Aktivni prijelaz faze pamćenja straha od rekonsolidacije do izumiranja kroz prevenciju rekonsolidacije posredovanu ERK-om

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

Dohvaćanjestrahmemorijaizaziva dva suprotna procesa pamćenja, tj. rekonsolidaciju i izumiranje. Kratko vraćanje potiče ponovnu konsolidaciju kako bi se održao ili pojačao strahmemorija, dok produljeno pronalaženje gasi ovo sjećanje. Iako su mehanizmi rekonsolidacije i izumiranja istraženi, ostaje nepoznato kako se faze pamćenja straha prebacuju iz rekonsolidacije u izumiranje tijekom vraćanja sjećanja. Ovdje pokazujemo da proces prijelaza pamćenja ovisan o izvanstaničnom signalu kinaze (ERK) nakon preuzimanja regulira prebacivanje faza pamćenja iz rekonsolidacije u izumiranje sprječavanjem indukcije rekonsolidacije u zadatku izbjegavanja inhibicije (IA) kod muških miševa. Prvo, prijelazna faza pamćenja, koja poništava indukciju rekonsolidacije, ali je nedostatna za stjecanje izumiranja, identificirana je nakon rekonsolidacije, ali prije faza izumiranja. Drugo, faze ponovne konsolidacije, tranzicije i izumiranjavraćanje memorijepokazali su jasne molekularne i stanične potpise kroz cAMP-responsive element-binding protein (CREB) i ERK fosforilaciju u amigdali, hipokampusu i medijalnom prefrontalnom korteksu (mPFC). Faza rekonsolidacije pokazala je povećanu CREB fosforilaciju, dok je faza izumiranja prikazala nekoliko neuralnih populacija s različitim kombinacijama CREB i/ili ERK fosforilacije u tim regijama mozga. Zanimljivo je da su tri faze pamćenja, uključujući prijelaznu fazu, pokazale prolaznu aktivaciju ERK-a odmah nakon preuzimanja. Što je najvažnije, blokada ERK u amigdali, hipokampusu ili mPFC-u u prijelaznoj fazi pamćenja dezinhibirala je pojačanje IA pamćenja izazvano rekonsolidacijom. Ova opažanja sugeriraju da ERK-signalni put aktivno regulira prijelaz faze pamćenja od rekonsolidacije do izumiranja i taj proces funkcionira kao prekidač koji poništava rekonsolidaciju strahamemorija.

Ključne riječi: ERK; izumiranje; sjećanje na strah; rekonsolidacija; tranzicija

1Odjel za bioznanost, Fakultet prirodnih znanosti, Poljoprivredno sveučilište u Tokiju, Tokio 156-8502, Japan, i

2Graduate School of Agriculture and Life Sciences, The University of Tokyo, Tokyo 113-8657, Japan

Izjava o značaju

Vraćanje sjećanja na strahpotiče dva suprotna procesa pamćenja; rekonsolidacije i izumiranja. Ponovna konsolidacija održava/poboljšavastrah od sjećanja, dok izumiranje slabi pamćenje straha. Ostaje nepoznato kako se faze pamćenja prebacuju iz rekonsolidacije u izumiranje tijekom pronalaska. Ovdje smo identificirali aktivni proces tranzicije memorije koji funkcionira kao sklopka koja inhibira ponovnu konsolidaciju. Ova prijelazna faza pamćenja pokazala je prolazno povećanje fosforilacije kinaze regulirane izvanstaničnim signalom (ERK) u amigdali, hipokampusu i medijalnom prefrontalnom korteksu (mPFC). Zanimljivo je da je inhibicija ERK-a u tim regijama u prijelaznoj fazi dezinhibirala pojačanje pamćenja izbjegavanja inhibicije (IA) posredovano rekonsolidacijom. Ovi nalazi sugeriraju da proces tranzicijskog pamćenja aktivno regulira promjenu faza pamćenja straha u pamćenju straha sprječavanjem indukcije rekonsolidacije putem aktivacije ERK-signalnog puta.

Uvod

Memorijadohvaćanje nije pasivan proces, već je prije dinamički proces koji omogućuje održavanje, jačanje, slabljenje ili mijenjanje/ažuriranje izvorne memorije (Misanin et al., 1968; Schneider i Sherman, 1968; Lewis, 1979; Mactutus et al. ., 1979; Gordon, 1981; Nader i sur., 2000; Nader i Hardt, 2009; Dudai, 2012; Fukushima i sur., 2014). Važno je da povratno uvjetovano sjećanje na strah kratkotrajnim ponovnim izlaganjem uvjetovanom podražaju (CS) postaje labilno i zahtijeva rekonsolidaciju ovisnu o ekspresiji gena za svoje održavanje ili poboljšanje (Nader i sur., 2000; Dudai, 2002; Kida i sur., 2002.; Suzuki i sur., 2004.; Tronel i sur., 2005.; Fukushima i sur., 2014.). Suprotno tome, kontinuirano ili opetovano ponovno izlaganje CS-u izaziva izumiranje pamćenja, što slabi pamćenje straha (Pavlov, 1927; Rescorla, 2001; Myers i Davis, 2002). Dakle, vraćanje sjećanja na strah inducira dva suprotna procesa pamćenja, tj. rekonsolidaciju i izumiranje, iako su oba procesa inducirana ponovnim izlaganjem identičnom CS-u, ali se razlikuju prema trajanju ponovnog izlaganja CS-u.

