkih proizvoda.

Ključne riječi:Anneslea fragrans; antioksidans; vođena izolacija; oksidativni stres; flavonoidni glikozidi

Kliknite ovdje da saznate više

1. Uvod

Reaktivne kisikove vrste (ROS) nastaju kao nusproizvodi kroz oksidativno disanje u normalnim fiziološkim i biokemijskim procesima [1]. Kao endogeni slobodni radikali, ROS igra važnu ulogu u staničnoj signalizaciji i održavanju postojanosti tijela u normalnom rasponu [2]. Ako se ROS ne može učinkovito očistiti, prekomjerni ROS može dovesti do pojave oksidativnog stresa, što može utjecati na staničnu proliferaciju i apoptozu [3]. Oksidativni stres usko je povezan s nizom bolesti uključujući dijabetes, hiperlipemiju, pretilost, rak te kardiovaskularne i neurodegenerativne bolesti [4]. Nedavno su mnoge studije dokazale da prehrana obogaćena antioksidansima ima niz korisnih učinaka zahvaljujući njihovoj sposobnosti čišćenja prekomjernog ROS-a [5,6].

Prirodni antioksidansi sadrže različite molekule kao što su polifenoli[], karotenoidi [8], vitamini [9], spojevi koji sadrže dušik [10] i kumarini [9]. Polifenoli su široko rasprostranjeni u biljnom carstvu i promiču zdravstvene dobrobiti zahvaljujući svojim antioksidativnim svojstvima [11]. Mnogi od njih, kao što su resveratrol i neki derivati ​​[12], antocijanidini [13, izoflavoni [14l, katehin [15l, i kvercetin [16]] dobro su poznati po svom zaštitnom učinku uklanjanjem ROS [1]. Posljednjih nekoliko godina polifenoli privlače pozornost u prevenciji raka [17], kardiovaskularnih disfunkcija [18], neurodegenerativnih bolesti [19] i starenja [20]. Stoga je potraga za učinkovitim antioksidansima hitna potreba za promicanje zdravlja ljudi.

Cistanche može poboljšati imunitet

Anneslea fragrans Zid. je zimzelena biljka, koja je uglavnom rasprostranjena na jugu Kine [21]. Osim svoje ukrasne svrhe, listovi A.fragrans također se koriste kao narodni lijek za liječenje groznice, zaštitu jetre, okrepljivanje želuca i crijeva Kina i Kambodža [22], što je zabilježeno u "Yunnan Simao Chinese Herbal Medicine" Osim toga, listovi su također obrađeni kao napitak od čaja, koji je poznat kao "Pangpo čaj". U prethodnim izvješćima [23], ekstrakt A.fragrans pokazao je antioksidativno i antimalarično djelovanje. Međutim, do danas nisu zabilježeni njegovi antioksidativni fenolni spojevi iz A. fragrances.

Stoga je svrha ovog istraživanja bila izolirati i identificirati antioksidativne spojeve iz lišća A. fragrans koji su odgovorni za njihovu tradicionalnu upotrebu za liječenje bolesti jetre. Četiri frakcije, frakcija diklorometana (DF), frakcija etil acetata (EAF), frakcija n-butanola (BF) i frakcija rezidualne vode (RWF) vodenog etanolnog ekstrakta procijenjeni su na njihov ukupni sadržaj fenola (TPC) i ukupnog flavonoida (TFC) i zbog njihovog antioksidativnog kapaciteta. Frakcija n-butanola (BF) imala je najviši TPC i TFC s najjačim antioksidativnim djelovanjem. Bio-vođeno frakcioniranje BF-a omogućilo je pročišćavanje spojeva. Nadalje, citoprotektivni učinak izoliranih spojeva proveden je na oksidativnom stresu izazvanom vodikovim peroksidom (H, O,) u HepG2 stanicama raka ljudske jetre. Intracelularna proizvodnja ROS-a i stanična apoptoza određeni su protočnom citometrijom. Stoga je ovo istraživanje omogućilo vrijedan antioksidativni fitokemijski sastojak za razvoj i korištenje lišća A.fragrans kao funkcionalnog dodatka (zdravi čaj) u prehrambenoj i zdravstvenoj industriji.