Zajedničko i kritično biokemijsko obilježje ponovne konsolidacije i izumiranja je zahtjev za ekspresiju gena posredovanu proteinom koji veže elemente koji reagira na cAMP (CREB) (Mamiya et al., 2009). Zanimljivo je da smo pokazali kontrastne molekularne, anatomske i bihevioralne potpise između faza rekonsolidacije i izumiranja kontekstualnog sjećanja na strah (Suzuki i sur., 2004; Mamiya i sur., 2009). Blokiranje sinteze proteina tijekom faze rekonsolidacije remeti izvorni strahmemorija, dok blokiranje sinteze proteina tijekom faze izumiranja ne uspijeva, iako je kontekstualno sjećanje na strah ponovno aktivirano. Potreba za regijama mozga koje pokazuju aktivaciju CREB-posredovane ekspresije gena razlikuje se između rekonsolidacije i izumiranja; rekonsolidacija ovisi o amigdali i hipokampusu, dok se ekstinkcija oslanja na amigdalu i medijalni prefrontalni korteks (mPFC). Međutim, vremenski tijek aktivacije amigdaloida CREB razlikuje se između faza rekonsolidacije i faze pamćenja izumiranja. Ova opažanja upućuju na to da faze rekonsolidacije i izumiranja nisu neovisne, već međusobno djeluju jedna na drugu. Zanimljivo je da su nedavne studije identificirale vremenski prozor (fazu prijelaza) koji ne pokazuje aktivaciju kinaze regulirane izvanstaničnim signalom (ERK) u amigdali nakon rekonsolidacije, ali prije faza izumiranja nakon vraćanja slušnog sjećanja na strah (Merlo i sur., 2018. ). Uzeti zajedno, ovi nalazi sugeriraju moguće mehanizme kojima se faze pamćenja prebacuju iz rekonsolidacije u izumiranje tijekom vraćanja sjećanja na strah. Drugim riječima, moguće je da proces prijenosa memorije aktivno regulira ovaj prekidač.

U zadatku izbjegavanja inhibicije (IA), miševi primaju električni šok nakon što uđu u tamni odjeljak iz svijetlog odjeljka i formirajumemorijakako bi izbjegli mračni odjeljak. Prethodno smo korištenjem ovog zadatka pokazali da se faze rekonsolidacije i izumiranja mogu razlikovati u trenutku kada miš uđe u tamni odjeljak iz svijetlog odjeljka tijekom sesije ponovnog izlaganja (Fukushima et al., 2014.). Stoga nam ovaj zadatak omogućuje karakterizaciju perspektivnih molekularnih potpisa faza rekonsolidacije i izumiranja, za razliku od klasične kontekstualne paradigme uvjetovanja straha u kojoj reaktivacija uvjetovanog sjećanja na strah ponovnim izlaganjem CS-u pokreće i rekonsolidaciju i izumiranje; kratka (3 min) ponovna izloženost uvjetovanom kontekstu izaziva ponovnu konsolidaciju, dok duga (30 min) ili opetovana ponovna izloženost ovom kontekstu izaziva izumiranje (Eisenberg i sur., 2003; Pedreira i Maldonado, 2003; Suzuki i sur., 2004.; Lee i sur., 2008.; Mamiya i sur., 2009.). Nadalje, otkrili smo da je dohvaćena IA memorija poboljšana rekonsolidacijom memorije u ovom zadatku (Fukushima et al., 2014.).

Razumjeti mehanizam prijelaza iz ponovne konsolidacije u nestanak tijekom povratka strahamemorija, cilj nam je bio identificirati i karakterizirati molekularne, stanične i bihevioralne potpise faza rekonsolidacije, prijelaza i izumiranja IA memorije. Analizirali smo aktivaciju CREB-a i ERK-a u amigdali, hipokampusu i mPFC-u u fazama rekonsolidacije, prijelaza i izumiranja te ispitali uloge aktivacije ERK-a u tim procesima pamćenja.

Materijali i metode

Miševi Svi pokusi su provedeni prema Vodiču za njegu i korištenje laboratorijskih životinja (Japan Neuroscience Society i Tokyo University of Agriculture). Sve pokuse na životinjama provedene u ovoj studiji odobrio je Odbor za brigu i korištenje životinja Poljoprivrednog sveučilišta u Tokiju (autorizacija #280037). Svi kirurški zahvati izvedeni su pod anestezijom Nembutalom i učinjeni su svi napori da se patnja svede na minimum. Muški C57BL/6N miševi dobiveni su iz Charles Rivera. Miševi su bili smješteni u kaveze od pet ili šest, održavani na ciklusu 12/12 h svjetlo/tama, i omogućen im je pristup hrani i vodi ad libitum. Miševi su bili stari najmanje osam tjedana kada su testirani. Testiranje je obavljeno tijekom lagane faze ciklusa. Svi pokusi su provedeni naslijepo za uvjete liječenja miševa.

IA test Prolazni IA aparat (OHARA Pharmaceutical) sastojao se od kutije s odvojenim svijetlim i tamnim odjeljcima (oba 15,5 12,5 11,5 cm). Svjetlosni odjeljak osvijetljen je fluorescentnim svjetlom (2500 luksa; Fukushima et al., 2008, 2014; Zhang et al., 2011; Ishikawa et al., 2016). Prije početka IA treninga, miševi su tretirani pojedinačno 2 minute svaki dan tijekom jednog tjedna. Tijekom treninga, svakom mišu je dopušteno da se navikne na svijetli odjeljak 30 s, a vrata giljotine su podignuta kako bi se omogućio pristup tamnom odjeljku. Latencija za ulazak u tamni odjeljak smatrana je mjerom akvizicije. Čim je miš ušao u mračni odjeljak, vrata giljotine su se zatvorila. Nakon 5 s, isporučen je nožni šok (0,2 mA) u ukupnom razdoblju od 2 s (trening). 24 sata nakon treninga, miš je vraćen u svijetli odjeljak dok nije ušao u tamni odjeljak (prosjek 459 6 15.49 s). Neposredno nakon što je miš ušao u mračni odjeljak, vrata giljotine su zatvorena i miš je ostao u mračnom odjeljku različito vrijeme (0, 1 ili 10 minuta) bez udarca stopala (reaktivacije). Pamćenje je procijenjeno 48 sati kasnije [test dugotrajnog pamćenja nakon aktivacije (PR-LTM)] kao križna latencija za miša da uđe u tamni odjeljak kada se zamijeni u svijetlom odjeljku, kao kod reaktivacije.

Za prvi pokus ispitali smo učinak inhibicije sinteze proteina nakon reaktivacije (ponovno izlaganje tamnom odjeljku 0, 1 ili 10 min; slika 1). Inhibitor sinteze proteina anizomicin (ANI; Wako) otopljen je u slanoj otopini (pH podešen na 7.0–7,4 s NaOH). Miševi su trenirani kako je gore opisano, a 24 sata kasnije primili su vehikulum (VEH) ili ANI (150 mg/kg, ip) odmah nakon ponovnog izlaganja tamnom odjeljku na 0, 1 ili 10 minuta bez šoka. (ponovno aktiviranje). U ovoj dozi, ANI inhibira 0,90 posto sinteze proteina u mozgu tijekom prva 2 sata (Flood et al., 1973). 48 h nakon sesije reaktivacije, pojedinačni miševi ponovno su stavljeni u svjetlosni odjeljak i procijenjena je latencija križanja.

Za drugi eksperiment [fosforilirani CREB (pCREB) i fosforilirani ERK (pERK) imunohistokemija; smokve 2–5], ispitali smo regije mozga koje su se aktivirale nakon ponovnog izlaganja svjetlu (sve dok miševi nisu ušli u tamni odjeljak, ponovno izlaganje mračnom odjeljku 0 min) ili tamnom odjeljku (ponovno izlaganje tamnom odjeljku 1 ili 10 min). Miševi su podijeljeni u četiri Fukushima et al. · Prijelaz faza pamćenja straha nakon vraćanja J. Neurosci., 10. veljače 2021., • 41(6):1288–1300 • 1289grupe. 24 sata nakon treninga, pojedinačni miševi su ponovno izloženi svijetlom odjeljku, a zatim su ostali u tamnom odjeljku nakon ulaska iz tamnog odjeljka [reaktivacija: 0 min u tamnom odjeljku, skupina za rekonsolidaciju (Recon); 1 min, prijelazna (Tran) grupa; 10 min, ekstinkcija (Ext) grupa]. Druga skupina miševa nije vraćena u svjetlo/tamni odjeljak [skupina koja nije reaktivirana (NR)]. Miševi su zatim anestezirani s Nembutalom (750 mg/kg, ip) 5, 15 ili 30 minuta nakon reaktivacije.

Za treći eksperiment (mikroinfuzija U0126; slike 6,7), ispitali smo učinke inhibicije ERK u amigdali, hipokampusu ili mPFC-u namemorijarekonsolidacija/poboljšanje, prijelaz i izumiranje. MEK inhibitor U0126 (Sigma-Aldrich) otopljen je u umjetnoj cerebrospinalnoj tekućini koja je sadržavala tri kapi Tween 80 (Sigma) u 2,5 ml 7,5 postotnog dimetil sulfoksida (Wako) i podešen na pH 7,4 s NaOH. Miševi su trenirani kao što je gore opisano, i 24 sata kasnije, stavljeni su natrag u svjetlosni odjeljak (reaktivacija). Miševima je mikroinfundiran U0126 (1 mg) ili VEH u različite regije mozga odmah nakon (slike 6A, C, E–H, 7A–C) ili 30 minute nakon (Sl. 6B, D) reaktivacija. 48 h nakon reaktivacije, pojedinačni miševi su ponovno stavljeni u svjetlosni odjeljak i procijenjena je latencija križanja (PR LTM). Mikroinfuzije u hipokampus i mPFC (0,5 ml) napravljene su brzinom od 0,25 ml/min. Mikroinfuzije u amigdalu (0,2 ml) napravljene su brzinom od 0,1 ml/min. Injekcijska kanila ostavljena je na mjestu 2 minute nakon mikroinfuzije, a miševi su zatim vraćeni u svoje kućne kaveze. MEK inhibitor SL327 (Santa Cruz Biotechnology) otopljen je u dimetil sulfoksidu i razrijeđen fiziološkom otopinom. Miševi su trenirani kako je gore opisano, a 24 sata kasnije, pojedinačni miševi su stavljeni natrag u svjetlosni odjeljak (reaktivacija). Miševima je sistemski ubrizgan SL327 (10 ili 20 mg/kg) ili VEH odmah nakon reaktivacije (Slika 7D-F). 48 h nakon reaktivacije, pojedinačni miševi ponovno su stavljeni u svjetlosni odjeljak i procijenjena je latencija križanja (PR-LTM).

Imunohistokemija je provedena kao što je prethodno opisano (Mamiya i sur., 2009; Suzuki i sur., 2011; Zhang i sur., 2011; Fukushima i sur., 2014; Ishikawa i sur., 2016; Hasegawa i sur., 2019). Nakon anestezije, svi miševi su perfundirani s 4 posto paraformaldehida. Mozgovi su uklonjeni, fiksirani preko noći, prebačeni u 30-postotnu saharozu i pohranjeni na 4 stupnja. Koronalni presjeci (30 mm) izrezani su u kriostatu.