2. Rezultati i rasprava

2.1. Učinkovitost prinosa frakcija i podfrakcija

Razdvajanje tekućina-tekućina pomoću organskih otapala i frakcioniranje na koloni važne su tehnike za obogaćivanje bioaktivnih spojeva iz sirovog ekstrakta [24]. Koristeći raspodjelu tekućina-tekućina, etanolni ekstrakt (CE) iz lišća A. fragrans uzastopno je frakcioniran s diklormetanom, etil acetatom i n-butanolom kako bi se dobile četiri frakcije (DF, EAF, BF i RWF). Utvrđeno je da postotak iskorištenja frakcija varira od 11 do 27 posto. Frakcija rezidualne vode (RWF, 27 posto) imala je najveći prinos, a prinosi ostalih frakcija bili su sljedećim redom: frakcija n-butanola (BF, 24 posto), frakcija etil acetata (EAF, 21 posto), diklorometan frakcija (DF, 11 posto ).

Utvrđeno je da postotak iskorištenja podfrakcija (BF-A do E) varira od 3,82 do 48,4 posto. BF-E pokazao je najveći prinos od 48,4 posto, a slijedi ga BF-D (24,96 posto), koji ima značajno veće prinose od ostalih frakcija.

2.2.HPLC analiza

Pokazalo se da je detekcija tekućinskom kromatografijom visoke učinkovitosti (HPLC) moćna tehnika za kvantitativno određivanje. HPLC analiza otkrila je da BF ima najviše spojeva s najjačim antioksidativnim djelovanjem. Pod vodstvom antioksidativnih testova i HPLC analize, antioksidativna frakcija je dalje kromatografirana za izolaciju podfrakcija. BF je podvrgnut stupcu hidratizirane smole D101 da bi se dobilo pet podfrakcija (BF-A do E). HPLC analiza otkrila je da BF-Cto E ima najviše antioksidativnih spojeva. Bio-vođeno frakcioniranje ovih frakcija (BF-C do E) omogućilo je pročišćavanje sedam čistih spojeva.

Kao što je prikazano na slici 1, BF i sedam čistih spojeva profilirani su HPLC analizom. Na temelju usporedbe s retencijskim vremenima i krivuljama UV apsorpcije, ovih sedam spojeva potvrđeno je kroz retencijska vremena na 7,51 min (korozivno, 7), 7,92 min ((epi)-katehin, 6), 9,38 min (konfuzozid, 1), 9,57 min ((S)-naringenin-7-O- -D-glukopiranozid, 4), 10,32 min (vaccinii folin, 2), 12,64 min (2',3,4,4'-tetrahidroksidi dihidrokalkon, 5) i 13,95 min (1-[4-( -D-glukopiranoziloksi)-2-hidroksifenil]-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil) -1-propanon,3)(Slika 1A). Među njima spojevi 1-6 pripadaju flavonoidima, a spoj 7 je benzokinoletanoid.

2.3. Ukupni sadržaj fenola (TPC) i ukupni sadržaj flavonoida (TFC)

Lišće A.fragrans tradicionalno se koristi kao prerađeni zdravstveni čaj i dokazano je da je dobar izvor fenola i flavonoida [25]. Prema spektrofotometrijskim analizama, TPC i TFC ispitani su u različitim frakcijama i podfrakcijama lišća A. fragrans. Kao što je prikazano u tablici 1, BF je imao najveću TPC vrijednost s 238,12±12.05 mg GAE/g ekstrakta, a zatim EAF. DF je pokazao najnižu vrijednost TPC od 66,52±0,57 mg GAE/g ekstrakta. Slično, najviše koncentracije TFC-a također su pronađene u BF-u s vrijednošću TFC-a od 165,19±5,21 mg RE/ekstrakt. S obzirom na RWF i EAF (66,92±1,38 odnosno 116,12±2,89mg GAE/ekstrakt), također su imali niže koncentracije TFC-a od BF-a (165,19±5,21 mg RE/g ekstrakta), dok je DF imao najnižu koncentraciju TFC-a kao 47,94±2,84 mg RE/g ekstrakta. Sadržaji TPC i TFC u BF bili su približno četiri puta veći od onih u DF.