Za pCREB i pERK bojenje, slobodno plutajuće sekcije tretirane su s 1 posto H2O2 i inkubirane preko noći sa zečjim poliklonskim anti-fosfo-CREB (serin 133; S133) protutijelom (1:1000; #{{10 }}, Millipore) i/ili zečje monoklonsko anti-fosfo-ERK1/2 (T202/Y204) protutijelo (1:300; #4370; Cell Signaling Technology) u otopini za blokiranje (fosfatno puferirana fiziološka otopina plus 1 posto kozjeg serumskog albumina, 1 mg/ml goveđeg serumskog albumina i 0,05 posto Triton X-100). Sekcije su isprane fosfatno puferiranom fiziološkom otopinom i inkubirane s magarećim anti-zečjim IgG konjugiranim s peroksidazom hrena (1:500; Jackson ImmunoResearch) za pCREB ili kozjim anti-zečjim IgG konjugiranim s peroksidazom hrena za pERK tijekom 1 sata na sobnoj temperaturi. pCREB signali su pojačani biotin tiramidom i vizualizirani pomoću Alexa Fluor-konjugiranog streptavidina (Invitrogen). pERK signali su pojačani s TSA-FCM (Invitrogen). Sekcije su montirane na stakalce i pokrivene pokrovnim stakalcem pomoću medija za montiranje (Millipore).

Kvantifikacija je provedena kao što je prethodno opisano (Frankland i sur., 2006; Fukushima i sur., 2014; Mamiya i sur., 2009; Zhang i sur., 2011; Suzuki i sur., 2008). Strukture su definirane anatomski prema atlasu Franklina i Paxinosa (1997). Eksperimentator je prebrojao sve imunoreaktivne neurone koji nisu bili svjesni uvjeta liječenja

Rezultati

Karakterizacija faza pamćenja nakon dohvaćanja u IA zadatku

Zadatak IA omogućuje nam da razlikujemo faze rekonsolidacije i izumiranja u trenutku kada miš uđe u tamni odjeljak od svijetlog odjeljka (Fukushima et al., 2014.). Kako bismo razumjeli mehanizam na kojem se temelji promjena faza pamćenja od rekonsolidacije do izumiranja, okarakterizirali smo IA faze pamćenja nakon vraćanja pamćenja ispitivanjem učinaka inhibicije sinteze proteina koja je potrebna za rekonsolidaciju i izumiranje IA sjećanja (Fukushima et al., 2014). Miševi su prvo stavljeni u svjetlosni odjeljak. 5 s nakon što su ušli u mračni odjeljak, izveden je kratak električni šok (obuka). Miševi su ponovno izloženi svjetlosnom odjeljku 24 h nakon treninga (sesija reaktivacije; slika 1A) i procijenjena je njihova prijelazna latencija za ulazak u tamni odjeljak (slika 1B). Miševi su vraćeni u svoje kućne kaveze odmah nakon što su ušli u tamni odjeljak iz svijetlog odjeljka (0-min ponovno izlaganje tamnom odjeljku; faza rekonsolidacije) ili su ostali u tamnom odjeljku 1, 3 ili 10 minuta bez primanja nožnog šoka (faza izumiranja; sl. 1C–E). Neposredno nakon sesije reaktivacije, miševi su primili sistemsku injekciju VEH ili inhibitora sinteze proteina ANI. 48 sati kasnije, latencija križanja je procijenjena PR-LTM.

U skladu s našom prethodnom studijom (Fukushima et al., 2014), ponovno izlaganje svjetlosnom odjeljku (0 min skupina) izazvalo je ponovnu konsolidaciju i poboljšanje IA memorije. Dvosmjerna ANOVA otkrila je značajne učinke vremena (F(1,24)=10.433, p=0.{{20}}036), lijeka (F(1 ,24)=23.197, p , 0,0001) i vrijeme interakcije lijeka (F(1,24)=25.022, p , 0,0001; slika 1B). Post hoc Bonferronijev test i upareni t-test otkrili su da su grupe VEH i ANI pokazale značajno povećanu, odnosno smanjenu latenciju križanja na PR-LTM u usporedbi sa sesijom reaktivacije (ps, 0,05; VEH, t(6) {{28 }} 5,134, p=0.0021, ANI, t(6)=4.804, p=0.003; Slika 1B). Ova opažanja pokazuju da je IA vraćanje pamćenja u svjetlosnom odjeljku poboljšalo pamćenje, dok je inhibicija sinteze proteina poremetila dohvaćeno pamćenje, potvrđujući prethodno opažanje da IA ​​vraćanje pamćenja poboljšava pamćenje putem rekonsolidacije na način ovisan o sintezi proteina.

Nasuprot tome, ponovno izlaganje tamnom odjeljku izazvalo je dugotrajnu ekstinkciju [dvosmjerna ANOVA, vrijeme (Sl. 1C, F(1,28)=9.575, p=0.{ {50}}04; Slika 1D, F(1,36)=11.699, str=0.0016), lijek (Slika 1C, F(1,28)=4.674, str=0.039; Slika 1D, F(1,36)=12.285, str {{29 }}.0012), vremenska interakcija lijeka (Slika 1C, F(1,28)=7.916, p=0.009; Slika 1D, F(1,36) {{41 }}.915, p=0.0079)], kao što je prethodno primijećeno (Fukushima et al., 2014.). Skupine VEH koje su ostale u tamnom odjeljku 3 ili 10 minuta pokazale su značajno smanjenu latenciju križanja na PR-LTM u usporedbi sa sesijom reaktivacije, dok su grupe ANI pokazale usporedivu latenciju križanja na PR-LTM u usporedbi sa sesijom reaktivacije i sa sesijom reaktivacije. VEH skupine (post hoc Bonferronijev test, ps , 0,05; upareni t test, slika 1C, VEH, t(7)=4.976, p=0.0016, ANI, t(7) { {59}}.796, str. 0,05; Slika 1D, VEH, t(9)=10.211, str, 0,0001, ANI, t(9)=1.02, str. 0,05 ). Ova opažanja pokazuju da je ponovno izlaganje tamnom odjeljku na 3 ili 10 minuta ugasilo IA pamćenje i da je inhibicija sinteze proteina blokirala dugoročno izumiranje. Stoga, pronalaženje IA memorije u tamnom odjeljku gasi IA memoriju na način ovisan o ekspresiji gena.

Važno je da je grupa VEH pokazala usporedivu cross over latenciju na PR-LTM u usporedbi sa sesijom reaktivacije i grupom ANI kada su ostali u tamnom odjeljku 1 minutu [dvosmjerna ANOVA, vrijeme (F(1,36) {{ 5}}.03, str 0.05), lijek (F(1,36)=0.019, str. 0.05), vrijeme interakcije lijeka (F(1,36)=0.011, p. 0.05); post hoc Bonferronijev test, ps . 0,05; upareni t-test, VEH, t(9)=0.091, str. 0,05, ANI, t(9)=0.328, str. 0,05; Slika 1E]. Ova opažanja pokazuju da skupina VEH nije pokazala ni poboljšanje ni izumiranje IA pamćenja i da ANI skupina nije pokazala nikakav poremećaj IA pamćenja. Stoga je ponovno izlaganje tamnom odjeljku u trajanju od 1 minute blokiralo i pojačanje i poremećaj izazvan ANI reaktivirane memorije IA, ali nije ugasio memoriju IA, što sugerira da ovo 1-min ponovno izlaganje poništava indukciju rekonsolidacije , ali je nedovoljno za gašenje IA memorije.

Ukratko, ovi rezultati pokazuju da ponovno izlaganje svijetlom odjeljku izaziva fazu rekonsolidacije, dok dulje ponovno izlaganje tamnom odjeljku (3 ili 10 min) izaziva fazu izumiranja. Što je još važnije, boravak 1 minutu u tamnom odjeljku izaziva prijelaznu fazu od ponovne konsolidacije do izumiranja, što inhibira ponovnu konsolidaciju sjećanja na strah bez izazivanja izumiranja.

Molekularni potpisi faza rekonsolidacije, prijelaza i izumiranja u amigdali, hipokampusu i mPFC-u nakon pronalaženja memorije IA

Ponovna konsolidacija i izumiranje kontekstualnog pamćenja straha pokazuju povećanje fosforilacije CREB-a na S133, markera aktivacije ekspresije gena potrebnog za rekonsolidaciju i dugoročno izumiranje, ali pokazuju izrazitu dinamiku fosforilacije CREB-a (Mamiya et al., 2009 ). Zanimljivo je da su nedavne studije pokazale da nema povećanja fosforilacije ERK, uzvodnog regulatora CREB-a (Impey i sur., 1998.; Wu i sur., 2001.), u bazolateralnom području amigdale na prijelazu iz rekonsolidacije. do izumiranja sjećanja na strah, iako se ta fosforilacija povećava u bazolateralnoj regiji kada se sjećanje na strah ponovno konsolidira i ugasi (Merlo et al., 2014, 2018). Drugo istraživanje pokazalo je da se hipokampalni ERK aktivira samo kada se kontekstualno sjećanje na strah ugasi, ali se ne ponovno konsolidira (Tronson i sur., 2009.). Ovi nalazi sugeriraju da faze rekonsolidacije, tranzicije i izumiranja pokazuju jasne molekularne i stanične potpise. Stoga smo izmjerili i usporedili razine pCREB i pERK u fazama rekonsolidacije, prijelaza i izumiranja pomoću imunohistokemije. Izveli smo slične eksperimentalne rasporede kao na slici 1B, D, E koristeći četiri eksperimentalne skupine. Miševi su ponovno izloženi svijetlom odjeljku 24 sata nakon treninga i zatim su ostali u tamnom odjeljku [reaktivacija: 0 min u tamnom odjeljku, skupina za rekonsolidaciju (Recon); 1 min, prijelazna (Tran) grupa; 10 min, ekstinkcija (Ext) grupa]. Druga skupina miševa nije vraćena u svjetlo/mračni odjeljak (nereaktivirana, NR skupina). Brojali smo pCREB-pozitivne (pCREB1) neurone, pERK-pozitivne (pERK1) neurone i dvostruko pozitivne (pCREB1/pERK1) neurone u amigdali, hipokampusu i mPFC-u 30 minuta nakon sesije reaktivacije.

Amigdala (lateralna regija) CREB se aktivirala u fazama izumiranja i rekonsolidacije, dok se ERK aktivirala samo u fazi izumiranja (Slika 2A-C). Jednosmjerna ANOVA otkrila je značajan učinak grupe (Slika 2B, F(3,29)=14.85, p , 0.0001). Slično prethodnim nalazima (Mamiya et al., 2009.), post hoc Newman-Keulsov test otkrio je da su Recon i Ext skupine pokazale značajno više pCREB1 neurona od ostalih skupina (p, 0,05). Ova opažanja su pokazala da slično opažanjima na razinama ponašanja (slika 1), izlaganje tamnom odjeljku u trajanju od 1 minute (prijelazna faza) poništava "uključivanje" CREB fosforilacije koja bi bila povećana u fazi rekonsolidacije. Nasuprot tome, značajno više pERK1 neurona primijećeno je u Ext skupini nego u drugim skupinama, iako je bilo puno manje pERK1 neurona nego pCREB1 neurona u Ext skupini (F(3,29)=3.793, p { {23}}.0207; slika 2C).