Podaci su opisali prisutnost najviših TPC i TFC u BF-E s vrijednostima od 262,03±1,72 mg GAE/g ekstrakta; 180,52±6,30 mg RE/g ekstrakta, redom, zatim BF-D (219,84±4,01 odnosno 157,01±2,50 mg RE/g ekstrakta), BF-C (210,69±6,31 i 151,01±4,33 mg RE/g ekstrakta, dok su BF-B i BF-A imali najniže vrijednosti TPC i TFC (Tablica 1).

2.4. Antioksidativno djelovanje

Većina polifenola, posebice flavonoida i fenolnih kiselina, iskorištava se u popularnoj hrani s antioksidansima (nutraceutici) i predstavlja niz dobrobiti za ljude [17]. U našem prethodnom istraživanju dokazano je da su listovi A.fragrans dobar izvor polifenola[26]. Međutim, antioksidativno djelovanje ekstrakta lišća A. fragrans i njegovih fitokemikalija još nije istraženo. Zbog različitih mehanizama antioksidativne reakcije, tri testa ABTS, DPPH i FRAP kombinirana su za procjenu antioksidativne aktivnosti frakcija i podfrakcija lišća A. fragrans.

Among the fractions, BF showed the most potent antioxidant activity in ABTS, DPPH, and FRAP radical-scavenging activities with 1808.46±96.52,951.42±87.75, and 1822.96± 29.24 μmol TE/g extract （Table 1）.PDF showed the lowest antioxidative activity in ABTS and FRAP assays（139.23±8.62 μmol TE/g extract and 180.05± 9.46 μmol TE/g extract, respectively)(Table 1). Whereas the radical scavenging activities of four fractions (DF, EAE, BF, and RWF) in the DPPH radical-scavenging assay were found to vary from 613.38± 45.35 to 951.42±87.75 μmol TE/g extract, respectively, having no significant difference (p>0.05). These results suggested that the phytochemicals from A. fragrans leaves might be insensitive to DPPH. To further obtain the active metabolites, BF was selected for further fractionation. The BF was subjected to D101 macroporous adsorbing resin column chromatography eluting by a gradient of the methanol-aqueous system to yield five subfractions(BF-A to E). Hence, the ABTS radical-scavenging activity of these subfractions can be ranked as BF-E> BF-C>BF-D. Redukcijska aktivnost u FRAP testu otkrila je da je BF-D imao najjaču antioksidativnu aktivnost, koju su slijedili BF-C i BF-E. Važno je napomenuti da su tri podfrakcije (BF-C do E) pokazale veću antioksidativnu aktivnost od matične frakcije (BF). Uzeti zajedno, BF-C do E podvrgnuti su kromatografiji na stupcu za izolaciju i identifikaciju antioksidativnih fitokemikalija.

2.5. Antioksidativno djelovanje izoliranih spojeva

Svim izoliranim spojevima (spojevi 1-7) procijenjen je antioksidativni kapacitet prema ABTS, DPPH aktivnosti hvatanja radikala i FRAP antioksidativnoj aktivnosti. Svi podaci opisani su u tablici 2. Spojevi 6 i 2 pokazali su najveću antioksidacijsku aktivnost, a zatim 5. Spoj 4 pokazao je umjerenu antioksidacijsku aktivnost, a spojevi 1, 3 i 7 smatrani su neaktivnima s aktivnostima hvatanja radikala ABTS i DPPH manjim od 200 μmol TE/g ekstrakta. Korištenjem Vc（aktivnosti hvatanja radikala s 2932,91 ±93,63 odnosno 1873,56±121,68 umol TE/g ekstrakta) kao pozitivne kontrole, spoj 6 imao je najjaču antioksidacijsku aktivnost u ABTS i DPPH testovima hvatanja radikala s 1580,37±89,32 i 1953,31±109,93 μmol TE/g ekstrakta （str<0.05）, respectively.="" furthermore,="" compound="" 6="" had="" the="" best="" antioxidant="" capacity="" in="" the="" frap="" assay="" as="" 5027.43±620.75="" μmol="" te/extract,="" which="" was="" much="" higher="" than="" that="" of="" vc="" as="" 3291.28±241.02="" μmol="" te/extract.="" moreover,="" the="" compound="" 2and6showed="" a="" significant="" antioxidant="" activity,="" which="" was="" equivalent="" to="" a="" positive="" control="">