Dosljedno, značajno više dvostruko pozitivnih neurona (pCREB1/pERK1) uočeno je u Ext skupini (F(3,29)=6.698, p=0.00 14; sl. 2D), dok je znatno više pCREB1/pERK– (pCREB pojedinačni pozitivni) neurona uočeno u Recon i Ext skupinama (F(3,29)=13.689, p , 0 .0001; sl. 2E). Stoga je faza rekonsolidacije pokazala samo jednu populaciju pCREB1/pERK– neurona. Nasuprot tome, faza izumiranja pokazala je dvije populacije pCREB1/pERK– i pCREB1/pERK1 neurona, što ukazuje da se ERK aktivira samo u podskupu pCREB1 neurona. Važno je da su slični rezultati uočeni u bazolateralnom području amigdale (Slika 2G, F(3,29)=13.042, p , 0,0001; Slika 2H, F(3,29) {{32} }.824, p=0.0201; Slika 2I, F(3,29)=12.633, p , 0.0001; Slika 2J, F(3,29)=12 .505, str, 0,0001).

Dvofazna aktivacija ERK-a u fazi izumiranja ERK je uzvodni aktivator CREB-a i stoga je aktivacija ERK-a potrebna za konsolidaciju i rekonsolidaciju sjećanja na strah (Schafe et al., 200{{31 }}; Duvarci et al., 2005). Međutim, nedosljedno, nije primijećena aktivacija ERK-a u amigdali, hipokampusu ili mPFC-u u fazi rekonsolidacije kada je pERK mjeren 30 min nakon sesije reaktivacije (Slike 2-4). Stoga smo ispitali vremenske tokove fosforilacije ERK i CREB. Izveli smo sličan eksperiment kao na slikama 2-4, osim što su razine pCREB i pERK izmjerene 5, 15 i 30 min nakon sesije reaktivacije (ponovno izlaganje tamnom odjeljku za {{ 66}}, 1 ili 10 min; sl. 5A). U skladu s podacima prikazanim na slikama 2-4, značajna povećanja neurona pCREB1 primijećena su 30 minuta, ali ne i 5 minuta, nakon sesije reaktivacije u Recon (amigdala, mPFC i hipokampus) i Ext (amigdala i mPFC ) skupine, ali ne i Tran skupina (Sl. 5E, jednosmjerna ANOVA, amigdala, 5 min, F(3,23)=0.346, p. 0,05, 30 min, F(3,23)=15.272, p, 0,0001; mPFC, 5 min, F(3,23)=1,169, p. 0,05, 30 min, F(3,23)=32. 346, p, 0,0001;hipokampus, 5 min, F(3,23)=0.154, p.0,05, 30 min, F(3,23)=16.197, p, 0,0001; nespareni t test, amigdala, rekonsolidacija, 5 vs 30 min, t(12)=7.807, p , 0,0001, ekstinkcija, 5 vs 30 min, t(12)=5.405, p { {73}}.0002; mPFC, rekonsolidacija, 5 prema 30 min, t(12)=5.727, p , 0,0001, ekstinkcija, 5 prema 30 min, t(12)=4.188 , p=0.0013; hipokampalna CA1 regija, rekonsolidacija, 5 nasuprot 30 min, t(12)=2.339, p=0.0374).

Zanimljivo je da su opažena značajna povećanja neurona pERK1 u amigdali, mPFC-u i hipokampusu Recon, Tran i Ext skupina 5 minuta nakon sesije reaktivacije u usporedbi s NR skupinom (Slika 5F, amigdala, F(3,23)=10.961, p=0.0001; mPFC, F(3,23)=7.525, p { {13}}.0011; hipokampus, F(3,23)=6.924, p=0.0017). Ova su opažanja pokazala da se ERK aktivira odmah nakon sesije reaktivacije u svim fazama pamćenja. Međutim, ova povećanja u broju pERK1 neurona vratila su se na bazalne razine (usporedivo s NR skupinom) 15 minuta nakon sesije reaktivacije (Slika 5F, amigdala, F(3,20)=2).676, p 0,05; mPFC, F(3,23)=0.683, p. 0,05; hipokampus, F(3,20)=0.74, p. 0,05). Nadalje, u skladu s nalazima prikazanim na slikama 2-4, značajno više pERK1 neurona uočeno je u amigdali, mPFC-u i hipokampusu 30 minuta nakon sesije reaktivacije samo u Ext skupini (Slika 5F, amigdala, F( 3,23)=6.616, p=0.022; mPFC, F(3,23)=8.012, p=0.0008; hipokampus, F( 3,23)=6.206, str=0.003). Dakle, faze rekonsolidacije i prijelazne faze pokazuju prolaznu aktivaciju ERK-a samo u ranoj vremenskoj točki (5 minuta), dok faza izumiranja pokazuje dvofaznu aktivaciju ERK-a u ranoj (5 minuta) i kasnoj (30 minuta) vremenskoj točki nakon reaktivacije. sjednica. Ova su opažanja pokazala da se mehanizmi za regulaciju aktivacije ERK razlikuju u fazama rekonsolidacije/prijelaza i izumiranja. Zajedno, naša su promatranja pokazala da faze rekonsolidacije, prijelaza i izumiranja pokazuju različite molekularne potpise.

Uloge aktivacije ERK u fazama rekonsolidacije i izumiranja IA memorije

Faze rekonsolidacije/prijelaza i izumiranja pokazale su monofaznu, odnosno bifaznu ERK aktivaciju. Zatim smo istražili i usporedili uloge rane (5 minuta) i kasne (30 minuta) aktivacije ERK-a u mPFC-u u fazama rekonsolidacije i izumiranja ispitivanjem učinaka inhibicije ERK-a (slika 6).