Osim toga, odnos antioksidativne strukture i aktivnosti flavonoida (1-6) raspravlja se o različitim stupnjevima inhibicijskih učinaka. Spoj 2 pokazao je veću antioksidacijsku aktivnost od spojeva 1, 3 i 5, što je sugeriralo da bi 3,4-dihidroksi skupine u dihidrokalkonima u 2 mogle igrati ključnu ulogu protiv ABTS, aktivnosti hvatanja radikala DPPH i antioksidansa FRAP aktivnost, a glukozni dio supstituiran na C-4'in 2 može igrati važnu ulogu u njegovom antioksidativnom kapacitetu [4]. Nadalje, spoj 6 pokazao je najveću antioksidacijsku aktivnost u usporedbi s drugim spojevima, što sugerira da flavan-3-oli (katehin) vjerojatno pokazuju bolju aktivnost hvatanja radikala od dihidrokalkona i flavanona [27]. Ukratko, spojevi 2, 5 i 6 s dobrim antioksidativnim djelovanjem dodatno su odabrani za citoprotektivne učinke protiv oksidativnog stresa H2O2 u sljedećoj studiji.

2.6. Odnos između antioksidativne aktivnosti i TPC/TFC sadržaja

Koncentracije TPC i TFC u visokoj su korelaciji s antioksidativnom aktivnošću prema vrijednostima FRAP (r{{0}}.982 i 0.977) i ABTS (r=0.959 i 0,965). Korelacijska matrica također je pokazala jaku korelaciju između vrijednosti ABTS i FRAP (r =0.992). Nadalje, provedena je multivarijatna analiza (PCA), koja je izdvojena iz podataka tablice 1. Kao što je prikazano na slici 2, PCA je objasnio 94,44 posto ukupne varijance, u kojoj je PC1 činio 84,73 posto varijance, a PC2 9,71 posto. FRAP, ABTS i DPPH testovi s EAF i RWF smješteni su u gornjim desnim kvadrantima, a koncentracije TPC i TFC s BF i BF-Cto E nalaze se u donjim desnim kvadrantima u pozitivnim rezultatima PC1. U međuvremenu, DF i BF-A do B s niskim koncentracijama TPC i TFC nalaze se duž osi PC1 negativnih rezultata. Ovi nalazi su pokazali da su koncentracije TPC i/ili TFC usko povezane s antioksidativnim kapacitetom, a što su veće koncentracije TPC ili TFC u frakcijama i podfrakcijama, to su veće vrijednosti njihovog antioksidativnog kapaciteta. Ovi rezultati su otkrili da visoki sadržaji fenola i flavonoida u različitim frakcijama i podfrakcijama lišća A. fragrans mogu pridonijeti antioksidativnoj aktivnosti.

Slika 2. PCA analiza ukupnih fenola, flavonoida i antioksidativne aktivnosti. Značenja s različitim slovima ukazuju na značajne razlike (str<0.05).df, eaf,="" bf,="" rwf="" mean="" dichloromethane="" fraction,="" ethyl="" acetate="" fraction,="" n-butanol="" fraction,="" and="" residual="" water="" fraction.="" bf-a="" to="" e="" means="" bf="" was="" subjected="" to="" d101="" column="" chromatography="" to="" yield="" five="">

Ovaj je članak izvađen iz Molecules 2021, 26, 3690. https://doi.org/10.3390/molecules26123690 https://www.mdpi.com/journal/molecules