Rasprava

U ovoj smo studiji istraživali mehanizme za prijelaz pamćenja iz faze rekonsolidacije u fazu izumiranja nakon preuzimanja IA memorije. Prvo smo okarakterizirali bihevioralne potpise faza pamćenja IA nakon dohvaćanja. U skladu s našom prethodnom studijom (Fukushima et al., 2014), IA ponovnim izlaganjem svjetlu (0 min u tamnom odjeljku) i tamnom ( 3 odnosno 10 min) odjeljaka. Zanimljivo, IA pamćenje nije bilo ni pojačano ni ugašeno i pokazalo je otpornost na inhibiciju sinteze proteina kada su miševi ponovno bili izloženi tamnom odjeljku samo 1 minutu. Stoga ova opažanja sugeriraju da 1-min ponovno izlaganje tamnom odjeljku poništava indukciju ponovne konsolidacije, ali je nedovoljno da ugasi IA memoriju. Nadalje, otkrili smo da se ERK aktivirao u amigdali, hipokampusu i mPFC-u u ranoj vremenskoj točki (5 minuta) nakon ponovnog izlaganja tamnom odjeljku na 0, 1 ili 10 minuta. Dosljedno, inhibicija ERK-a u tim regijama mozga blokirala je ponovnu konsolidaciju/poboljšanje i izumiranje IA memorije. Najvažnije je da je inhibicija ERK u amigdali, hipokampusu i mPFC-u nakon 1- min ponovnog izlaganja tamnom odjeljku dezinhibirala poboljšanje IA memorije posredovano rekonsolidacijom, što sugerira da je aktivacija ERK nakon kratkih (1 min) ponovnih izlaganja u tamni odjeljak potreban je za inhibiciju rekonsolidacije IA memorije. Nasuprot tome, 1--minutno ponovno izlaganje tamnom odjeljku bilo je nedovoljno da ugasi IA sjećanje, iako je produljeno ponovno izlaganje tamnom odjeljku (3 ili 10 min) ugasilo ovo sjećanje. Stoga naši rezultati sugeriraju da 1-minutna ponovna izloženost tamnom odjeljku izaziva proces prijelaza pamćenja koji poništava ponovnu konsolidaciju/poboljšanje, ali ne pokreće učenje o izumiranju. Zajedno, predlažemo da proces tranzicije pamćenja pridonosi prebacivanju faza pamćenja od rekonsolidacije do izumiranja putem ERK-posredovane prevencije rekonsolidacije.

Slično našim trenutačnim opažanjima, nedavna studija koja je koristila uvjetovanje slušnog straha pokazala je da pojedinačne (1) ili produljene (10) prezentacije CS-a izazivaju rekonsolidaciju pamćenja, odnosno izumiranje, kroz povećanje razine pERK u bazolateralnoj regiji amigdale. Nasuprot tome, srednje (4-7) CS prezentacije ne mijenjaju razine pERK u bazolateralnoj regiji amigdale. Važno je da inhibicija ERK-a na srednjim CS prezentacijama nije utjecala na pamćenje straha. Ovo je istraživanje pokazalo da postoji prijelaz faze pamćenja od ponovne konsolidacije do izumiranja nakon vraćanja sjećanja na strah (Merlo et al., 2018). U ovoj smo studiji proširili ovo otkriće i predložili da prijelazna faza aktivno prebacuje faze pamćenja iz rekonsolidacije u izumiranje kroz aktivaciju puta prijenosa ERK signala. Za razliku od prethodnih otkrića (Merlo et al., 2018.), otkrili smo da prijelazna faza uključuje fosforilaciju ERK u amigdali, hipokampusu i mPFC-u. Ove razlike su možda zbog razlike u vremenskim točkama ispitivanja fosforilacije ERK; prethodna studija mjerila je razine pERK-a na;12 minuta nakon prezentacije CS-a (Merlo et al., 2018.), dok je naša studija pokazala da su se povećane razine pERK-a vratile na bazalnu razinu otprilike u ovoj vremenskoj točki (15 minuta nakon ponovnog izlaganja). Osim toga, važno je napomenuti da IA ​​zadatak omogućuje promatranje poboljšanja IA pamćenja kroz rekonsolidaciju, što dovodi do našeg otkrića da inhibicija ERK u prijelaznoj fazi dezinhibira poboljšanje IA pamćenja.

Prethodne studije pokazale su da je fosforilacija ERK-a povećana u bazolateralnoj regiji amigdale 20-60 minuta nakon učenja izumiranja pamćenja straha (Herry et al., 2006; Merlo et al., 2014, 2018), dok hipokampus pokazuje ova aktivacija 1 sat nakon izumiranja učenja kontekstualnog pamćenja straha (Fischer i sur., 2007; Tronson i sur., 2009). U ovoj studiji dobili smo slična opažanja da se pERK povećava 30 minuta nakon sesije reaktivacije u fazi izumiranja. Ovi nalazi sugeriraju da je fosforilacija ERK uobičajen molekularni potpis kasne faze izumiranja (20-60 min).

Nadalje, primijetili smo da se aktivacija ERK-a događa dvofazno u ranim i kasnim vremenskim točkama (5 i 30 minuta) nakon sesije reaktivacije u fazi gašenja, dok se ta aktivacija događa monofazno u ranoj vremenskoj točki u fazi rekonsolidacije (Slika 5). . Dosljedno, inhibiranje ERK u regijama mozga u tim vremenskim točkama faza rekonsolidacije i izumiranja blokiralo je rekonsolidaciju/poboljšanje odnosno dugoročno izumiranje (Slika 6A, C–H). Ova zapažanja sugeriraju da je monofazna i bifazna ERK aktivacija potrebna za rekonsolidaciju posredovano poboljšanje odnosno izumiranje IA memorije. Važno je napomenuti da ERK funkcionira kao uzvodni regulator fosforilacije CREB. Stoga, prolazna aktivacija ERK-a u ranoj fazi pamćenja može, barem djelomično, pridonijeti ovoj fosforilaciji CREB-a, koja aktivira ekspresiju gena potrebnih za rekonsolidaciju i dugoročno izumiranje.

Slično našim prethodnim nalazima korištenjem kontekstualnog uvjetovanja straha (Mamiya et al., 2009), CREB se aktivirao u fazama rekonsolidacije (amigdala/hipokampus/mPFC) i izumiranja (amigdala/mPFC) pamćenja, dok se ERK aktivirao samo u fazi izumiranja 30 minuta nakon sesije reaktivacije. Dosljedno, samo jedna populacija pCREB1/pERK– neurona uočena je u fazi rekonsolidacije, dok su različite populacije neurona uočene u fazi izumiranja: pCREB1/pERK– i pCREB1/pERK1 neuroni u amigdali (slika 2); pCREB– /pERK1 neuroni u hipokampusu (slika 3); i pCREB1/pERK–, pCREB–/pERK1 i pCREB1/pERK1 neurona u mPFC (Slika 4). Ova opažanja, posebno kontrastno promatranje neurona pCREB–/pERK1 i pCREB1/pERK–, sugeriraju da je aktivacija CREB-a i ERK-a drugačije regulirana u svakom području mozga kada se pamćenje ugasi i da kasna faza aktivacije ERK-a djeluje specifično i jasno uloge u izumiranju sjećanja na strah u usporedbi s drugim procesima pamćenja kao što su konsolidacija i ponovna konsolidacija kao što je objašnjeno u nastavku. Zanimljivo je da smo uočili da su pERK1 neuroni bili obilniji u mPFC-u u usporedbi s hipokampusom i amigdalom, budući da je mPFC pokazao veći omjer pERK1 neurona (faza izumiranja) i pCREB1 neurona (faza rekonsolidacije) u usporedbi s hipokampusom i amigdalom, što sugerira da aktivacija ERK-a u mPFC-u igra specifičniju ulogu u izumiranju pamćenja.

Ostaje nejasno aktiviraju li se iste ili različite populacije neurona u fazama pamćenja rekonsolidacije, prijelaza i izumiranja. Prethodno istraživanje identificiralo je aktivaciju "neurona straha" i "neurona izumiranja" u amigdali kada se sjećanje na strah ponovno aktivira ili ugasi (Herry et al., 2008). Stoga je moguće da se ERK i CREB aktiviraju u različitim populacijama neurona s različitim vremenskim profilima (tj. "neuroni rekonsolidacije" i neuroni izumiranja). Kao što je gore razmotreno, neuroni pCREB1, uključujući neurone pCREB1/pERK1, mogu regulirati ponovnu konsolidaciju i dugotrajnu ekstinkciju IA memorije putem aktivacije ekspresije gena kao neurona rekonsolidacije i ekstinkcije. Nasuprot tome, ERK aktivacija u pCREB– /pERK1 neuronima može doprinijeti otkazivanju transkripcijske aktivacije posredovane CREB-om koja bi bila potrebna za rekonsolidaciju budući da se ta ERK aktivacija posebno opaža u kasnoj fazi izumiranja; ERK se aktivirao u neuronima rekonsolidacije kako bi poništio aktivaciju ekspresije gena u fazi izumiranja. Zanimljivo je da je prethodna studija pokazala da hipokampalna ERK aktivacija blokira indukciju c-fos kada se kontekstualno sjećanje na strah ugasi (Guedea et al., 2011.), povećavajući mogućnost da ta ERK aktivacija antagonizira CREB-signalni put. Važno je identificirati neuronske populacije koje reguliraju rekonsolidaciju, tranziciju i izumiranje te istražiti molekularne potpise i funkcionalni značaj tih neurona. Osim toga, interakcije među neuralnim populacijama identificirane u ovoj studiji ostaju nepoznate. Moguće je da "neuroni izumiranja (tranzicije)" moduliraju funkciju neurona rekonsolidacije kako bi prekinuli sprječavanje rekonsolidacije kroz interakcije među njima (Eisenberg i sur., 2003; Merlo i sur., 2014). Stoga je također važno ispitati te interakcije unutar i između amigdale, mPFC-a i hipokampusa.

Prethodno smo pokazali da hipokampus ne pokazuje promjenu fosforilacije CREB-a i ekspresije Arc nakon izumiranja učenja kontekstualnog straha, i dosljedno, inhibicija sinteze proteina u hipokampusu u fazi izumiranja ne uspijeva blokirati dugoročno izumiranje (Mamiya et al. , 2009). Ova su opažanja povećala mogućnost da hipokampus nije potreban za dugoročno izumiranje. Međutim, pokazali smo da se ERK aktivira u hipokampusu nakon učenja izumiranja IA memorije, i dosljedno, blokiranje ERK aktivacije u hipokampusu smanjuje dugoročno izumiranje. Stoga, naša trenutna opažanja ukazuju na ključnu ulogu hipokampusa u izumiranju pamćenja. Uzevši zajedno s našim prethodnim nalazima, predlažemo da je hipokampus potreban za izumiranje pamćenja, ali ne i za proces sličan konsolidaciji za stabilizaciju "pamćenja izumiranja" kroz aktivaciju ekspresije gena.